专利名称：大孔树脂提取物中残留溶剂的顶空气相色谱检测方法
技术领域：
本发明涉及一种大孔树脂提取物残留溶剂的测定方法，其特征是应用顶空气相色 谱法同时测定其中的正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯及二乙烯苯。
背景技术：
大孔树脂提取方式目前被广泛应用在中药材的纯化、提取过程中，其提取物主要 作为保健品以及药品生产的原料使用。因大孔树脂在生产、存储过程中易存在正己烷、苯、 甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯及二乙烯苯等毒性溶剂的残留。为保障药品的安全、有 效，国家食品药品监督管理局对于使用大孔树脂提取的产品均要求进行残留溶剂的检查， 同时根据ICH以及《中国药典》2005年版相关要求，上述有机溶剂的限度要求依次为提取 物每Ig中含苯不得过2 μ g、含正己烷、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯不得过 20 μ go顶空气相色谱法为近几年发展起来的测定药物中残留溶剂的方法，经查阅相关文 献，未见同时测定上述7种残留溶剂检测方法的相关报道。
发明内容
本发明的要解决的技术问题是提供一种全面、准确测定大孔树脂提取物中残留溶 剂的测定方法。为解决本发明的技术问题，本发明采用如下技术方案。本发明提供的检测大孔树脂提取物中残留溶剂的方法为顶空气相色谱法，能同时 测定大孔树脂提取物中正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯及二乙烯苯的方法。包括步骤(1)、色谱条件与系统适用性试验色谱柱为交联毛细管柱，采用程序升温；进样 口温度为150 200°C，检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，检测器温度210 280°C ；载 气为氮气；正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的分离度应大于1. 5。(2)对照品溶液的制备另取色谱纯正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙 烯、二乙烯苯适量，分别精密称定，至同一量瓶中，加适当溶剂稀释制成每Iml约含苯0.2 1. O μ g、含正己烷、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯2. 0 10. 0 μ g的均勻溶液 作为对照溶液。(3)供试品溶液的制备取大孔树脂提取物适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制 成每Iml约含提取物100 500mg的均勻溶液。(4)测定分别精密量取对照品溶液、供试品溶液各1. 0ml，置顶空瓶中，采用顶 空预热后，精密抽取顶空瓶上部气体1ml，注入气相色谱仪测定、计算，即得。步骤(1)中优选的交联毛细管柱选自DB-l、HP-l、HP-5或DB-624交联毛细管柱。步骤(1)中优选的程序升温为初始温度为30 50°C保持3 lOmin，后以5 IO0C /min的速度升温至100 160°C，保持3 15min。
步骤(1)中优选的载气氮气的流速为1.0 3.0ml/min，分流比为1 3 1 10 ；步骤⑵和步骤(3)中的优选的溶剂选自水或含有体积比为10 100%二甲基亚 砜水溶液。步骤(4)中的优选的顶空预热方式为70 100°C预热5 20分钟；定量环(Loop) 温度为80 120°C ；连接管路(TR. Line)温度为100 140°C。同时测定大孔树脂提取物中正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯及二乙烯苯的优选的检测方法，包括如下步骤(1)、色谱条件与系统适应性试验色谱柱为DB-l、HP-l、HP-5或DB-624交联毛细 管柱；程序升温为初始温度为30 50°C保持3 lOmin，后以5 10°C /min的速度升温 至100 160°C，保持3 15min ；进样口温度为150 200°C ；检测器温度为氢火焰离子化 检测器(FID)，检测器温度210 280°C ；载气为氮气，流速为1. 0 3. Oml/min，分流比为 1 3 1 10 ；正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的分离度应大于
1.5 ；(2)对照品溶液的制备另取色谱纯正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙 烯及二乙烯苯适量，分别精密称定，至同一量瓶中，加水或10 100%二甲基亚砜溶解稀释 制成每Iml约含苯0. 2 1. 0 μ g、含正己烷、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯
