专利名称：一种岗梅总皂苷的提取方法及其质量检测方法
技术领域：
本发明涉及一种从岗梅药材中提取岗梅总皂苷的方法及用途，本发明还涉及一种岗梅总皂苷的质量检测方法。
背景技术：
岗梅为冬青科植物梅叶冬青的干燥根及茎，收载于《广东省中药材标准》(第一册)粤D/WS-058-2003项下，主产于广东、广西等地，为岭南习用中药。功能主治为清热解毒，生津止渴，利咽消肿，散瘀止痛；用于感冒发热，肺热咳嗽，热病津伤口渴，咽喉肿痛，跌打瘀痛。主要含三萜皂苷、内酯(香豆素)及少量生物碱。
大孔吸附树脂为一种有机高聚吸附剂，具有选择性吸附有机化合物的能力，应用于皂苷类成分的富集纯化有较好的效果，但其吸附性能及其解吸、纯化条件参数因化合物的理化性质的不同而不同。冯达星等(大孔树脂富集纯化岗梅根中总皂苷的研究，广东药学院学报2004年6月)采用大孔吸附树脂LSA-20对岗梅根中的总皂苷进行了提取，纯化前总固形物中岗梅根总皂苷含量为5.3％，纯化后总固形物中岗梅根总皂苷含量为62.98％，精制度达11.86倍。但LSA-20树脂对岗梅总皂苷的比吸附量与解析率不是很高，纯化后总固形物中岗梅根总皂苷含量亦不算高。
现有技术中岗梅总皂苷的提取精制工艺是以岗梅总皂苷的含量作为指标来考察的，对岗梅总皂苷的标定均采用人参皂苷Re为对照品。人参皂苷Re与岗梅总皂苷显色后的紫外-可见吸收曲线两者基本一致，在无岗梅特征性皂苷ilexosideX X IX作为对照品的前提下，通常以人参皂苷Re为对照品标定岗梅总皂苷。然而，一方面，以人参皂苷Re为对照品来标定岗梅总皂苷的准确度和精确度不是很高；另一方面，仅采用岗梅总皂苷的含量这一种指标来考察岗梅总皂苷提取工艺，具有模糊性，对提取工艺的验证有一定的影响。因此，急需采用更有说服力的指标，对现有的岗梅总皂苷的提取方法作出改进。
此外，现有技术对提取的岗梅总皂苷的质量检测方法尚属空白。
发明内容
本发明的目的之一即在于针对现有技术的缺陷，提供一种岗梅总皂苷的新的提取方法，该提取方法采用新的工艺参数，以岗梅总皂苷中特征性单体皂苷ilexosideX X IX和基于ilexoside X X IX标定的岗梅总皂苷的含量和保留率为指标进行考察。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案 一种岗梅总皂苷的提取方法，包括以下步骤 (1)取岗梅根或茎药材，加入4～12倍量60％乙醇提取第一次，再加2～10倍量60％乙醇提取第二次，滤过，合并滤液； (2)将步骤(1)得到的滤液减压浓缩至无醇味，加水稀释至上样浓度为0.1-0.5g生药/ml，上已预处理的AB-8大孔树脂柱； (3)水洗树脂柱至澄清，弃去过柱液及水洗液，然后用60％-80％乙醇洗脱； (4)收集60％-80％乙醇洗脱液减压浓缩，减压或喷雾干燥得岗梅总皂苷。
优选地，所述步骤(1)中加入8倍量60％乙醇提取第一次，再加6倍量60％乙醇提取第二次；所述步骤(2)中上样浓度为0.2g生药/ml；最大上样量以岗梅总皂苷计为119.43mg岗梅总皂苷计/g干树脂；所述步骤(3)中用3倍柱体积80％乙醇洗脱。
采用上述提取方法提取的岗梅总皂苷具有抗炎、镇痛、解热及抗病毒等作用，通过加入常规药用辅料可制备为用于急性咽炎和抗病毒的片剂、胶囊、颗粒、滴丸、口服液、合剂等剂型，还可作为添加剂加入饮料、牙膏、漱口水、口香糖中，用于口腔保健。
