专利名称：贝类gⅰ型扎幌样病毒检测用的引物、探针、检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，具体涉及贝类GI型扎幌样病毒的检测。
背景技术：
扎幌样病毒(Sapporo-like viruses, SLVs)属于杯状病毒科，是引 起人类非菌性急性胃肠炎爆发和流行的重要因素之一，在很多国家均 有其爆发流行的相关报道，如日本、越南、泰国、美国和英国等，在 我国腹泻人群中也检测出GI和GII两种亚型的扎幌样病毒。目前 SLVs还不能进行组织培养，也未能建立合适的动物模型，它的基因 序列多变，样本中的病毒含量较低，不易被检测。扎幌样病毒可通过 粪口途径在家庭、医院、学校中爆发流行，也可通过人与人接触进行 传播。患者感染后，出现腹泻、呕吐和疼痛等症状。生食贝类等水产 品是引起扎幌样病毒感染的主要途径之一，因此如果对贝类等水产品 进行检测，并对感染的食品源头加以控制，对于保障人民健康有重要 意义。
发明内容
本发明的目的在于提供贝类GI型扎幌样病毒检测用的引物、探 针和试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种贝类GI型扎幌样病毒的检测方法。
本发明目的通过如下方案予以实现通过分析已报道扎幌样病毒 RNA多聚酶与衣壳蛋白的连接区域，分别设计引物和探针序列用于
实时荧光定量PCR。上游引物核苷酸序列(SLVs-FP)如SEQ ID NO:l 所示，下游引物核苷酸序列(SLVs-RP)如SEQIDNO:2所示(通用 核苷酸符号y=c or t; s=c or g; 产a or g; h=a, c or t; v=a, c or g); 与该引物配合使用的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示，且该 探针5，端标记有报告基团(如FAM、 VIC等)，3'端标记有荧光淬灭 基团(如TAMRA等)。以样本总RNA为模板，在50pL反应体系包 括5X荧光定量PCR缓冲液10|iL， lpLdNTPs(20ummol/L)， 1.5|iL 弓1物SLVs-RP (10ummol/L ) ， 1.5(iL弓1物SLVs隱FP (10ummol/L ) ， 1 荧光探针(10ummol/L)， 50 ng总RNA (3pL)， lpLTaq酶(3U)， 用DEPC处理水补充到50(iL，进行实时荧光定量PCR扩增，反应条 件是93°C， 3min; 93°C， 30s; 53°C， 40s共做40个循环。当探针 完整的时候，5'端报告基因所发射的荧光能量被3'端淬灭基团吸收， 仪器检测不到荧光信号。随着实时荧光定量PCR的进行，Taq酶在链 延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5'— 3'外切核酸酶活性就会 将探针切断，报告基因远离淬灭基团，其能量不能被吸收故发出的荧 光信号被仪器检测到，每个循环接收采集数据，故每经过一个PCR 循环，荧光信号随着目的片段的延伸有一个同步指数增长的过程，反 应结束后根据扩增曲线判定结果，从而实现对GI型扎幌样病毒的检 测和定量。也可用含有本发明引物和探针的试剂盒通过实时荧光定量PCR检测贝类GI型扎幌样病毒。
与现有技术相比，本发明具有如下优点本发明引物和探针特异 性好，制备成试剂盒用于贝类GI型扎幌样病毒的检测灵敏度、准确 性高；本发明检测方法可以快速直观判断样品是否含有GI型扎幌样 病毒，并能准确测定样品中GI型扎幌样病毒的拷贝数含量。
图1为实施例3中实时荧光定量PCR检测GI型扎幌样病毒的标 准曲线；
图2为实施例4中实时荧光定量PCR检测GI型扎幌样病毒的结 果，其中，l为贝类中GI型扎幌样病毒的实时荧光定量PCR扩增结 果，2为干净贝类中GI型扎幌样病毒的实时荧光定量PCR扩增结果， 3为贝类中诺瓦克样病毒阳性质粒的实时荧光定量PCR扩增结果；
图3为实施例5中实时荧光定量PCR检测GI型扎幌样病毒的灵 敏度实验，其中，1表示贝类中GI型扎幌样病毒的量为104考贝4iL， 2表示贝类中GI型扎幌样病毒的量为1()S拷贝/^iL， 3表示贝类中GI 型扎幌样病毒的量为104拷贝/^， 4表示贝类中GI型扎幌样病毒的 量为1()S拷贝4iL，5表示贝类中GI型扎幌样病毒的量为102拷贝/^， 6表示贝类中GI型扎幌样病毒的量为10拷贝/pL， 7为阴性对照。
