专利名称：β2-微球蛋白检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及免疫学检测领域，特别涉及到一种3 2-微球蛋白检测试剂盒
背景技术：
0 2微球蛋白，以下简称0 2M，它是HLA I类抗原中的0 2轻链，它不插入细胞膜 而游离于细胞外，其功能与稳定I类抗原的表达有关。它的基因位于第15对染色体上，而 HLA I类抗原的a重链基因则位于第6对染色体上。0 2M基因的表达不完全受制于I类 抗原的表达。0 2M是由100个氨基酸残基组成的非糖基化单链多肽，分子质量11800 y。人体间质细胞、上皮细胞和造血系统的正常细胞、恶性细胞均能合成0 2M，体外培 养显示淋巴细胞受植物血凝素PHA刺激后02M合成加速。细胞内02M水平主要受a、
干扰素调节，这些介质在转录水平控制0 2M的合成。肝脏是合成0 2M的主要器官，正 常人0 2M的合成速率非常恒定，约0. 13(0. 11 0. 18)mg/(h -kg)体重。肾功能不全患者 合成速率与正常人相似。0 2M在体内广泛分布于血清、脑脊液、唾液、初乳、羊水、精液及尿液中。幼儿血 清含量较成人略高，随年龄增长其血清含量逐渐下降，正常成人血中浓度很低，平均约为 1. 5mg/L。在正常新陈代谢过程中，0 2M与HLA分离后释放到体液，入血循环的0 2M 90%以 单体非蛋白结合状态存在，其血浆半衰期小于2h。0 2M主要从肾脏排泄，95%循环0 2M可 经肾小球自由滤过，其中99. 9%以上由近端肾小管以胞饮形式摄取，摄入后转运至溶酶体 酶降解为氨基酸。正常人尿中排泄0 2M很少，尿浓度<0.2mg/L。当0 2M体内合成增多或肾脏排泄减少时，可引起血0 2M±曾高。恶性肿瘤、风湿 病、肝脏病、慢性炎症等许多疾病均可因体内0 2M合成增多而引起血0 2M增高，因此应用 血3 2M估测肾功能时应首先排除这些疾病。0 2M分子质量小，可自由通过肾小球滤过，并仅由肾脏排泄和分解，而且体内产生 速度恒定，不受年龄、性别、机体肌肉组织的多少影响，因此测定血0 2M比血肌酐能更好地 反映肾小球滤过率(GFR)的变化。研究发现，血0 2M与GFR显著负相关，而与血肌酐、尿素 氮显著正相关。血0 2M评价肾功能比血肌酐更敏感。血0 2M测定可更早地发现肾小球功 能受损。各种原发或继发性肾小球病变累及肾小球滤过功能时，均可使血0 2M增高。血0 2M是反映糖尿病患者轻度肾功能减退和观察疗效的敏感指标，并且血3 2M 可早期反映高血压病的肾功能受损情况，对临床指导用药，避免应用影响肾功能的降压药 和抗生素具有重要意义。长期血液透析患者血3 2M显著增高，高水平的血3 2M与淀粉样 变性、淀粉样骨关节病及腕管综合征的发生相关。肾移植后2、3天内，血02M开始升高，随后逐渐下降，其下降速度比血肌酐快。当 发生排斥反应时，血0 2M突然再次上升。因此血0 2M有助于动态观察及早期诊断肾移植 排斥反应。当体内32M合成增多，血3 2M水平高于正常值3倍以上时，肾小球滤过量超过肾
3小管的重吸收能力，则尿中0 2M排出增高。因此，用尿0 2M测定评价肾脏功能时，应测血 3 2M，排除引起血3 2M增高的疾病。若血中3 2M含量正常而尿中3 2M含量增高，说明肾 近端小管功能受损。研究发现，尿0 2M增高是由于肾近端小管刷状缘膜蛋白摄取过程受干 扰或溶酶体蛋白分解代谢减少的缘故。测定尿0 2M在肾脏疾病的诊治中具有重要价值。尿3 2M是反映肾小管重吸收功能的指标近端肾小管是32M在体内处理的唯一 场所，当近端肾小管轻度受损时，尿02M已明显增加，而且尿02M与肾小管重吸收率呈正 相关。因此，测定尿0 2M是诊断近端肾小管受损的敏感、特异方法。引起近端肾小管重吸 收障碍的病因很多，包括先天性肾小管病变和后天性肾小管功能受损。尿0 2M可早期发现糖尿病和高血压病患者的肾小管损害糖尿病、高血压病患者 早期尿0 2M即增高，说明糖尿病和高血压病患者早期即有肾小管损害。尿0 2M增高与肾 功能损害程度显著相关，治疗后随病情控制尿0 2M明显下降。尿0 2M可动态观察及诊断早期肾移植排斥反应，若抗排斥治疗后尿0 2M仍升高， 则往往表明有反复排斥反应，最终可导致移植肾功能丧失。目前市场上已有的检测0 2M的方法是化学发光法，这种检测方法的效果依赖实 验仪器、环境或者操作人员的熟练度，不便于随时随地的监测和检验。