2.0 10. 0 μ g的均勻溶液作为对照品溶液；(3)供试品溶液的制备取大孔树脂提取物适量，精密称定，加水或10 100%二 甲基亚砜溶解并稀释制成每Iml约含本品100 500mg的均勻溶液作为供试品溶液；(4)测定分别精密量取对照品溶液、供试品溶液各1. 0ml，置顶空瓶中，采用顶 空预热方式为，70 100°C预热5 20分钟，定量环(Loop)温度为80 120°C，保持0. 5 分钟，连接管路(TR. Line)温度为100 140°C，保持0. 5分钟，精密抽取顶空瓶上部气体 lml，注入气相色谱仪测定、按照外标法计算，即得。同时测定大孔树脂提取物中正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯及二乙 烯苯的最优选的检测方法，包括如下步骤(1)色谱条件与系统适应性试验色谱柱为DB-I交联毛细管柱(60mX0. 32mm. i. d，1 μ m)；程序升温为初始温度为40°C保持6min，后以8°C /min的速度升温至150°C，保 持5min ；进样口温度为180°C ；检测器温度为氢火焰离子化检测器，检测器温度250°C ；载气 为氮气，流速为2.5ml/min，分流比为1 5 ；乙醇、正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯 乙烯、二乙烯苯的分离度应大于1. 5 ；(2)对照品溶液的制备另取色谱纯乙醇、正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、 苯乙烯及二乙烯苯适量，分别精密称定，至同一量瓶中，加50%二甲基亚砜溶解并稀释制成 每Iml约含苯0.8yg、含正己烷、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯8yg、乙醇 80 μ g的均勻溶液作为对照品溶液；(3)供试品溶液的制备取大孔树脂提取物适量，精密称定，加50%二甲基亚砜 溶解并稀释制成每Iml约含本品400mg的均勻溶液作为供试品溶液；(4)测定分别精密量取对照品溶液、供试品溶液各1. 0ml，置顶空瓶中，采用顶 空预热方式为，90°C预热10分钟，定量环(Loop)温度为100°C，保持0. 5分钟，连接管路(TR. Line)温度为110°C，保持0. 5分钟，精密抽取顶空瓶上部气体1ml，注入气相色谱仪测 定、计算，即得。其中二甲苯、二乙烯苯在色谱图中分别体现为连续的3个峰、4个峰，在计算过程 中以其峰面积的总和作为该溶剂的峰面积计算。本发明有的有益技术效果 本发明空开了的用顶空气相色谱法同时测定大孔树脂提取物中残留溶剂正己烷、 苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯及二乙烯苯的通用方法。经方法学验证，其专属性及系统适应性、线性、精密度、最小检测限、回收率符合 《中国药典》2005年版一部附录中药质量标准分析方法验证指导原则的要求。为了全面、准确地控制大孔树脂提取物中的残留溶剂，保障药品安全、有效，提供 了技术手段。
图1对照品溶液测定结果色谱图。1.乙醇(ethan0l)、2.正己烷(heXane)、3.苯 (benzene) >4.甲苯(dimethyl benzene) >5.甲基环己烧(methyl cyclohexane)6. 二甲苯 (dimethyl benzene) >7.苯乙烯(cinnamene)、8· 二乙烯苯(divinyl benzene)。图2空白溶液测定结果色谱图
具体实施例方式(1)色谱条件与系统适应性试验色谱柱为DB-I交联毛细管柱(60mX0. 32mm. i. d，1 μ m)；程序升温为初始温度为40°C保持6min，后以8°C /min的速度升温至150°C，保 持5min。进样口温度为180°C ；检测器温度为氢火焰离子化检测器，检测器温度250°C ；载 气为氮气，流速为2.5ml/min，分流比为1 5 ；乙醇、正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、 苯乙烯、二乙烯苯的分离度应大于1. 5。(2)对照品溶液的制备另取色谱纯乙醇、正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、 苯乙烯及二乙烯苯适量，分别精密称定，至同一量瓶中，加50%二甲基亚砜溶解并稀释制成 每Iml约含苯0.8yg、含正己烷、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯8yg、乙醇 80 μ g的均勻溶液作为对照品溶液。(3)供试品溶液的制备取HP-5适量，精密称定，加50%二甲基亚砜溶解并稀释制 成每Iml约含本品400mg的均勻溶液作为供试品溶液。(4)测定分别精密量取对照品溶液、供试品溶液各1. 0ml，置顶空瓶中，采用顶 空预热方式为，90°C预热10分钟，定量环(Loop)温度为100°C，保持0. 5分钟，连接管路 (TR. Line)温度为110°C，保持0. 5分钟，精密抽取顶空瓶上部气体1ml，注入气相色谱仪测 定、计算，即得。应用实例顶空气相色谱法测定大孔树脂提取物HP中的残留溶剂HP为中国医学科学院药物研究所多年来研究的中药提取物，其主要用于肾功能衰 竭的治疗，前期研究临床前研究结果表明其疗效肯定，安全、无明显毒副作用。该药在提取 过程中需使用大孔树脂对样品进行提取、分离，根据国家食品药品监督管理局有关新药研 究技术要求应对树脂中可能存在的残留物进行检查，对其残留量加以控制。经过试验、研究，建立了同时测定大孔树脂提取物HP中乙醇、正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯 乙烯、二乙烯苯残留有机溶剂含量的顶空气相色谱法。
