专利名称：鼻咽癌的分子诊断剂和治疗剂、试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鼻咽癌的分子诊断和/或治疗方法，更具体而言，涉及经由新药物靶 标(表皮生长因子受体(EGFR)和/或核转录因子-kB (NF- k B))来诊断和/或治疗鼻咽 癌的方法、试剂、药物组合物、试剂盒和它们的应用。该新药物靶标可以用于诊断和/或治 疗鼻咽癌、评价鼻咽癌的进展程度和/或治疗的有效性以及鉴定治疗鼻咽癌的化合物。
背景技术：
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)是人疱疹病毒家族中的一员，可以感染大多 数的人。该病毒与许多恶性肿瘤有关，鼻咽癌是最严重的EB病毒相关上皮癌。EB病毒基因 组可见于所有鼻咽癌病例中，然而，在大多数鼻咽癌病例中EB病毒编码蛋白的表达却只有 EB病毒核蛋白l(EBNA 1)和潜在膜蛋白l(LMP-l)上。表皮细胞中LMP-1的表达可以诱导 表皮生长因子受体(EGFR)的表达。
EB病毒引发的疾病 EB病毒属于疱疹病毒家族，是一种非常常见的引起人类疾病的病毒。在全球人 群范围内感染率可达90% (Niederman， J. ， Evans， A. ， Subrahmanyan， L. ， and McCollum， R. (1970). Prevalence, incidence andpersistence of EB virus antibody in young adults. N Engl J Med 282,361-365.)。 EB病毒感染在欠发达国家的少年儿童中更为普 遍。在发达国家，EB病毒感染主要在青少年中，感染往往会引起一些有明显症状的疾病如 传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis)，该病主要伴随症状有发热、咽喉 痛、淋巴肿大、肝脾肿大和易疲劳(Evans， A. ， Niederman， J. ， and McCollum， R. (1968). Sero印idemiologic studies of infectiousmono皿cleosis with EB virus. N Engl J Med 279,1121-1127.)。 一旦感染，EB病毒将会以潜伏态终生存在于被感染个体中。潜伏 态病毒被认为在EV病毒相关的人类恶性肿瘤发展中起重要作用，这些恶性肿瘤包括鼻咽 癌(鼻咽癌)、Burkitt' s淋巴癌、移植后淋巴组织增生淋巴瘤、Hodgkin' s病、艾滋病相 关的非Hodgkin' s淋巴癌，胸腺癌、肺癌、胃癌和乳腺癌。(Okano，M. (1998) Epstein-Barr virus infection and its role in the expanding spectrumof human diseases. Acta Paediatr. 87，11-18.) 鼻咽癌- 一种EB病毒相关的上皮癌 鼻咽癌是最严重的EB病毒相关上皮癌。在美国和欧洲的高加索人种中，鼻咽癌在 全世界的平均的发病率约为0.001%，在东南亚和中国南部地区为0.02% (该地区鼻咽癌 发病率占所有癌症的20% )，在香港为O. 025% ，在北非为0.008% (Raab-Traub，N. (1992). Epstein_Barr virus andnasopharyngeal carcinoma. Semin Cancer Biol 3，297-307.)。 无论其地理起源如何，鼻咽癌总是与EB病毒相关。EB病毒基因组可见于所有鼻咽癌病例 中，然而，在大多数鼻咽癌病例中EB病毒编码蛋白的表达却只有EB病毒核蛋白l(EBNA 1) 和潜在膜蛋白1 (LMP-1)上[Chen，M. ，Tsai，C. ， Liang， C. ， Shu， C. ，Huang，C. ，Sulitzea皿， D. ， Liu， S. ， and Chang， Y. (1992). Cloning and characterization of the latentmembrane protein (XMP)of ^specific Epstein-Barr virus variant derived from thenasopharyngeal carcinomain the Taiwanese population. Oncogene 7，2131—2140.;Fahraeus， R. ， Fu， H. ， Ernberg， I. ， Finke， J. ， Rowe， M. ， Klein， G. ， Falk， K. ， Nilsson， E.，Yadav，M. ，and Busson，P. (1988). Expression of Epstein_Barr virus-encoded proteinsi丽sopharyngeal carcinoma. Int J Cancer 42， 329-338.]。虽然EB病毒与鼻咽癌的相关性非常明确，但EB病毒介导的鼻咽癌的形成机制仍有待阐明。