实用新型内容本实用新型所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作简单方 便，对实验室条件不具有依赖性的，用于快速检测血液和尿液中的0 2M的检测试剂盒。为解决上述技术问题，本实用新型是按如下方式来实现的本实用新型所述的 3 2-微球蛋白检测试剂盒由吸水滤纸，硝酸纤维素膜，胶体金垫，样品垫，反应支持物组成； 所述硝酸纤维素膜包括0 2M单克隆抗体条带T，和羊抗鼠IgG多克隆抗体C ；所述胶体金垫 含有胶体金标记的0 2M单克隆抗体；包被好的硝酸纤维素膜粘贴在反应支持物的中间部 位；条带C线方向的反应支持物上粘贴有吸水滤纸，压住硝酸纤维素膜一定宽度；条带T线 方向的反应支持物上首先粘贴适当宽度的的胶体金垫，压住硝酸纤维素膜条带T线的边缘 一定宽度；在此方向上继续粘贴样品垫，压住胶体金垫适当宽度。所述硝酸纤维素膜可以包括0 2M单克隆抗体条带T，和羊抗鼠IgG多克隆抗体C。所述硝酸纤维素膜可以包括0 2M多克隆抗体条带T，和羊抗鼠IgG多克隆抗体C所述胶体金垫可以含有胶体金标记的0 2M单克隆抗体。所述胶体金垫可以含有胶体金标记的0 2M多克隆抗体。本实用新型的积极效果在于本实用新型所述的0 2-微球蛋白检测试剂盒，能够 简化0 2M检测流程。利用这种试剂盒检测0 2M，不对任何实验仪器、环境或者操作人员具 有依赖性，操作简单、方便、检测周期短、易于判读，不需要特殊的仪器设备，不需要专业培 训，适应性强，便于随时随地的监测和检验。
以下结合附图和具体实施方式
对本实用新型作进一步详细的说明。
图1是本实用新型检测试剂盒的正面示意图；图2是本实用新型检测试剂盒的侧面示意图；[0025]图3是本实用新型检测结果阳性示意图；图4是本实用新型检测结果阴性示意图；图5是本实用新型检测结果无效示意图；图6是本实用新型检测结果无效示意图；图中1吸水滤纸 2硝酸纤维素膜 3胶体金垫4样品垫 5反应支持物
具体实施方式
参照图1和图2，本实用新型所述的3 2-微球蛋白检测试剂盒由吸水滤纸1，硝酸 纤维素膜2，胶体金垫3，样品垫4，反应支持物5组成；所述硝酸纤维素膜2包括2M单克隆 抗体条带T，和羊抗鼠IgG多克隆抗体C ；所述胶体金垫3含有胶体金标记的0 2M单克隆抗 体；包被好的硝酸纤维素膜2粘贴在反应支持物5上，其条带T线方向硝酸纤维素膜的边缘 距离反应支持物5边缘28. 0mm,条带C线方向硝酸纤维素膜的边缘距离反应支持物5的边 缘32. 0mm ；条带C线方向的反应支持物5上粘贴有吸水滤纸1，宽为33. 0mm，压住硝酸纤维 素膜1. 0mm ；条带T线方向的反应支持物5上首先粘贴6. 0mm宽的胶体金垫3，压住硝酸纤 维素膜条带T线的边缘1. 0mm ；在此方向上继续粘贴样品垫4，宽为25. 0mm,压住胶体金垫
2. 0mmo首先制备0 2-微球蛋白检测试剂盒，2M单克隆抗体腹水的纯化将含有0 2M单克隆抗体的腹水使用辛酸_饱和硫酸铵沉淀后，使用紫外分光法 测定蛋白浓度和SDS-PAGE测定纯度，所得单克隆抗体的蛋白浓度高于2. Omg/ml，纯度大于 90%为合格。胶体金的制备和与鉴定使用柠檬酸三钠还原法还原氯金酸制备胶体金颗粒， 使用紫外分光光度计扫描460 600nm区间的光吸收值，在520至525nm区间有最大吸收 峰，且吸收值大于2. 0为合格，对应胶体金颗粒直径大约为30 40nm。0 2M单克隆抗体最 佳标记PH值和最佳标记浓度的确定使用胶体金梯度pH值平行标记该抗体，选择变色边缘 的的标记条件将该PH值加上0. 5作为该抗体进行标记的最佳pH值，大约为7. 4至8. 0 ；在 该最佳PH值条件下，设定蛋白梯度进行标记，在胶体金中加入单克隆抗体后混勻，放置20 分钟以上，按每毫升胶体金加入100 ill的比例加入10%的NaCl，混勻，观察颜色，选定加 入单抗浓度最低且颜色不发生变化的标记量再额外附加10%值作为最佳的标记量，大约为 12至18 ii g/ml。