方法学考察如下(1)专属性及系统适应性分别取少量乙醇、正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯，以 50%二甲基亚砜溶解制备溶液，按上述方法进行顶空进样，进行测定，结果表明(见后 附图)，保留时间分别为甲醇5. 7min、正己烷8. 2min、苯10. Omin,甲基环己烷12. 3min、 甲苯 13. 5min、二甲苯 16. 2-17. Imin,邻 二甲苯 5. 7min、苯乙烯 17. Omin, 二乙烯-苯 21. 8-23. Omin。(2)线性精密称取苯18. 63mg于IOml容量瓶中，以二甲基亚砜液稀释至刻度摇勻，精密吸 取Iml至25ml容量瓶中，精密称取乙醇208. 88mg、正己烷19. 19mg、甲苯19. Olmg,甲基环己 烷18. 85mg、二甲苯18. 87mg、苯乙烯18. 98mg、二乙烯苯20. 44mg，至25ml容量瓶中，以二甲 基亚砜液稀至刻度摇勻，作为标准溶液，精密量取此3ml标准溶液IOOml容量瓶中加50%二 甲基亚砜溶液稀释至刻度，摇勻，作为对照品储备液。精密量取此对照品储备液lml、2. 5ml、3ml、3. 5ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml 于 IOml容量瓶中，分别稀释配制成含对照品不同浓度的标准溶液10瓶，各精密量取1. Oml 至10个顶空瓶中，在90°C下预热IOmin后，取顶空瓶上部气体1. Oml进样，照上述方法进 行测定，记录色谱图，通过积分确定峰面积，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性 回归。得到残留溶剂乙醇在25. 07 225. 59g/ml范围内，残留溶剂正己烷在2. 3028 20. 7252g/ml范围内，残留溶剂苯在0. 22 2. Olg/ml范围内，残留溶剂甲苯在2. 28 20. 53g/ml范围内，残留溶剂甲基环己烷在2. 26 20. 35g/ml范围内，残留溶剂二甲苯在 2. 26 20. 38g/ml范围内，残留溶剂苯乙烯在2. 28 20. 50g/ml范围内，残留溶剂二乙烯 苯在2. 45 22. 08g/ml范围内，线性良好，回归方程为乙醇Y = 6. 85x+22. 51r = 0. 9995正己烧Y = 2. 693x-73. 76 r = 0. 9982苯Y= 109. 31x+2. 96 r = 0. 9997甲苯Y = 103. 84x+46. 40 r = 0. 9987甲基环己烧 Y = 96. 48x-75. 91 r = 0. 9989二甲苯Y = 94. OOx+42. 26 r = 0. 9983苯乙烯Y = 63. 83x+33. 40 r = 0. 9994二乙烯苯 Y = 32. 57χ+44· 991 r = 0. 9978(3)精密度精密量取对照溶液各1. 0ml，至6个顶空瓶中，密封后在90°C下预热lOmin，取顶空 瓶上部气体1.0ml进样，照上述方法进行测定，记录色谱图，根据乙醇、正己烷、苯、甲苯、甲 基环己烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的峰面积计算RSD%分别为2. 69 %、1. 96 %、2. 51 %、 2. 53 %、2. 07 %、2. 66 %、2. 39 %、3. OO %，均小于10. O %，符合《中国药典》2005版对残留溶 剂检查系统适用性的要求。(4)最小检测限
按照信噪比为3 1，本方法溶液中乙醇、正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、 苯乙烯、二乙烯苯的最小检测限分别为2. 72μ g/ml、0. 22μ g/ml、0. 03μ g/ml、0. 03μ g/ml、 0. 28 μ g/ml>0. 33 μ g/ml>0. 03 μ g/ml>0. 31 μ g/ml。(5)(加样)回收率分别精密称取HP原料药一批各400mg 6份，分别于6个顶空瓶中，分别加入对照 溶液Iml充分混勻，照上述方法进行测定，记录色谱图，通过积分确定其峰面积，按外标法 计算试样中乙醇、正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的回收率，结果 见下表表1 HP-5中残留溶剂回收率测定结果 结果表明，本品加样回收率基本符合要求。
权利要求
一种同时测定大孔树脂提取物中正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯及二乙烯苯7种有机溶剂的顶空气相色谱检测方法，其特征在于，包括步骤(1)、色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为交联毛细管柱，采用程序升温；进样口温度为150～200℃，检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，检测器温度210～280℃；载气为氮气；正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的分离度应大于1.5。(2)对照品溶液的制备 另取色谱纯正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯适量，分别精密称定，至同一量瓶中，加适当溶剂稀释制成每1ml约含苯0.2～1.0μg、含正己烷、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯2.0～10.0μg的均匀溶液作为对照溶液。(3)供试品溶液的制备 取大孔树脂提取物适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1ml约含提取物100～500mg的均匀溶液。(4)测定 分别精密量取对照品溶液、供试品溶液各1.0ml，置顶空瓶中，采用顶空预热后，精密抽取顶空瓶上部气体1ml，注入气相色谱仪测定、计算，即得。
2.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述的交联毛细管柱选自DB-1、 HP-l、HP-5或DB-624交联毛细管柱。