鼻咽癌的分类 世界卫生组织(WHO)将鼻咽癌分为三个主要亚型(Pizzo P. A. andPoplockA. G. (1997) Principles and Practice of Pediatric Oncology丄ippincott-RavenPublishers, Philad印hia，PA， 3rd Edition.) 。 I类为鳞状细胞癌，这种癌症主要影响成年人，并且与EB病毒没有明显的相关性。II类和III类总是与EB病毒相关，分别为无角化的(non-keratinizing)和未分化(undifferentiated)的鼻咽癌。肿瘤一般是局部扩散，经常向颈部淋巴节转移。远距离的肿瘤转移位点包括心脏、肺脏、肝脏和骨头。鼻咽癌的发展可划分为T0-T4五个阶段，可用于估计病变的预后[Pizzo P. A. andPoplock A. G. (1997)Principles and Practice of Pediatric Oncology. Lippincott—Raven Publishers,Philad印hia， PA，3rd Edition. ] 。 TO阶段表明没有肿瘤的证据，Tls表示为原位癌，Tl表示癌仅存在于鼻咽的某一位置或是只有通过活检才能发现，T2包括有两个位点的肿瘤，分别为上后方壁和外侧壁，T3包括那些已经扩散到鼻腔或是口咽腔的癌，T4包括那些已经侵入到颅内或(和)颅神经的癌。T1/T2阶段可以预测54X-87X的存活率，然而诊断为T3/T4阶段的肿瘤，其存活率相当低，仅为8 % -37 % 。
鼻咽癌的现有治疗方法 目前鼻咽癌主要通过放射疗法来治疗[Pizzo P.A.and Poplock A. G. (1997)Principles and Practice of Pediatric Oncology. Lippincott—RavenPublishers，Philad印hia， PA，3rd Edition.]。手术方法在鼻咽癌的治疗中价值不大，这是因为鼻咽部位难进行手术操作，并且当诊断出的时候，肿瘤往往以近扩散。化疗一般作为放疗的辅助手段，通常使用的因子有顺氯氨铂(cisplatin)、长春新碱(vincristine)、氨甲喋呤(methotrexate) 、5_氟尿嘧啶(5_fluo丽racil)禾口争光霉素(bleomycin)等。虽然放疗对于鼻咽癌治疗有一定作用，但是同时也有很多副作用。口腔干燥是个重要的副作用，考虑到化疗的位置，出现这个副作用并不奇怪。放疗也会引起多种粘膜炎，这就迫使必须给病人安置胃管来避免从口腔进食，这种情况会在放疗后的化疗过程中变得愈加严重。其他不良效应还有颈纤维化(neck fibrosis)、牙关紧闭症(trismus)、颅神经麻痹(cranial nervepalsies)、壁神经丛衰弱(brachialplexus weakness)、肌妻缩(muscular atrophy)、甲状腺功會g减退(hypothyroidism)禾口卢页面损毁(craniofacial disfigurement)。这些副作用对于儿童来说是非常严重的，因为一旦被放射照射，面部骨骼将不会再显著生长。化疗的副作用也不可忽视，其中主要包括慢性肾功能不全(chronicrenal insufficiency)、不孕不育症(sterility)、月市纤维化(pulmonary fibrosis)禾口夕卜周神经病变(peripheralneuropathy)。并且会导致中性粒细胞减少症(neutropenia)、严重感染(severeinfections)，有时候甚至是死亡。用干扰素(interferon)和阿昔洛维(acyclovir)等非特异因子治疗也未能取得很大成功。因此，我们需要新的、有效的鼻咽癌治疗方法，即利用EB病毒及其特异性的蛋白、耙点和它们的终产物来进行位点特异的抑制性治疗和随后的疾 病发展监控。
发明内容