本发明的另一目的在于提供一种采用上述提取方法得到的岗梅总皂苷的质量检测方法。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案 一种岗梅总皂苷提取物的质量检测方法，包括以下步骤 (1)岗梅总皂苷的鉴别(TLC色谱鉴别) 取岗梅总皂苷提取物0.1-0.2g，加水5-15ml使溶解，用以水饱和的正丁醇提取2-3次，每次5-15ml，合并正丁醇液，加0.8％-1.2％氢氧化钠溶液洗涤2-3次，每次15-25ml，取正丁醇液用以正丁醇饱和的水洗至中性，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；同法制成岗梅对照药材溶液；照《中国药典》2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，分别吸取上述溶液各5μl点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为1∶6∶1.5∶0.7∶0.1的氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶水∶甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上，显相同颜色斑点； (2)岗梅总皂苷中ilexoside X X IX的含量测定(HPLC-ELSD) ①色谱条件 以C18柱为固定相，乙腈-0.2％甲酸为流动相，进行梯度洗脱；漂移管温度40℃，载气压力2.5bar，流速1ml/min，柱温室温；理论塔板数以ilexosideX X IX计大于4000，对称因子为0.95～1.05，与相邻峰的分离度大于1.5； ②对照品溶液的制备 取ilexosideX X IX对照品5mg，精密称定，置5ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得； ③供试品溶液的制备 取岗梅总皂苷2g，精密称定，用70％乙醇定容至100ml，微孔滤膜滤过，即得。
分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按①色谱条件测定，计算ilexoside X X IX的含量。
优选地，所述岗梅总皂苷提取物中所含ilexoside X X IX的重量百分含量为5％-15％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果 1、采用本发明大孔树脂AB-8精制工艺，经过大孔吸附树脂纯化，岗梅总皂苷和ilexosideX X IX的保留率得到了极大的提高，醇洗液中总皂苷的保留率达83.71％，ilexosideX X IX的保留率达89.46％，岗梅总皂苷和ilexoside X X IX的泄露率很低，所得提取物中总皂苷的含量可达93％，ilexoside X X IX的含量可达8％以上；； 2、本发明岗梅总皂苷的提取工艺及大孔树脂的精制工艺中采用特征性皂苷ilexoside XX IX为对照品，ilexoside X X IX与岗梅总皂苷的紫外吸收曲线一致(见图1)，同时以岗梅总皂苷的含量和ilexoside X X IX的含量为指标进行定量考察，与现有技术中仅采用人参皂苷Re来标定总皂苷相比，准确度和精确度更高，结果更具可信度。
3、本发明提供了一种岗梅总皂苷提取物的质量检测方法，HPLC-ELSD对岗梅总皂苷中ilexoside X X IX的分离效果好，灵敏度高，可用于岗梅药材及岗梅总皂苷中ilexosideX X IX的含量测定，可为岗梅总皂苷提取物的质量控制提供参考。
图1为岗梅ilexoside X X IX与岗梅总皂苷显色后在400-700nm波长的紫外吸收曲线，其中图中上面曲线为ilexoside X X IX显色后吸收曲线；下面曲线为岗梅总皂苷显色后吸收曲线； 图2为不同上样浓度对岗梅总皂苷吸附量的影响； 图3为岗梅总皂苷的动态吸附曲线； 图4为不同洗脱溶媒对岗梅总皂苷的洗脱率； 图5为不同洗脱溶媒对ilexoside X X IX的洗脱率； 图6为不同体积的洗脱溶媒对岗梅总皂苷的洗脱率； 图7为不同体积的洗脱溶媒对ilexoside X X IX的洗脱率； 图8为岗梅总皂苷提取液过柱前后的HPLC图谱，其中A为上柱液的HPLC图谱，B为洗脱液的HPLC图谱； 图9为岗梅总皂苷薄层色谱图，其中A为岗梅对照药材，B-F为岗梅总皂苷提取物。
