专利名称：乳清蛋白的活性凝胶电泳方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白电泳方法，具体的说，涉及一种乳清蛋白的活性凝胶电泳方法。
背景技术：
乳蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，其中酪蛋白含量约为
83%，乳清蛋白含量约为17。/。。乳清蛋白是指在乳品在pH4.6的酸性条件下仍然可溶的蛋白(酪蛋白沉淀)，主要由牛血清蛋白(BSA)、a-乳白蛋白(a-La)、 (3-乳球蛋白(卩-Lg)、免疫球蛋白、乳铁蛋白、过氧化物酶和溶菌酶等组成。为保证乳品的品质，乳产品都经过不同的热处理加工过程，在热处理过程中，乳品的各种物质发生明显的变化，其中乳清蛋白的变化尤为明显，乳清蛋白含量会随着加热温度和时间的增加不断减少，因此精准分析各种乳清蛋白含量，能够灵敏判断乳产品的加工工艺和质量状况，特别是能够准确判断出各种乳蛋白的含量，是 一 种可靠的辨别伪假乳蛋白的技术方法。
大量研究表明，在不同的热处理强度下，各种乳清蛋白表现出不同的耐热性。乳清球蛋白在6(TC以上开始展开，形成聚合物，各种乳清蛋白变性的温度如下卩-Lg, 77°C; a-La, 67。C;乳铁蛋白，65 ~93°C (根据不同铁含量而异)；BSA， 64°C; IgGl， 79.4°C; IgG2，76.7°C; IgM， 80.3°C;同时，乳清蛋白的变性温度受到 一系列因素的影响，如蛋白浓度、pH、溶剂和热处理时间。因此，乳清蛋白的变性成为衡量热处理程度的重要指标。
国际乳品基金会曾推荐把P-Lg作为不同热处理加工乳制品的分类指标；但同时有研究发现综合考察主要乳清蛋白的变化，将其作为一个总的评价指标更为有效。对于乳清蛋白组分的鉴定，不同分析方法的灵敏度、准确性、效
率各不相同。目前，用于分析乳品各种蛋白含量的主要方法有①SDS 或尿素丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳；②高效液相色谱，类型有
离子交换、疏水反应、凝胶过滤和反相色谱；③免疫方法和毛细管电 泳方法。这些方法都具有各自的优点，但所需设备费用昂贵，分析成 本高，技术性强，影响检测结果的因素多，而且免疫方法由于需要先 获得相应蛋白的抗体，所以在普通条件下通常难以实现，且重复性不 好；毛细管电泳方法还存在着样品吸收的问题；另外上述每一种方法 都不能全面概括热处理乳品乳清蛋白的变化，因此需要寻找 一 种能简 便、有效、全面的检测乳清蛋白变化的方法，以鉴定不同热处理方式
的乳品。
另外，乳品掺假行为屡禁不止，甚至由此引发了大头娃奶粉、三 聚氰胺奶粉的重大安全事件。用本发明所提出的乳清蛋白活性凝胶电 泳技术，不仅能够通过监测乳清蛋白发现这类伪劣乳品，也能够准确 检测出利用其它真蛋白(如大豆蛋白)造假的问题。
本发明釆用了一种基础、简单的活性凝胶电泳方法，全面追踪热 处理过程中的乳清蛋白变化，起到了有效的指示和鉴别作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳清蛋白的活性凝胶电泳方法。 本发明的另一目的是提供一种鉴定巿售乳品的方法。 本发明所述的乳清蛋白活性凝胶电泳方法，包括取样，样品制备、 活性凝胶电泳和数据处理分析。其中取样，样品制备和数据处理釆用 本领域的常规方法。