本发明人最近的研究表明，鼻咽癌的发生可能由EGFR的上调表达并激活NF-k B 而引起的。EGFR的上调表达和NF-k B的激活提供了一个很强的细胞增殖和成活的信号，因 此可以使用EGFR和NF- k B作为鼻咽癌诊断标记分子，并且可以使用EGFR和(或)NF- k B 的对抗物来治疗EBV引发的鼻咽癌。
具体地，本发明提供以下各项 1.试剂在制备检测鼻咽癌的诊断剂中的应用，所述试剂用于对生物体样品中的表 皮生长因子受体(EGFR)或核转录因子-KB(NF-KB)的表达或活性进行测定。
在一个实施方案中，本发明还提供一种组合试剂在制备检测鼻咽癌的诊断剂中 的应用，所述组合试剂包括用于对生物体样品中的表皮生长因子受体(EGFR)或核转录因 子-k B (NF- k B)的表达或活性进行测定的试剂和另一种检测EB病毒(EBV)的试剂(如针 对LMP-1或EBER的抗体)。 2.试剂在制备用于评价鼻咽癌的进展程度和/或治疗的有效性的诊断剂 中的应用，所述试剂用于对生物体样品中的表皮生长因子受体(EGFR)或核转录因 子-k B (NF- k B)的表达或活性进行测定。在一个实施方案中，所述生物体样品来自已经确 诊患有鼻咽癌的患者。 3. —种用于检测鼻咽癌的试剂盒，其含有 用于对生物体样品中的表皮生长因子受体(EGFR)或核转录因子-k B(NF-k B)的 表达或活性进行测定的试剂。在一个实施方案中，所述试剂盒还含有另一种检测EB病毒 (EBV)的试剂(如针对LMP-1或EBER的抗体)。 4. —种用于评价鼻咽癌的进展程度和/或治疗的有效性的试剂盒，其中，含有
用于对生物体样品中的表皮生长因子受体(EGFR)或核转录因子-k B(NF-k B)的 表达或活性进行测定的试剂。在一个实施方案中，所述生物体样品来自已经确诊患有鼻咽 癌的患者。在一个实施方案中，所述试剂盒还含有另一种检测EB病毒(EBV)的试剂(如针 对LMP-1或EBER的抗体，或用于检测它们的其它任何试剂)。 5. —种治疗鼻咽癌的药物组合物，其含有抑制表皮生长因子受体(EGFR)和/ 或核转录因子-KB(NF-KB)的表达或活性的物质作为有效成分；和药用载体，优选所述 药物组合物同时含有抑制表皮生长因子受体(EGFR)的表达或活性的物质和抑制核转录因 子-k B (NF- k B)的表达或活性的物质作为有效成分。 6.根据以上5的药物组合物，其还含有另一种用于治疗鼻咽癌的活性成分，优选 为化学治疗剂，如肿瘤坏死因子(TNF)、阿霉素(ADR)、表鬼臼毒(VP-16)、顺氯氨铂(CDDP)、 长春新碱、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶和争光霉素。 7.抑制表皮生长因子受体(EGFR)和/或核转录因子_ k B (NF_ k B)的表达或活性 的物质在制备用于治疗鼻咽癌的药物中的应用。 8.根据以上7的应用，其中所述药物还含有另一种用于治疗鼻咽癌的活性成分， 优选为化学治疗剂，如肿瘤坏死因子(TNF)、阿霉素(ADR)、表鬼臼毒(VP-16)、顺氯氨铂
5(CDDP)、长春新碱、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶和争光霉素。 9. —种用于治疗鼻咽癌的试剂盒，其含有抑制表皮生长因子受体(EGFR)和/或核转录因子-k B(NF-k B)的表达或活性的物质，优选该试剂盒还含有另一种用于治疗鼻咽癌的活性成分，优选为化学治疗剂，如肿瘤坏死因子(TNF)、阿霉素(ADR)、表鬼臼毒(VP-16)、顺氯氨铂(CDDP)、长春新碱、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶和争光霉素。
10. —种鉴定治疗鼻咽癌的化合物的方法，所述方法包括 a.提供表达表皮生长因子受体(EGFR)和/或核转录因子_ k B (NF_ k B)的细胞；
b.将所述化合物与所述细胞温育；禾口 c.检测细胞中表皮生长因子受体(EGFR)和/或核转录因子_ k B (NF_ k B)的表达或活性是否被所述化合物抑制。 应当指出，本发明所列举的各实施方案和技术方案根据需要可以进行任意组合。