具体实施例方式 以下结合附图和具体实施方式
来详细说明本发明。
实施例1 岗梅总皂苷的提取工艺 1、正交试验设计 分别以总皂苷和ilexoside X X IX的保留率为指标，采用四因素三水平的正交试验设计。称取岗梅药材20g，按照表1的正交设计开展实验，合并滤液，测定体积。
表1 岗梅药材提取工艺正交实验因素水平表
2、供试品溶液的制备 2.1 总皂苷供试品溶液的制备 精密量取各正交试验项下的药液适量，减压浓缩至无醇味，加水稀释至上样浓度为0.2mg生药/ml，精密量取相当于4.00g生药的浓缩液，上已预处理的AB-8大孔树脂柱(13×150mm)，用40ml蒸馏水洗至澄清，再用95％乙醇洗脱，收集醇洗液至100ml量瓶刻度，摇匀，得正交供试液。精密吸取供试液适量，置试管中，水浴蒸干，加5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，在60℃水浴中加热20min，取出，冷水冷却10分钟，加冰醋酸至5ml，摇匀，以相应试剂作空白对照，541nm处测定吸光度，即为总皂苷的含量。
2.2 ilexoside X X IX供试品溶液的制备 取各正交试验项下的药液适量，微孔滤膜滤过，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算ilexoside X X IX的含量。
色谱条件SHIMADZU高效液相色谱仪，SEDEX 75蒸发光散射检测器。N2000色谱工作站(浙江大学)，确定以Phenomenex BDS C18柱(250×4.6mm)为固定相，以乙腈-0.2％甲酸为流动相，按表2梯度洗脱。漂移管温度40℃，载气(氮气)压力2.5bar，流速1ml/min，柱温室温28℃。在以上色谱条件下测定，记录谱图，理论塔板数以ilexoside X X IX计大于4000，对称因子为0.95～1.05，与相邻峰的分离度大于1.5。 表2 梯度洗脱程序
3、正交实验结果和分析 3.1 正交试验样品总皂苷含量测定结果及分析 表3 正交实验样品总皂苷含量测定结果
3.2 正交试验岗梅ilexoside X X IX含量测定结果及分析 表4 正交实验样品ilexoside X X IX含量测定结果
以岗梅总皂苷与ilexoside X X IX的保留率，加权计算综合保留率。
综合保留率＝(总皂苷保留率+ilexoside X X IX保留率)/2表5 岗梅药材提取工艺正交实验综合保留率结果
表6 岗梅药材提取工艺正交实验综合保留率结果统计(直观分析)
表7 岗梅药材提取工艺正交实验综合保留率结果统计(方差分析)
从表5-表7综合保留率结果可知，乙醇浓度和提取次数对保留率影响较为显著，乙醇浓度中水平2保留率最高，故选择水平2(60％乙醇)。提取次数中水平1与水平2、3有显著性差异，水平2与水平3无显著性差异，故选择水平2(两次)。溶媒用量的影响较小，以水平2较大，加之提取次数选择较少的2次，故溶媒用量选择适中的水平2(8倍量，6倍量)。提取时间的三个水平之间略有差异，综合考虑选择水平2。故最佳提取工艺为8倍量60％乙醇提取1.5h，再用6倍量60％乙醇提取1h。