具体实施例方式
- 下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但具体实施例并
不对本发明做任何限定。
实施例1引物及探针的设计和合成从GenBank下载GI型扎幌样病毒所有同源基因序列，引物和探 针由Invitrogen公司合成。根据与GI型扎幌样病毒标准株 (GenBankNo.X86560)的所有同源基因序列，用Bioedit软件进行同 源性比对，用primer Express3.0软件，设计出引物及TaqMan探针， 扩增目的片段长度为121bp。
上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示；
下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
与上述引物配合使用的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所 示。该探针5，端标记有报告FAM荧光染料，3，端标记有淬灭TAMRA 荧光染料。
实施例2总RNA的提取
提取步骤如下
1) 取20g污染了病毒的贝类胃、肠组织，加入20mL甘氨酸缓 冲液，匀浆器快速匀浆3min;
2) 取10mL匀浆液装于离心管中,室温下充分振荡后，4°C 6 000 r/min离心30min;
3) 调上清液pH至7. 5，加入等体积的8% PEG6000, 4。C沉淀4h 后，4 。C 6 000 r/min离心30min;
4) 弃上清，加入10mL pH9.0的PBS振荡；加入等体积氯仿， 充分混匀，4 °C 6 000r/min离心30min，弃去沉淀，保留上清液；
5) 调节上清液pH值至7.0，再用16。/。PEG6000 4'C沉淀2h后，4 °C 6 000 r/min离心30min;
6) 弃上清，加入lml的Trizol试剂提取RNA，反应管室温静置 5min，加入0.2ml氯仿，置4。C， 12000rpm离心15min;
7) 取上层水相的1/3体积转入灭菌离心管，加入等体积异丙醇， 置—20。C静置2h，然后4。C， 12000rpm离心15min，弃去上清；
8) 用lml含75。/。DEPC的乙醇洗涤沉淀，吹打混匀。置4"， 12000rpm离心5min。吸去大部分乙醇，空气干燥10min，加适量灭菌 DEPC双蒸水溶解沉淀，-7(TC保存。
实施例3 实时荧光定量PCR扩增方法的建立
1、 实时荧光定量PCR反应体系
以总RNA为模板，进行实时荧光定量PCR反应，即在5(VL反 应体系中含5X定量PCR缓冲液10pL， lpLdNTPs (20ummol/L)， 1.5juL弓l物SLVs画RP(10ummol/L)， 1.5pL引物SLVs隱FP( 10imimol/L)， lpL荧光探针(10ummol/L)， 50 ng总RNA(3pL)， lpLTaq酶(3U)， 并用DEPC处理水补充到50(iL。
2、 实时荧光定量PCR反应条件
将样品管放入ABI公司PE7000荧光PCR仪后，设置如下条件 进行93°C， 3min; 93°C， 30s; 53°C， 40s共做40个循环。每个循
环结束后采集数据。反应结束后根据扩增曲线和标准曲线判定结果。
3、 实时荧光定量PCR标准曲线的建立
将GI型扎幌样病毒121bp基因片段克隆到pcDNAII载体中构建成GI型SLVs的阳性质粒，调整质粒至lxlO"拷贝/(iL。然后以10 倍系列稀释的阳性质粒为定量阳性标准模板，建立GI型扎幌样病毒 的实时荧光定量PCR反应。结果显示在102 106拷贝范围内GI型扎 幌样病毒检测的标准曲线有很好的线性关系(图1)。 实施例4 GI型扎幌样病毒实时荧光定量PCR方法的特异性确定
以污染病毒的贝类总RNA为模板，以干净贝类、诺瓦克样病毒 阳性质粒为对照，通过实时荧光定量PCR检测荧光强度变化。结果 显示，以污染GI型扎幌样病毒的贝类总RNA为模板，通过实时荧光 定量PCR检测可观察到明显的荧光强度变化和很好的阳性扩增结果， 而干净贝类、诺瓦克样病毒阳性质粒的荧光强度没有变化。提示本发 明所建立的实时荧光定量PCR体系对GI型扎幌样病毒有很好的特异 性(图2)。
实施例5 灵敏度实验