发明详述 EGFR作为鼻咽癌治疗的靶点 表皮生长因子受体(Epidermal growth factor rec印tor，EGFR)及其家族成员与细胞生长控制异常有重要关系[Khazaie， K. ， Schirrmacher， V. ， andLichtner， R. (1993).EGF receptor in neoplasia and metastasis. CancerMetastasis Rev 12，255-274.]。这个家族属于受体酪氨酸激酶，有四个家族成员，分别为EGFR、 Neu、 ErbB-3和ErbB_4。 EGFR与其相应配体的结合可以导致其形成受体二聚体并自体磷酸化，磷酸化将会引发一个信号及联事件，这一事件又会激活促分裂原活化蛋白激酶活性(mitogen activatingproteinkinases, MAPK)。虽然EGFR家族成员在正常细胞生长中必不可少，但是该蛋白家族成员的过量表达在上皮癌中也被发现。例如，在超过30-35 %的人类乳腺癌中会过量表达一个或多个EGFR家方矣成员[Shackney， S. ， Pollice， A. ， Smith, C. ， Janocko， L ， Sweeney, L ， Brown，K. ，Singh，S. ，Gu丄，Yakulis，R. ， and Uicke，J. (1998). Intracellular coexpression ofepidermalgrowth factor rec印tor， Her_2/neu， and p21ras in human breast cancers :evidence for the existence of distinctive patterns of genetic evolution thatarecommon to tumors from different patients. Clin Cancer Res4，913-928. ] 。EGFR最近也被用做癌症的治疗革巴点[Baselga， J. ， Tripathy， D. ， Mendelsohn, J. ， Baughman， S.，Benz， C. ， Dantis， L. ， Sklarin， N. ， Seidman， A. ， Hudis， C. ， Moore， J. ， Rosen， P. ， Twaddell，T. ， Henderson, I. ， and Norton, L (1996). PhaseII study of weekly intravenousrecombinant humanized anti-p 185HER2monoclonal antibody in patients with HER2/neu_overexpressing metastaticbreast cancer. J Clin Oncol 14， 737—744. 5Pegr咖，M. ， Lipton， A. ， Hayes， D. ， Weber， B. ， Baselga， J. ， Tripathy， D. ， Baly， D. ， Baughman， S.，Twaddell， T. ， Glaspy， J. ， and Slamon， D. (1998). Phase II study of rec印tor-enhancedchemosensitivity using recombinant humanized anti_p 185HER2/neumonoclonalantibody plus cisplatin in patients with HER2/neu_overexpressingmetastaticbreast cancer refractory to chemotherapy treatment. J Clin Oncol 16，2659-2671. ] 。 Herc印tin， 一个可以特异性阻断Her2/neu的人化单克隆抗体，已经在UCLADermis Slamon的实验室发展出来，并且成功的应用于治疗一个特殊的乳腺癌病人亚群，这个亚群的乳腺癌表达Her2/neu基因。由于EGFR被LMP-1强烈诱导，而且在鼻咽癌细胞中表达，并且被认为在肿瘤发生中起非常重要作用，我们提议用EGFR作为我们治疗鼻咽癌的一个靶点。 NF- k B-鼻咽癌治疗的又一个耙点 LMP-1可强烈激活NF-k B信号转导途径，这一途径可能在鼻咽癌发生过程中起重要作用。NF-kB是由Rel蛋白家族成员形成的异聚或同聚二聚体，该蛋白家族主要包括p50， p52、 rel-A(p65)， rel-B和c-Rel。它作为一个转录因子行使功能，可以许多个不同基因的表达。