l)样品制备主要是指将乳品脱脂(如为脱脂乳，则直接去除 酪蛋白)，分离酪蛋白，得到乳清蛋白，包括i )将乳品在7500g 10000g 下离心12 20min脱脂；ii)用酸调整pH至4.6,静置12 20min后离心 除去酪蛋白，所得上清液即为乳清蛋白。调节pH所用酸为食品工业常用的盐酸、柠檬酸或乳酸等。
2) 活性凝胶电泳，包括
i)配置8 l"/。的分离胶(由试剂贮备液30% (w/v)丙烯酰胺-0.8。/o(w/v)甲叉双丙烯酰胺(A); 1.5 MTris-HCl,pH 8.8(B) ; 10%过硫酸铵(AP); N，N,N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)及去离子水配置)，4 6%浓缩胶(由试剂贮备液30%(w/v)丙烯酰胺-0.8% (w/v)甲叉双丙烯酰胺(A); 0.5M Tris-HCl, pH6.8 (C); 10%过硫酸铵(AP);N，N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)及去离子水配置)的活性丙烯酰胺凝胶，所有电泳材料中均不含有蛋白变性剂，如SDS等。
ii )将乳清蛋白与2倍活性蛋白上样缓冲液(0.1 MTris-HCl, pH6.8;
20%(v/v)甘油；0.01%溴酚蓝)以l: 3 5的比例混合后离心，根据
凝胶上样孔径的大小，上样量为7.5 12pL。
iii) 具体电泳条件参数为
电泳缓冲液Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3 );
上样量乳清蛋白2倍活性蛋白上样缓冲液=1:3 5,
7.5 12jiL;
电压75~150V; 25 75min;温度2 4°C。
iv) 电泳结東后进行快速考马斯亮蓝R250染色，染色后进行快速脱色。
其中，乳清蛋白样品与样品缓冲液混合后直接进行电泳分析，不需进行加热变性处理。
快速染色过程可由直接使用快速R250染色液实现，或对常规R250染色进行适度加热，15 20min即可完成染色过程。
一般， 一块凝胶可同时进行15个样品的检测。
3) 数据处理分析以乳清蛋白中的指示蛋白为对象，对凝胶进行凝胶成像分析，进行数据处理。根据该方法，可得到不同乳品的乳清蛋白图谱。
基于上述乳清蛋白的活性凝胶电泳方法，可将新鲜乳品用特定的热处理方式处理后进行活性凝胶电泳，得到标准图谱，与釆用相同热处理方式的巿售乳品的活性凝胶电泳图谱比较，判定巿售乳品的乳清蛋白的变化是否与标准品 一致，从而鉴定巿售乳品的品质。
本发明所述的鉴定巿售乳品的方法包括
1) 取样分别取巿售乳品(待测样品)和新鲜乳品(作为标准品)，根据巿售乳品的标识和/或相关的国家标准和行业标准，确定巿售乳品的热处理条件；
2) 样品制备
i) 将新鲜乳品脱脂后，根据巿售乳品的特定热处理条件(特定温度、时间、pH条件)进行热处理，分离酪蛋白，得到乳清蛋白标准品；
ii) 将巿售乳品(如为脱脂乳，则直接去除酪蛋白)脱脂，分离酪蛋白，得到乳清蛋白待测样品；
所述脱脂是将乳品在7500g 10000g下离心12 20min脱脂；所述分离酪蛋白是用酸调整pH至4.6，静置12 20min后离心除去酪蛋白；调节p H所用酸为食品工业常用的盐酸、柠檬酸或乳酸等。
3) 活性凝胶电泳
i) 制备8~12%的分离胶，4 6%浓缩胶的活性丙烯酰胺凝胶，所有电泳材料中均不含有蛋白变性剂，如SDS等。
ii) 将乳清蛋白与上述2倍活性蛋白上样缓冲液以1: 3 5的比例混合后离心，根据凝胶上样孔径的大小，上样量为7.5 12pL。
iii) 具体电泳条件参数为