3.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述的程序升温为初始温度为 30 50°C保持3 lOmin，后以5 10°C /min的速度升温至100 160°C，保持3 15min。
4.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述载气氮气的流速为1.0 3. Oml/min，分流比为 1 3 1 10。
5.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，步骤⑵和步骤⑶中的溶剂选自水或含 有体积比为10 100%二甲基亚砜水溶液。
6.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，步骤(4)中的顶空z预热方式为70 100°c预热5 20分钟。
7.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，步骤(4)中的顶空预热时定量环(Loop) 温度为80 120°C。
8.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，步骤(4)中的顶空预热时连接管路(TR. Line)温度为 100 140°C。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的检测方法，其特征在于，由以下步骤组成(1)、色谱条件与系统适应性试验色谱柱为DB-1、HP-1、HP-5或DB-624交联毛细管 柱；程序升温为初始温度为30 50°C保持3 lOmin，后以5 10°C /min的速度升温至 100 160°C，保持3 15min ；进样口温度为150 200°C ；检测器温度为氢火焰离子化 检测器(FID)，检测器温度210 280°C ；载气为氮气，流速为1.0 3. Oml/min，分流比为 1 3 1 10 ；正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的分离度应大于 1. 5 ；(2)对照品溶液的制备另取色谱纯正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯及 二乙烯苯适量，分别精密称定，至同一量瓶中，加水或10 100%二甲基亚砜溶解稀释制成 每lml约含苯0. 2 1. 0 ii g、含正己烷、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯2. 0 lO.Oug的均勻溶液作为对照品溶液；(3)供试品溶液的制备取大孔树脂提取物适量，精密称定，加水或10 100%二甲基亚砜溶解并稀释制成每1ml约含本品100 500mg的均勻溶液作为供试品溶液；(4)测定分别精密量取对照品溶液、供试品溶液各1. 0ml，置顶空瓶中，采用顶空预 热方式为，70 100°C预热5 20分钟，定量环(Loop)温度为80 120°C，保持0. 5分钟， 连接管路(TR. Line)温度为100 140°C，保持0. 5分钟，精密抽取顶空瓶上部气体1ml，注 入气相色谱仪测定、按照外标法计算，即得。
10.根据权利要求9的检测方法，其特征在于，由以下步骤组成(1)色谱条件与系统适应性试验色谱柱为DB-1交联毛细管柱(60mX0.32mm. i. d， lum)；程序升温为初始温度为40°C保持6min，后以8°C /min的速度升温至150°C，保持 5min ；进样口温度为180°C ；检测器温度为氢火焰离子化检测器，检测器温度250°C ；载气为 氮气，流速为2. 5ml/min，分流比为1 5 ；乙醇、正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙 烯、二乙烯苯的分离度应大于1. 5 ；(2)对照品溶液的制备另取色谱纯乙醇、正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯 乙烯及二乙烯苯适量，分别精密称定，至同一量瓶中，加50%二甲基亚砜溶解并稀释制成 每1ml约含苯0. 8 ii g、含正己烷、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯8 ii g、乙醇 80 ug的均勻溶液作为对照品溶液；(3)供试品溶液的制备取大孔树脂提取物适量，精密称定，加50%二甲基亚砜溶解并 稀释制成每1ml约含本品400mg的均勻溶液作为供试品溶液；(4)测定分别精密量取对照品溶液、供试品溶液各1.0ml，置顶空瓶中，采用顶空预热 方式为，90°C预热10分钟，定量环(Loop)温度为100°C，保持0. 5分钟，连接管路(TR. Line) 温度为110°C，保持0. 5分钟，精密抽取顶空瓶上部气体1ml，注入气相色谱仪测定、计算，即 得。
全文摘要
本发明公开了大孔树脂提取物中残留溶剂的顶空气相色谱检测方法。能同时测定大孔树脂提取物中的正己烷、苯、甲苯、甲基环己烷、二甲苯、苯乙烯及二乙烯苯。包括如下步骤一、色谱条件与系统适用性试验；二、对照品溶液的制备；三、供试品溶液的制备；四、测定。其专属性及系统适应性、线性、精密度、最小检测限、回收率等均符合《中国药典》2005年版一部附录中药质量标准分析方法验证指导原则的要求。
文档编号G01N30/68GK101858893SQ20091008162
公开日2010年10月13日 申请日期2009年4月7日 优先权日2009年4月7日
发明者刘冬, 张东明, 杨敬芝, 赵立敏 申请人:北京协和药厂