这些基因涉及急性期反应、炎症、淋巴细胞活化、细胞生长和分化[Grilli， M. ， Chiu， J.J. ， andLenardo， M. (1993).NF_kB and Rel -Participants in aMultiformTranscriptional Regulatory System. International Review of Cytology143， 1-60] 。 NF- k B的活性通常被其抑制物I k B所调节。在许多细胞类型中，NF- k B定位于细胞质，以无活性的NF-k B/I k B复合体形式存在。许多种类的剌激信号可以激活NF-k B，包括病毒、细菌脂多糖、抗原受体衔接物、应激因素、细胞因子、巴豆油酯、氧化剂和紫外辐射。通过这些因子激活NF- k B需要I k B的磷酸化以及随后的降解过程，这样NF- k B就可以易位进入细胞核。最近研究表明NF-KB具有强的抗细胞凋亡活性。通常状况下，细胞抵抗TNF诱导的细胞凋亡，而对于如NF- k B这样的NF- k B抑制物的存在变得敏感。研究表明当3T3细胞中NF- k B的活性被抑制时，组成性活性的Ras会杀死这些3T3细胞而不是转化细胞，这就暗示NF-k B的抗凋亡功能在细胞转化中起重要作用。如我们初步结果所示，我们发现NF- k B保护HaCaT细胞免于凋亡并且上调Al基因的表达，A1基因是Bcl_2基因家族的一员，与抗凋亡和细胞转化有关。
图1. EBV诱导鼻咽癌的作用模型以及可能的治疗策略； 图2.鼻咽癌中Bcl-x， EGFR和EBER的表达(用Bcl-x， EGFR或EBER-1特异性抗体染色鼻咽癌相邻肿瘤组织切片)； 图3.抑制NF-k B可以促进TNF诱导的细胞凋亡(在标示的时间用50ng/ml的TNF- a处理亲本HeCaT和A549细胞及其衍生的能过度表达DA_I k B的克隆细胞。使用凝胶转移发现细胞核提取物结合NF- k B特异性探针的活性(A和B) 。 (C)将少量细胞移入96孔培养皿，加入50ng/ml的TNF- a 24小时后，进行MTT监测分析，确定细胞的成活率)；
图4.抑制NF-KB可以促进化疗药物杀死细胞(分别使用三种化疗药物(Adriamycin， CDDP， VP-16)处理亲本A549细胞及其衍生的能过度表达DA-I k B的克隆细胞24小时后，进行MTT检测分析，确定细胞在不同浓度的药物物处理后的成活率)；
图5.化疗药物可以通过NF- k B信号转导通路上调Bcl_x和Bf 1_1的表达(A549和A549/I k B细胞分别用50ng/ml TNF a ， 200 ii M VP_16， 10 ii MAdriamycin，和8 ii g/mlcisplatin处理6小时。收集RNA并使用Northernanalysis检测Bcl-x，Bf 1-1和GAPDH的表达)。
具体实施方式
实施例 EGFR和NF- k B诱导的细胞存活基因作为鼻咽癌的诊断方法
在研发阶段我们获得并且鉴定了超过50个人鼻咽癌和30个乳腺癌组织样本。首先我们通过检查如LMP-1和EBNA1 ( —个EB病毒编码的核抗原)等EB病毒标记物的表达来判断这些鼻咽癌是否是EB病毒相关肿瘤。抗LMP-1 (ab7502，商购自Abeam)和抗EBER抗体(ab68991，商购自Abeam)免疫组化染色结果显示，我们检测的几乎所有鼻咽癌样品都是EB病毒阳性。然后，我们使用相应的单克隆抗体(ab62、 abl6901和ab32370，商购自Abeam)，用免疫组化染色的方法，分别检测了 EGFR、Her2/Neu和Bcl-x的表达。作为对照，我们也检测了超过30个乳腺癌样品中EGFR、 Her2/Neu和Bcl-x的表达水平。同时我们也比较了鼻咽癌细胞和其周围正常细胞中单个标记的表达水平，并将样本分为四个组。至今，我们已经完成了对EGFR、 Her2/Neu，和Bcl-x表达水平的评估，这给我们使用EGFR和Bcl-x作为潜
在诊治鼻咽癌的靶点的目标提供了第一手的根据。结果见表1。
Nasopharyngeal CarcinomaBrsast C肌csrs+++++++++
EGFR7125407232743
Her2/Neu000咖0233347