实施例2 岗梅总皂苷提取液的AB-8大孔吸附树脂精制工艺 1、上样浓度的考察 1.1 岗梅提取液的制备及提取液中岗梅总皂苷的测定 取岗梅药材粗粉(广州市药材公司中药饮品厂批号20080401)905g，加入8倍量的60％乙醇，加热回流1.5小时，滤过，滤渣再加入6倍量的60％乙醇，加热回流1小时，滤过，合并滤液，测定体积，得提取液11020ml，备用。测定其中总皂苷含量。
1.2 不同上样浓度的总皂苷保留率考察(离心、静态吸附) 量取岗梅提取液608.8ml(相当于含50g生药)，减压回收乙醇，浓缩至100ml(0.5g/ml)，离心(3000r/min，10min)，得上清液80ml，加水稀释到100ml，作为0.5g生药/ml供试药液。
取上述0.5g生药/ml供试药液20ml(相当于含10g生药)，水浴蒸至稠膏状，加水稀释至10ml，作为1.0g生药/ml的供试药液。
取上述0.5g生药/ml供试药液20ml，加水分别稀释至200ml、100ml、50ml作为0.05g生药/ml、0.1g生药/ml、0.2g生药/ml的供试药液。
取已预处理的AB-8大孔吸附树脂(20ml柱体积)(13*150mm)，各5份，置具塞锥形瓶中，分别加入各个不同浓度的供试药液，每隔10min震荡10s，持续2h，将树脂连同供试液倒于丁氏漏斗上，加100ml蒸馏水水洗，再用95％乙醇洗脱，收集95％乙醇洗脱液至100ml量瓶刻度。精密量取以上醇洗液各5ml，加70％乙醇稀释至10ml，作为总皂苷测定供试液，平行两份。测定其中总皂苷含量，计算AB-8大孔吸附树脂对不同上样浓度药液中总皂苷的比吸附量。结果见表8。
表8 不同上样浓度的总皂苷含量测定(离心、静态吸附)
注表中皂苷含量以岗梅生药中总皂苷百分比计。表9 不同上样浓度的总皂苷的吸附量考察
如图2和表8、9所示，不同生药浓度的岗梅澄清药液经AB-8树脂静态吸附，总皂苷的比吸附量为54.48-64.90mg/g。离心工艺对岗梅药液中总皂苷的保留率影响较大，原液经离心后，药液中总皂苷含量从3.701％降为2.713％，损失26.7％。提示离心工艺对岗梅药液中总皂苷的损失较大，在精制工艺中不宜采用。
在上柱药液浓度较高时工艺效率较高，但上柱时可能会堵柱，影响工艺连续性；浓度太低，上样液太多，影响效率。结合不同生药浓度岗梅澄清药液在AB-8树脂静态吸附的比吸附量，综合考虑工厂生产的操作可行性和生产效率，将上柱液浓度确定为0.2g生药/ml。
2、岗梅药液大孔吸附树脂精制工艺的最大上样量考察 量取岗梅提取液243.5ml(相当于20g生药)，减压回收至无醇味，加水稀释至100ml即得上柱液，过已预处理的AB-8大孔树脂柱(13mm×150mm)，收集过柱液，每2.5ml为一份，按顺序收集，共收集34管。
将过柱液1#至34#分别上已预处理的AB-8大孔吸附树脂柱(13×80mm)，水洗50ml，再用95％乙醇洗脱，收集醇洗液60ml。测定其中总皂苷和ilexoside X X IX的含量，与上柱液中含量比较，计算未吸附率，结果如下。
2.1 以总皂苷为指标的最大上样量测定表10 最大上样量考察实验中各管上柱液中皂苷浓度及未吸附率
注表中每管的体积为2.5ml，原液中皂苷浓度以7.72mg/ml计。
如图3所示，第26管总皂苷浓度为0.45mg/ml，已超过上柱液的5％(7.72mg/ml×5％＝0.39mg/ml)。树脂干重为4.04g，以5％即得泄漏点计，其最大上样量为25×0.5＝12.5g生药，相当于3.09g生药/g干树脂；以总皂苷计，其最大上样量为2.5ml×25管×7.72＝482.5mg总皂苷，相当于119.43mg总皂苷/g干树脂。
2.2 以ilexoside X X IX为指标的最大上样量测定 取10#、16#、25#、27#、34#ilexoside X X IX供试液适量，微孔滤膜滤过，测定峰面积，计算ilexoside X X IX含量。表11 最大上样量考察中各管上柱液中ilexoside X X IX浓度及未吸附率