电泳缓冲液Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3);
上样量乳清蛋白:上述2倍活性蛋白上样缓冲液=1:3~5，
7.5 12|iL;电压75V 150V， 25min ~ 75min;
温度2 4°C。
iv)电泳结束后进行快速考马斯亮蓝R250染色，染色后进行快速 脱色。
其中，乳清蛋白样品与样品缓冲液混合后直接进行电泳分析，不 需进行加热变性处理。
快速染色过程可由直接使用快速R250染色液实现，或对常规 R250染色进行适度加热，20min即可完成染色过程。
3)数据处理分析以乳清蛋白中的指示蛋白为对象，对凝胶进 行凝胶成像分析，并进行数据处理。
根据上述步骤，分别建立乳清蛋白标准品(与待测品相同热处理 工艺)的标准活性凝胶电泳图谱和待测品的活性凝胶电泳图谱，将图 谱与标准图谱比对，鉴定巿售乳品品质。
实验证明，利用本发明的方法，新鲜牛乳的活性凝胶电泳结果有 4条条带清晰、分离效果明显的乳清蛋白活性电泳条带，经切胶进行 SDS-丙烯酰胺凝胶电泳，根据Marker分子量和鲜乳乳清蛋白图谱鉴定 这4条活性电泳条带分别为牛血清蛋白(BSA)、 a-乳白蛋白(a-La)、 卩-乳球蛋白A (卩-LgA)和(3-乳球蛋白B ((3-LgB);而且这4条活性电 泳条带随着热处理温度、时间、pH的改变，呈现规律的变化。该特 点为鉴定乳制品产品品质提供了良好的实验基础。
当然，该方法也可用于鉴定未知热处理工艺的巿售乳品的热处理 条件。
本发明的优点在于
1) 样品用量少微量检测是实施热处理乳品鉴定检测的关键， 本技术只需要10!iL乳清蛋白，并可进行5次以上重复分析；另外，分 离的乳清蛋白可在-20°C长期保存而不影响分离结果。
2) 多个样品、多批样本可同时进行分离 一块凝胶可最多有15个样品同时进行分离， 一个电泳槽可最多有30个样品同时进行分离。配备多个垂直电泳装置，可实现多批样本的同时分离。
3) 活性电泳模式分辨度、灵敏性高，易于应用能够找到4条条带清晰、分离效果明显的乳清蛋白活性电泳条带，这4条活性电泳条带随着热处理温度、时间、pH的改变，呈现规律的变化。与相同电泳条件下的SDS凝胶电泳结果相比，分辨度、灵敏性均要高，而无需对样品进行上样前的还原。
4) 重复性好利用上述活性凝胶电泳方法可以获得较好的重复性分离，重复间迁移率和蛋白含量没有明显变化，无条带拖尾现象。
5) 分析成本低分析设备使用的是最普通的垂直电泳装置，可同时配备多个，部分使用试剂可适当回收利用。
本发明利用乳清蛋白电泳条带随热处理条件的变化，可精准分析各种乳清蛋白含量，能够灵敏判断乳品的加工工艺和质量状况，是一种可靠的辨别伪假乳蛋白的技术方法；根据该方法，可建立乳品乳清蛋白的标准活性蛋白变化图谱，鉴定不同热处理乳品的真伪，进而形成对于不同热处理加工乳制品品质的直观、方便、灵敏、准确的鉴定体系；由于活性电泳条带非常清晰，对于只有一个氨基酸差别的卩-乳球蛋白变异体A和B具有明显的分离效果，可用于奶牛个体遗传特性差异的鉴定。
图l:相同样品的活性凝胶电泳与SDS凝胶电泳比较，图中所示样品分别为鲜乳乳清蛋白、65tV30min热处理牛乳乳清蛋白、85。C/20s热处理牛乳乳清蛋白、-80°。冷冻牛乳乳清蛋白、巿售UHT(超高温
瞬时加热)鲜乳乳清蛋白。
图2:不同加热温度的热处理牛乳乳清蛋白的活性凝胶电泳图谱。加热时间为10min 。
图3:不同加热时间的热处理牛乳乳清蛋白的活性凝胶电泳图谱。
9加热温度为85。C。
图4:不同pH的热处理牛乳乳清蛋白的活性凝胶电泳图谱。加热强度为85。C/15min, pH梯度为3.0、 5.0、 6.7、 7.0，其中6.7为鲜乳的原始pH。