Bc-x412.7320831700表1 :鼻咽癌和乳腺癌中EGFR、 her2/Neu和Bcl-x的表达[OO45](注表中数字表示百分比) 如表1所示，超过70X的鼻咽癌样本EGFR的表达量极端高(++++) ， 25 %的样本非常高(+++)，少于5%样品比相邻的正常细胞的表达量明显高，0%与相邻正常细胞表达水平相似。在肿瘤细胞中，EGFR和EBER-1的过量表达可以通过染色显示出来，而周围正常细胞中没有显示(如图2)。有趣的是，到目前为止所有检测样品中没有一个被检查过量表达Her2/Neu， EGFR家族另一个成员在超过30%的乳腺癌细胞中过量表达。这些研究表明，EGFR在鼻咽癌中特异性过量表达而在相邻正常细胞中没有。我们的研究也发现EGFR和Her-2/Neu分别在30 %和23%的人乳腺癌中过量表达。但乳腺癌不表达LMP-1和EBER。由此通过检测样品中LMP-1和EBER两者之一的表达、以及EGFR和Her-2/Neu两者之一的表达，可以诊断鼻咽癌。有趣的是，在多数乳腺癌肿瘤样本中，EGFR的过量表达和Her-2/Neu的过量表达并不同时出现在同一样本中。这一结果暗示，不同的乳腺癌病人需要根据其基因表达特征来接受不同的治疗。例如，过量表达Her-2/Neu基因的乳腺癌病人应该用Her-2/Neu对抗物如Herc印tin来治疗，当病人的肿瘤是过量表达EGFR时应该用EGFR对抗物来治疗。并且我们的结果显示Bcl-x在多数鼻咽癌和乳腺癌中过量表达，而在相邻细胞中没有。总之，我们的结果表明EGFR和NF- k B诱导的细胞存活基因如Bcl-x和Al [Lee，H. ， Dadgostar， H. ， Shu， J. ， Cheng， q. ， and Cheng， G. The NF_ k B signal transductionpathway is essential for CD40_mediatedup_regulation of the Bcl_x and Bfl_lgenes and B-cell survival. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 :9136—9141， 1999.]。实验结果证明了在鼻咽癌中Bcl-x过量表达了。可以作为鼻咽癌的诊断标记。目前鼻咽癌诊断主要
8依靠EB病毒早期抗原(EA)和病毒衣壳抗原(VCA)，这个诊断仅能说明EB病毒活动与鼻咽癌潜在发生的联系。我们利用EGFR和NF- k B诱导的细胞存活基因来诊断鼻咽癌的方法，直接定向癌细胞。这个方法甚至可以区别出鼻咽癌肿瘤细胞和相邻的正常细胞。
EGFR和NF_ k B作为鼻咽癌治疗的药物 众所周知，EGFR家族成员与实体瘤的发生有关，它们的抑制物如herc印tin (Genentech Inc.)已经被用于临床治疗Her-2/Neu过量表达型的乳腺癌。抑制EGFR酪氨酸激酶活性的小分子如Tarceva(erlotinb) (Genentech Inc)已被美国FDA批准用于某些癌症治疗，其中包括非小细胞肺癌(NSCLC)和胰腺癌。许多可使EGFR失去功能的抗EGFR抗体也被发展起来。然而EGFR抑制剂还没有被用于治疗鼻咽癌。因为多数鼻咽癌肿瘤细胞中EGFR的表达量都非常高，我们相信EGFR的抑制物包括小分子抑制剂和抗EGFR的中和抗体，应该是有效的鼻咽癌治疗因子。 为了进一步确定EGFR抑制剂是否的确对NPC肿瘤细胞具有强的杀伤作用，我们使用EGFR抑制剂Tarceva处理鼻咽癌症细胞系C666-l[CheungST， Huang DP， Hui AB，Lo KW， Ko CW， Tsang YS， Wong N， Whitney BM， Lee JC. Nasopharyngeal carcinoma cellline(C666-1)consistently harbouringEpstein_Barr virus. Int J Cancer. 1999S印24583(1) :121-6]。鼻咽癌症细胞系C666-1在24孔培养盘上孵育至每毫升具有5Xl(f个细胞的浓度时开始进行EGFR抑制剂的有效性和敏感性实验。向细胞内加入不同剂量的EGFR抑制剂Tarceva，终浓度分别是0，0. 1，0. 3， 1，3， 10,30， 100， 300，和1000线留置24小时，然后使用标准的MTT法分析细胞的存活率(MosmannT. R即id colorimetric assayfor cellular growth and survival -application toproliferation and cytotoxicityassays. J. Immunol. Meth. 1983， 65， 55-63)，确定NPC细胞是否对EGFR抑制剂治疗是敏感的，同时还可以测量出杀灭50 %的NPC细胞以及全部NPC细胞时所需要使用的EGFR抑制剂的浓度。实验结果显示Tarceva杀灭鼻咽癌细胞C666-1的最佳IC5。值为1 y M。