胶体金标记抗体的纯化将标记好的胶体金溶液，加入BSA和PEG20000至 终浓度均为0. 2%，混勻，放置15分钟以上，使用高速冷冻离心机12000rpm离心15分钟以 上，弃去上清，将沉淀使用胶体金保存液复溶，体积为原标记胶体金体积的1/10。复溶比例 的调试使用胶体金工作液稀释标记胶体金浓缩液进行稀释，稀释比例为10至20倍，喷涂 到胶体金垫上进行干燥，最后根据与包被硝酸纤维素膜配对的检测结果确定最佳的稀释比 例，一般选择15倍左右。包被抗体最佳包被条件的选择硝酸纤维素膜上的T线和C线的 包被浓度设置几个浓度梯度分别包被，最终选择检测结果最好的作为最佳包被浓度，并对 包被用缓冲液、包被量等进行调试。最终选择包被缓冲液为0. 02M pH 7.2PBS，包被浓度为 1. Omg/ml，喷量选择为 1. Ou 1/cm。将待检标本(全血、血清、血浆或者尿液)60至100 ill直接加入检测试剂盒样品 垫4处(全血样本需要额外加入一些稀释液)，样品将沿着反应支持物5的各个附着物向吸水滤纸方向移动，20分钟内读取实验结果。参照图3，如果样本中含有0 2M，则与检测试剂盒上的胶体金标记的0 2M单抗特 异性结合形成复合物，沿着膜区继续上行则与包被在硝酸纤维素膜2上的另一个0 2M单抗 发生特异性结合，在条带T处出现红色或者粉红色，参照图4，如果样本中没有0 2M抗原，就不能形成上述复合物，条带T处也就不能 出线红色或粉红色，为阴性。参照图5和图6，无论样本中是否含有0 2M，胶体金标记的单克隆抗体都会继续 上行至包被膜的条带C，去此处包被的羊抗鼠IgG结合形成红色或者粉红色条带，即为质控 线，如果在检测中此条带不出现，则证明胶体金失效或者操作有失误，结果无效，需要重新 检测。以上所述之具体实施例，意在具体说明本实用新型的思路，本实用新型之实施，并 不限于以上具体实施例所公开的方式。凡基于本实用新型之设计思路，进行简单推演与替 换，都属于本实用新型之实施。
权利要求一种β2-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于其由吸水滤纸(1)，硝酸纤维素膜(2)，胶体金垫(3)，样品垫(4)，反应支持物(5)组成；所述硝酸纤维素膜(2)包括β2M单克隆抗体条带T，和羊抗鼠IgG多克隆抗体C；所述胶体金垫(3)含有胶体金标记的β2M单克隆抗体；包被好的硝酸纤维素膜(2)粘贴在反应支持物(5)上，其条带T线方向硝酸纤维素膜的边缘距离反应支持物(5)边缘28.0mm，条带C线方向硝酸纤维素膜的边缘距离反应支持物(5)的边缘32.0mm；条带C线方向的反应支持物(5)上粘贴有吸水滤纸(1)，压住硝酸纤维素膜1mm到2mm；条带T线方向的反应支持物(5)上首先粘贴4mm到8mm的胶体金垫(3)，压住硝酸纤维素膜条带T线的边缘1mm到2mm；在此方向上继续粘贴样品垫(4)，压住胶体金垫2mm到4mm。
2.根据权利要求1所述的β2-微球蛋白(β2Μ)检测试剂盒，其特征在于所述硝酸 纤维素膜(2)包括β 2Μ多克隆抗体或者单克隆抗体条带Τ，和羊抗鼠IgG多克隆抗体C。
3.根据权利要求1所述的β2-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于所述胶体金垫(3) 含有胶体金标记的β 2Μ单克隆抗体或者多克隆抗体。
专利摘要本实用新型涉及免疫学检测领域，特别涉及到一种β2-微球蛋白检测试剂盒。其由吸水滤纸(1)，硝酸纤维素膜(2)，胶体金垫(3)，样品垫(4)，反应支持物(5)组成；所述硝酸纤维素膜(2)包括β2M单克隆抗体条带T，和羊抗鼠IgG多克隆抗体C；所述胶体金垫(3)含有胶体金标记的β2M单克隆抗体。本实用新型所述的β2-微球蛋白检测试剂盒，能够简化β2M检测流程。利用这种试剂盒检测β2M，不对任何实验仪器、环境或者操作人员具有依赖性，操作简单、方便、检测周期短、易于判读，不需要特殊的仪器设备，不需要专业培训，适应性强，便于随时随地的监测和检验。
文档编号G01N33/577GK201600371SQ20092021705
公开日2010年10月6日 申请日期2009年9月25日 优先权日2009年9月25日
发明者顾子易 申请人:顾子易