图5:不同热处理方式巿售鲜乳乳清蛋白的活性凝胶电泳鉴定图谱。所选择的样品分别是三元脱脂巴氏乳(巴氏l)、三元加钩巴氏乳(巴氏2)和三种不同品牌(伊利、蒙牛、光明)的超高温瞬时加热鲜乳。
具体实施例方式
实施例l活性凝胶电泳图谱与SDS凝胶电泳电泳比较
取新鲜的牛乳和巿售UHT鲜牛奶，在4X: 8500g下离心15min脱脂，均匀分装，分为活性凝胶电泳组和SDS凝胶电泳组，将上述两组的新鲜牛乳样品(巿售鲜UHT牛奶不进行热处理)分别按照下述工艺进行热处理l)不进行热处理；2) 65°C/30min; 3 ) 85°C/20s; 4)-80°C冷冻24h处理，将热处理后的样品冷却至室温。
将所有样品用6。/。乳酸将pH调至4.6，静置15min后4°C 8500g下离心15min除去酪蛋白，得到乳清蛋白，将乳清蛋白于-2(TC储存备用。
制备分离胶为12%、浓缩胶为4。/。的SDS聚丙烯酰胺凝胶。先制备5mL12。/。的分离胶(30% (w/v)丙烯酰胺-0.8% (w/v)甲叉双丙烯酰胺(A液)2mL; 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8,含0.5。/。十二烷基硫酸钠(SDS) (B液)，1.25 mL;去离子水，1.75 mL; 10%过硫酸铵(AP), 50//L;N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED), 10〃L)，过30min等分离胶凝固以后再制备SmL 4%的浓缩胶(30% (w/v)丙烯酰胺-0.8% (w/v)甲叉双丙烯酰胺(A液)，0.265mL; 0.5 M Tris-HCl， pi-I 6.8,含0.5。/。SDS十二烷基硫酸钠(C液)，0.5 mL;去离子水，1.235 mL; 10%过硫酸铵(AP), 20〃L; N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMEI))， 10//L)。将SDS凝胶电泳组的乳清蛋白样品与2倍活性蛋白上样缓冲液(0.1 M Tris-HCl, pH6.8;20。/。(v/v)甘油;2。/。(v/v)SDS;5。/o(v/v)"-巯基乙醇;0.01%溴酚蓝)以l: 3的比例混合后离心，上样7.5iaL。具体电泳条件参数为
电泳缓冲液Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3);
电压75V， 25min; 150V, 45min;
温度4°C。
在设定的条件下完成电泳后,将凝胶进行快速考马斯亮蓝R250染色及快速脱色。最后利用凝胶成像分析系统，制成牛乳乳清蛋白的SDS凝胶电泳图谱(见图l-l)。
制备分离胶为10%、浓缩胶为5%的活性丙烯酰胺凝胶。将活性凝胶电泳组的乳清蛋白样品与2倍活性蛋白上样缓冲液以1: 4的比例混合后离心，上样10pL。
以上述同样的电泳条件参数进行电泳70min，将凝胶进行快速考马斯亮蓝R250染色及快速脱色。最后利用凝胶成像分析系统，制成牛乳乳清蛋白的活性凝胶电泳图谱(见图1 -2 )。
图1 - 2的活性凝胶电泳图谱中的四条乳清蛋白分别为牛血清蛋白(BSA)、 ot-乳白蛋白U-La)、 (3-乳球蛋白A (P-LgA)和卩-乳球蛋白B(卩-LgB)，显然，乳清蛋白的分离效果明显，条带清晰，随热处理条件的不同，各条带都有明显的变化；而图1-1的SDS凝胶电泳图谱中的条带虽然清晰，但P-LgA和P-LgB分离效果较差，而且各条带(BSA、 a-La、 (3-LgA和(3-LgB )随热处理条件的变化非常不明显，并且SDS电泳图谱中的条带较多，干扰因素较多，很难用于鉴定乳品品质和判定热处理条件。