接着我们重点评估了 NF-kB在癌細胞存活中的作用。由于目前还没有那种化合物可以特异性抑制NF-k B途径，我们决定使用组成活性形式的I k B (Dominant activeform of IkB，或DA-IkB)来抑制NF-kB。我们已经成功地培养出可过量表达DA-I k B的稳定HeCaT细胞克隆。之所以使用HeCaT细胞是因为以前的研究显示过量表达LMP_1的HeCaT细胞在小鼠中可以发展成肿瘤样的鼻咽癌。除HeCaT细胞外，我们也培养了稳定的过量表达DA-I k B的A549细胞系(肺癌细胞系)(ATCC# :CCH85)和Daudi细胞系(EB病毒转化的B淋巴细胞，ATCCft :CC1-213)。利用这些细胞系，我们确定了NF-k B抑制物在细胞凋亡敏化中的作用，适用于多种化学治疗剂如肿瘤坏死因子(TNF-a)、阿霉素(adriamycin，ADR)、表鬼臼毒(etoposide，VP-16)和顺氯氨铂(Cisplatin， CDDP)。利用Affymetrix基因芯片我们比较了亲本正常细胞和DA-I k B表达细胞的基因表达特征，鉴定出许多NF- k B的靶基因。以上研究不仅表明NF- k B是个有价值的癌症治疗靶点，也增加了我们对于NF- k B与癌症发生以及化学耐药性关系机制的了解。 为了研究NF-k B在细胞存活中的作用，我们培养出稳定过量表达DA-I k B的HeCaT和A549细胞。如图3所示，DA-I k B的过量表达不仅强烈抑制TNF诱导的NF- k B活性，也强烈的致敏这些细胞TNF诱导的细胞凋亡。为了进一步研究抑制NF-k B是否可以致敏响应化学治疗剂的细胞凋亡，在用数十种不同的临床普遍使用的化学治疗剂处理后，我们比较了父母代正常细胞与表达DA-I k B的A549细胞的细胞存活情况。如图4所示，A549细胞对不同的化学治疗剂如ADR、 VP-16和CDDP都有强的抵抗作用。然而用I k B抑制NF-k B活性后，A549细胞对于这些化学治疗剂变得敏感了许多。这些数据很明显的表明NF- k B抑制物与传统化学治疗剂的联合使用可能成为有抵抗作用癌细胞的一种有效治疗方法。 为了进一步研究癌细胞NF- k B依赖的抗药机制，我们使用Affymetrix基因芯片比较了父母代A549和过量表达DA-I k B的A549细胞基因表达特征。通过芯片分析，我们鉴定出许多潜在的抗药机制相关的NF- k B依赖基因。这些NF- k B依赖基因包括许多Bcl-2家族基因如Bcl-x和Bfl-l，这些基因在细胞存活中都发挥重要作用。如图5所示，许多临床普遍使用的，被认为可以杀死肿瘤细胞的化学治疗剂，事实上，在NF- k B依赖的情况中可以激活细胞存活基因上调表达，这或许可以解释癌细胞抗药机制的发生。除Bcl-2家族成员外，我们也鉴定了氧化还原相关基因的一个亚群如编码醛糖还原酶样肽(ARL-1)、谷胱甘肽过氧化物酶2(GPX2)、谷氨酰转肽酶(GluTrans)等。虽然这些基因都不是由化学治疗剂诱导的，但是这些基因在对化学治疗剂有抵抗的父母代A549细胞中高水平表达，而在表达I k B的A549细胞中(这些细胞对化学治疗剂敏感)没有高表达。进一步的研究需要了解这些基因在抗药机制中的作用。 我们的上述结果表明在鼻咽癌中正是肿瘤细胞而不是周围的正常细胞表达出高水平细胞生存基因例如Bcl-X。我们的研究也证明了抑制了 NF- k B通路就可能阻止Bcl-X的表达，引起癌细胞的凋亡。这数据建议NPC疗法另一个新颖的战略，即使用EGFR抑制剂和NF-k B抑制剂的组合。为了确定这种组合疗法比单独使用其中任何一个更有效，我们将进行三组实验，即分别使用EGFR抑制剂TarCeva、NF- k B抑制剂PS1145和两个抑制剂的组合处理NPC细胞。将鼻咽癌细胞系C666-l在24孔培养盘上孵育至每毫升具有5 X 106个细胞的浓度时开始进行实验。向细胞内加入不同剂量的NF-KB抑制剂PS 1145，终浓度分别是O，O. l，O. 3，1，3，10，30，100，300，和1000iiM，留置24小时，然后使用标准的MTT法分析细胞的存活率。结果分析测量出使用PS1145杀灭50%的NPC细胞的最佳浓度是10 ii M。
将EGFR和NF-KB抑制剂联合复方使用杀灭鼻咽癌细胞的实验所使用的复方药的成分含有Tarceva和PS1145。将复方药加入C666-1细胞，50%的NPC细胞杀灭结果发现EGFR抑制剂和NF- k B抑制剂的组合治疗鼻咽癌将是更加有效。
结论 我们的发明证明了 EGFR和Bcl_X可以作为鼻咽癌诊断和治疗的生物靶标。我们的数据建议EBV引起的NPC是通过剌激性调控EGFR而发展起来的，EGFR提供一个强的细胞分裂信号，激活NF- k B通路，使得细胞迅速增殖而发生癌变。