用DEPC处理水分别稀释GI型扎幌样病毒阳性模板，以污染GI 型扎幌样病毒的贝类总RNA为模板，通过实时荧光定量PCR检测荧 光强度变化。实验结果显示，通过实时荧光定量PCR检测可观察到 明显的荧光强度变化和很好的阳性扩增结果，贝类中GI型扎幌样病 毒的实时荧光定量PCR动力学曲线显示，浓度在1(^拷贝以上的反应 体系有明显的荧光增长，而104考贝和阴性对照均无荧光增长，因此 该实时荧光定量PCR检测体系的最低检出限为102拷贝，即其灵敏度 为1()2拷贝4iL (图3)。贝类GI型扎幌样病毒检测用的引物、探针、检测方法及试剂盒 SEQUENCE LISTING
<110〉广东药学院
<120〉贝类GI型扎幌样病毒检测用的引物、探针、检测方法及试剂盒
<130〉
〈160> 3
<170〉 Patentln version 3.2
〈210〉 1
<211〉 21
<212〉 腿 <213〉人工序列
<400〉 1
tccaatgtcy ctgasgcaat a 21
〈210〉 2
〈211〉 21
<212〉 腿
〈213〉 人工序列
〈400〉 2
acgrgttaht gttgvgatga a
<210〉 3
<211> 26
〈212> DNA
<213〉 人工序列
〈400〉 3
acaggatgca cacgsgaact yt.tctt
权利要求
1.一种贝类GI型扎幌样病毒检测用的引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
2. —种贝类GI型扎幌样病毒检测用的探针，其特征在于该探针 与权利要求1所述引物配合使用。
3. 根据权利要求2所述的探针，其特征在于该探针的核苷酸序 列如SEQIDNO:3所示。
4. 根据权利要求3所述的探针，其特征在于该探针5'端标记有 报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
5. —种贝类GI型扎幌样病毒检测用的试剂盒，其特征在于该试 剂盒含有权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针。
6. —种贝类GI型扎幌样病毒的检测方法，其特征在于该方法是 以样品总RNA为模板，利用权利要求1所述的引物和权利要求2所 述的探针进行实时荧光定量PCR。
7. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于该方法是以样 品RNA为模板，建立如下反应体系 X荧光定量PCR缓冲液 10pL dNTPs lpL 10ummol/L上游引物 1.5pL 10ummol/L下游引物 1.5pL 10ummol/L探针 lpL总固A 3|iL3UTaq酶 lpL， 用DEPC处理水补充到50fiL，将该体系进行实时荧光定量PCR扩增， 根据扩增曲线判定样品是否含有贝类GI型扎幌样病毒。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于该方法的反应 条件是93°C， 3min; 93°C， 30s; 53°C， 40s，共做40个循环。
全文摘要
本发明公开了贝类GI型扎幌样病毒检测用的引物、探针、检测方法及试剂盒。本发明上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示；与该引物配合使用的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，且该探针5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，上述引物和探针可制备成试剂盒用于贝类GI型扎幌样病毒检测。本发明还公开了一种检测贝类GI型扎幌样病毒的方法，该方法是以样品总RNA为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光定量PCR扩增，根据扩增曲线判定样品中是否含有贝类GI型扎幌样病毒。本发明引物和探针特异性好，制备成试剂盒用于贝类GI型扎幌样病毒的检测灵敏度、准确性高；本发明检测方法可以快速直观判断样品是否含有GI型扎幌样病毒，并能准确测定样品中GI型扎幌样病毒的拷贝数含量。
文档编号G01N21/64GK101603095SQ200910040838
公开日2009年12月16日 申请日期2009年7月3日 优先权日2009年7月3日
发明者曾爱华, 朱家勇, 梅寒芳, 禇夫江, 金小宝, 艳 马 申请人:广东药学院