实施例2不同加热温度，加热时间，pH值下的热处理牛乳乳清蛋白的活性凝胶电泳图谱
1)不同加热温度，相同加热时间的热处理牛乳乳清蛋白的活性新鲜的牛乳在4'C 8500g下离心15min脱脂，均匀分装，分别在65"C、 75°C、 85°C、 95°C、 IO(TC进行加热，加热时间为10min，加热后样品进行迅速冷却。冷却至室温后，用2。/。盐酸将pH调至4.6,静置15min后4i: 10000g下离心15min除去酪蛋白，所得上清液即为乳清蛋白。将乳清蛋白分装于-2(TC储存备用。
制备分离胶为8%、浓缩胶为4%的活性丙烯酰胺凝胶。将乳清蛋白样品与2倍活性蛋白上样缓冲液(0.1 M Tris-HCl， pH6.8; 20% (v/v)甘油；0.01%溴酚蓝)以l: 3的比例混合后离心，上样10pL。具体电泳条件参数为
电泳缓冲液Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3);
电压75V， 30min; 120V， 40min;
温度 2 C o
在设定的条件下进行电泳70min后,将凝胶进行快速考马斯亮蓝R250染色及快速脱色。最后利用凝胶成像分析系统，制成不同加热温度、相同加热时间的热处理牛乳乳清蛋白的活性凝胶电泳图谱(见图2)。
实验结果证明，随着热处理温度的提高，活性凝胶电泳图谱中的条带都有明显的变化，对热处理温度最为敏感的是牛血清蛋白(BSA)条带，其次是(3-LgA和(3-LgB条带，而oc-La条带随热处理温度的变化较小。
2)相同加热温度，不同加热时间的热处理牛乳乳清蛋白的活性
新鲜的牛乳在4匸7500g下离心20min脱脂，均匀分装，在85。C、加热，加热时间为5min， 10min， 20min和30min，加热后样品进行迅速冷却。冷却至室温后，用2。/。盐酸将pH调至4.6，静置15min后4。C8000g下离心20min除去酪蛋白，所得上清液即为乳清蛋白。将乳清蛋白置于-2(TC储存备用。
制备分离胶为8%、浓缩胶为4%的活性丙烯酰胺凝胶。将乳清蛋白样品与活性蛋白上样缓冲液以l: 3的比例混合后离心，上样10pL。
在上述设定的条件下进行电泳70min后,将凝胶进行快速考马斯亮蓝R250染色及快速脱色。最后利用凝胶成像分析系统，制成相同加热温度、不同加热时间的热处理牛乳乳清蛋白的活性凝胶电泳图谱(见图3)。
实验结果证明，随着热处理时间的延长，活性凝胶电泳图谱中的条带都有明显的变化，对热处理时间最为敏感的是牛血清蛋白(BSA)条带，其次是P-LgA和(3-LgB条带，而a-La条带随热处理时间的变化较小，但显然加热时间增加到20min，牛乳乳清蛋白中的大部分活性蛋白就已经灭活。
3 )不同pH的热处理牛乳乳清蛋白的活性凝胶电泳图谱
取新鲜牛乳，以上述相同方式脱脂，均匀分装，分为两组，用5c/。的柠檬酸调整pH值，分别为3.0、 5.0、 6.7、 7.0,其中6.7为鲜乳的原始酸度(未加柠檬酸)， 一组在85。C加热15min，另一组在75。C加热15min，加热后样品进行迅速冷却至室温。然后将两组样品都用2%盐酸将pH调至4.6,静置15min后4。C8500g下离心15min除去酪蛋白，所得上清液即为乳清蛋白。将乳清蛋白分装于-2(TC储存备用。