我们的发明有二种主要应用 1)我们可以使用EGFR和Bcl_X作为诊断鼻咽癌的生物靶标。 目前鼻咽癌的诊断方法都只限于检测EBV病毒蛋白引起的抗体。这些方法的局限
性在于只能用于鼻咽癌高危人群的筛查而不能作为确诊依据。而我们的结果如图2所显
示，EGFR和Bcl-X仅在鼻咽癌细胞中高度表达。因此可以和EBV的耙标一起用于确诊鼻咽癌。 2)单独使用EGFR抑制剂Tarceva或NF_ k B抑制剂PS1145都能杀灭鼻咽癌细胞，然而联合使用Tarceva和PS1145治疗鼻咽癌更加有效。
权利要求
试剂在制备鼻咽癌诊断剂中的应用，所述试剂用于对生物体样品中的表皮生长因子受体(EGFR)或核转录因子-κB(NF-κB)的表达或活性进行测定。
2. 试剂在制备用于评价鼻咽癌的进展程度和/或治疗的有效性的诊断剂中的应用，所 述试剂用于对生物体样品中的表皮生长因子受体(EGFR)或核转录因子-KB(NF-KB)的表 达或活性进行测定。
3. —种用于检测鼻咽癌的试剂盒，其含有用于对生物体样品中的表皮生长因子受体(EGFR)或核转录因子-KB(NF-KB)的表达 或活性进行测定的试剂。
4. 一种用于评价鼻咽癌的进展程度和/或治疗的有效性的试剂盒，其中，含有 用于对生物体样品中的表皮生长因子受体(EGFR)或核转录因子-KB(NF-KB)的表达或活性进行测定的试剂。
5. —种治疗鼻咽癌的药物组合物，其含有抑制表皮生长因子受体(EGFR)和/或 核转录因子-KB(NF-KB)的表达或活性的物质作为有效成分；和药用载体，优选所述药 物组合物同时含有抑制表皮生长因子受体(EGFR)的表达或活性的物质和抑制核转录因 子-k B (NF- k B)的表达或活性的物质作为有效成分。
6. 根据权利要求5的药物组合物，其还含有另一种用于治疗鼻咽癌的活性成分，优选 为化学治疗剂，如肿瘤坏死因子(TNF)、阿霉素(ADR)、表鬼臼毒(VP-16)、顺氯氨铂(CDDP)、 长春新碱、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶和争光霉素。
7. 抑制表皮生长因子受体(EGFR)和/或核转录因子_ k B (NF- k B)的表达或活性的物 质在制备用于治疗鼻咽癌的药物中的应用。
8. 根据权利要求7的应用，其中所述药物还含有另一种用于治疗鼻咽癌的活性成分， 优选为化学治疗剂，如肿瘤坏死因子(TNF)、阿霉素(ADR)、表鬼臼毒(VP-16)、顺氯氨铂 (CDDP)、长春新碱、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶和争光霉素。
9. 一种用于治疗鼻咽癌的试剂盒，其含有抑制表皮生长因子受体(EGFR)和/或核转 录因子-k B(NF-k B)的表达或活性的物质，优选该试剂盒还含有另一种用于治疗鼻咽癌 的活性成分，优选为化学治疗剂，如肿瘤坏死因子(TNF)、阿霉素(ADR)、表鬼臼毒(VP-16)、 顺氯氨铂(CDDP)、长春新碱、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶和争光霉素。
10. —种鉴定治疗鼻咽癌的化合物的方法，所述方法包括a. 提供表达表皮生长因子受体(EGFR)和/或核转录因子-k B(NF-k B)的细胞；b. 将所述化合物与所述细胞温育；禾口c. 检测细胞中表皮生长因子受体(EGFR)和/或核转录因子-KB(NF-KB)的表达或活 性是否被所述化合物抑制。
全文摘要
本发明公开了使用表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)和核转录因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)作为有效、特异性的鼻咽癌诊断标记分子，并且公开了将使用EGFR和(或)NF-κB的抑制剂治疗鼻咽癌。本发明还公开了一种用于检测鼻咽癌的试剂盒，其含有用于对生物体样品中的表皮生长因子受体(EGFR)或核转录因子-κB(NF-κB)的表达或活性进行测定的试剂。本发明还提供了一种鉴定治疗鼻咽癌的化合物的方法。
文档编号G01N33/50GK101769917SQ20091007656
公开日2010年7月7日 申请日期2009年1月7日 优先权日2009年1月7日
发明者程根宏 申请人:同昕生物技术(北京)有限公司