用以上述相同方式进行活性丙烯酰胺凝胶电泳，最后利用凝胶成像分析系统，得到相同加热温度、加热时间，不同酸度热处理的牛乳乳清蛋白的活性凝胶电泳图谱(见图4)。
实验结果证明，在75。C加热处理15min的样品中的乳清蛋白对酸度的敏感度小于在85"C加热处理15min的样品。显然，牛乳热处理方式中的酸度的变化对乳清蛋白有 一 定影响。
以上图谱说明了热处理方式温度，时间和酸度对乳清蛋白的影响，显然本发明的活性电泳方法非常适于判定不同乳品的热处理方式
13和鉴定巿售热处理乳品的品质。
实施例3不同加热温度、不同加热时间的热处理牛乳乳清蛋白的活 性凝胶电泳鉴定
新鲜的牛乳在4'C 8500g下离心15min脱脂，均匀分装进行65。C、 75°C、 85°C、 95°C、 IO(TC加热，每一个温度又分为不同的加热时间 梯度，分别为5、 10、 20、 30min。加热后样品进行迅速冷却。冷却至 室温后，用6。/。乳酸将pH调至4.6,静置15min后4。C8500g下离心15min
除去酪蛋白，所得上清液即为乳清蛋白。将乳清蛋白分装于-20。C储
存备用。
制备分离胶为10%、浓缩胶为4%的活性丙烯酰胺凝胶。将乳清 蛋白样品与活性蛋白上样缓冲液以1: 3的比例混合后离心，上样12pL。 具体电泳条件参数为
电泳缓冲液Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3);
电压120V， 60min;
温度 2 C 。
在设定的条件下进行电泳60min后，将凝胶进行快速考马斯亮蓝 R250染色及快速脱色。最后利用凝胶成像分析系统，制成不同加热 温度、加热时间的热处理牛乳乳清蛋白的活性凝胶电泳图谱。
实施例4不同pH,不同温度热处理的牛乳乳清蛋白的活性凝胶电泳 图谱鉴定
新鲜的牛乳在4t: 8500g下离心12min脱脂，均匀分装后，将样品 的pH分别调整到3.0、 5.0、 6.7、 7.0，进行不同温度(65°C、 75。C、 85°C、 95°C、 100°C )的加热15min。加热后样品进行迅速冷却。冷却 至室温后'，用6。/。乳酸将pH调至4.6，静置15min后于4。C8500g条件下离 心12min除去酪蛋白，所得上清液即为乳清蛋白。将乳清蛋白分装于 -2(TC储存备用。
制备分离胶为10%、浓缩胶为4%的活性丙烯酰胺凝胶。将乳清蛋白样品与活性蛋白上样缓冲液以l: 3的比例混合后离心，上样 7.5|iL。电泳条件
电泳缓冲液Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3 );
电压100V， 25min; 150V, 40min;
温度2°C。
在设定的条件下进行电泳65min后,将凝胶进行快速考马斯亮蓝 R250染色及快速脱色。最后利用凝胶成像分析系统，制成不同pH的 热处理牛乳乳清蛋白的活性凝胶电泳图谱。
实施例5不同热处理方式加工的巿售鲜乳乳清蛋白的活性凝胶电泳 鉴定
所选择的样品分别是三元脱脂巴氏乳(巴氏i)、三元加4丐巴氏乳
(巴氏2)和三种不同品牌(伊利、蒙牛、光明)的超高温瞬时加热 鲜乳。
不同热处理方式加工的巿售鲜乳在4i:8500g下离心15min脱脂， 用10。/。乳酸将pH调至4.6，静置15min后于4"8500g条件下离心15min
除去酪蛋白，所得上清液即为乳清蛋白。将乳清蛋白分装于-2(TC储
存备用。
制备分离胶为10%、浓缩胶为4%的活性丙烯酰胺凝胶。将乳清 蛋白样品与活性蛋白上样缓冲液以l: 3的比例混合后离心，上样 7.5pL，以新鲜牛乳乳清蛋白为对照。具体电泳条件参数为
电泳缓冲液Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3);
电压75V， 25min; 150V， 75min;
温度3°C。
在设定的条件下进行电泳70min后，将凝胶进行快速考马斯亮蓝 R250染色及快速脱色。最后利用凝胶成像分析系统，制成不同热处 理方式加工的巿售鲜乳乳清蛋白的活性凝胶电泳鉴定图谱(见图5 )。
显然根据本发明的活性凝胶电泳方法得到的巿售的乳清蛋白活性电泳图谱可明显区别不同产品的加热方式，为根据标准图谱鉴定产 品的热处理方式提供了理论基础。
权利要求
1、一种乳清蛋白的活性凝胶电泳方法，包括样品制备、活性凝胶电泳和数据处理分析，其特征在于，所述活性凝胶电泳的丙烯酰胺凝胶分离胶的浓度为8～12％，所有电泳材料中均不含有蛋白变性剂；具体电泳条件参数为电泳缓冲液pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液；上样量乳清蛋白2倍活性蛋白样品缓冲液＝1∶3～5，7.5～12μL；电压75～150V；时间25～75min；温度2～4℃。
2、 如权利要求1所述的乳清蛋白的活性凝胶电泳方法，其特征 在于，乳清蛋白样品与样品缓冲液混合后直接进行电泳分析，不需进 行加热变性处理。
3、 如权利要求1或2所述的活性凝胶电泳方法，其特征在于，所 述活性凝胶电泳的丙烯酰胺凝胶浓缩胶的浓度为4 6 % 。
4、 如权利要求1或3所述的活性凝胶电泳方法，其特征在于，所 述活性凝胶电泳步骤还包括将凝胶进行快速考马斯亮蓝R250染色， 染色后再进行快速脱色。
5、 如权利要求1所述的活性凝胶电泳方法，其特征在于，所述 样品制备主要是指将乳品脱脂，分离酪蛋白，得到乳清蛋白。
6、 如权利要求5所述的活性凝胶电泳方法，其特征在于，所述 脱脂是将乳品在7500g 10000g下离心12 20min;所述分离酪蛋白是 用酸调整乳品的pH至4.6，静置12 20min后离心除去酪蛋白。
7、 如权利要求6所述的活性凝胶电泳方法，其特征在于，所述 酸为盐酸、杼檬酸或乳酸中的一种或多种。
8、 一种鉴定巿售乳品的品质的方法，其特征在于，取新鲜乳品和巿售乳品，将新鲜乳品用与巿售乳品相同的热处理方式处理，将热 处理后新鲜乳品和巿售乳品进行样品处理，然后进行权利要求1所述 的活性凝胶电泳，得到电泳图谱，比较图谱，鉴定巿售乳品的品质。
9、 一种鉴定乳品的热处理方式的方法，其特征在于，将待测乳 品进行样品处理和活性凝胶电泳，根据经不同热处理方式的新鲜乳品 的活性凝胶电泳标准图谱，判定待测乳品的热处理方式。
全文摘要
本发明涉及一种乳清蛋白的活性凝胶电泳方法，该方法利用活性丙烯酰胺凝胶，在下述条件下将乳清蛋白样品与缓冲液混合后直接进行电泳分析电泳缓冲液pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液；上样量乳清蛋白∶2倍活性蛋白样品缓冲液＝1∶3～5，7.5μL；电压75～150V；25～75min；温度2～4℃。本发明的活性电泳方法样品用量少，分辨度、灵敏性高，重复性好；可精准分析各种乳清蛋白含量，灵敏判断乳品的加工工艺和质量状况。
文档编号G01N27/447GK101477079SQ20091007651
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月6日 优先权日2009年1月6日
发明者姜微波, 林素菊 申请人:中国农业大学