结果显示，以5％作为泄漏点计，第34管时ilexoside X X IX未吸附率仅为3.91％，仍未超过上柱液的5％。说明以ilexoside X X IX作为指标考察树脂泄漏点有一定的缺陷，不足以全面反映总皂苷的信息，总皂苷对最大上样量的反应更为敏感，故最大上样量以总皂苷结果计。
3、洗脱溶媒种类考察 按照前期实验确定的岗梅药液最大上样量，取岗梅提取液152.2ml(相当于含12.5g生药)，减压浓缩至无醇味，得岗梅浓缩液约30ml，加水稀释至62.5ml，上已预处理的AB-8大孔吸附树脂柱(13×150mm)，用150ml蒸馏水洗至澄清，再依次以20％、40％、60％、80％、95％乙醇分别洗脱4倍柱体积，即80ml，收集醇洗液，备用。分别测定不同洗脱溶媒中总皂苷和ilexoside X X IX含量，计算总皂苷和ilexoside X X IX在不同洗脱溶媒种类中的分布，结果如下 表12 洗脱溶媒种类考察实验中岗梅总皂苷的含量测定
注表中皂苷含量以岗梅生药中总皂苷百分比计。
表13 岗梅总皂苷在不同洗脱溶媒种类中的分布
表14 洗脱溶媒种类考察实验中ilexoside X X IX的含量测定
表15 ilexoside X X IX在不同洗脱溶媒种类中的分布
从表12-15，图4-图5可以得出，在岗梅的大孔树脂精制工艺的洗脱溶媒种类考察中，就总皂苷而言，60％乙醇可累积洗脱下约89％的皂苷，而80％乙醇可累积洗脱下约98.5％的皂苷，接近洗脱完全；就ilexoside X X IX而言，60％乙醇可累积洗脱下几乎100％的ilexosideX X IX，接近洗脱完全。综合考虑工艺成本与洗脱效率，选择80％乙醇为岗梅的大孔树脂精制工艺的洗脱溶媒。
4、洗脱溶媒用量考察 按照以上最大上样量实验确定的岗梅药液上样量，精密量取岗梅提取液152.2ml(相当于12.5g生药)，减压浓缩至无醇味，加水稀释至62.5ml，上已预处理的AB-8大孔树脂柱(13×150mm)，用150ml的蒸馏水水洗至澄清，用80％乙醇洗脱，每一倍柱体积(20ml)分别收集，共收集6倍柱体积，备用。分别测定其中中总皂苷和ilexoside X X IX含量，计算总皂苷和ilexoside X X IX在不同用量洗脱溶媒中的分布，结果如下 表16 洗脱溶媒用量考察实验中岗梅总皂苷的含量测定
注表中皂苷含量以岗梅生药中总皂苷百分比计。 表17 岗梅总皂苷在不同洗脱溶媒用量中的分布
表18 洗脱溶媒用量考察实验中ilexoside X X IX的含量测定
注表中皂苷含量以岗梅生药中ilexoside X X IX百分比计。
表19 ilexoside X X IX在不同洗脱溶媒用量中的分布
如表16-表19，图6-图7所示，就总皂苷而言，三倍柱体积的80％乙醇能洗脱下绝大多数(97％)的总皂苷，而更多洗脱溶媒仅能增加少量的总皂苷；就ilexoside X X IX而言，三倍柱体积的80％乙醇能洗脱下绝大多数(99％)的ilexoside X X IX，而更多洗脱溶媒仅能增加少量的ilexoside X X IX，综合考虑总皂苷保留率和生产成本，确定洗脱溶媒用量为三倍柱体积。
实施例3 岗梅总皂苷提取液AB-8大孔树脂精制工艺的验证 1、岗梅提取液的制备及提取液中岗梅总皂苷和ilexoside X X IX的测定 按拟定条件，取岗梅药材粗粉(广州市药材公司中药饮品厂，批号20080401)250g，加入8倍量的60％乙醇，加热回流1.5小时，滤过，滤渣再加入6倍量的60％乙醇，加热回流1小时，滤过，合并滤液，测定体积，得提取液3016ml，备用。测定其中岗梅总皂苷和ilexosideX X IX的含量。
2、岗梅AB-8大孔吸附树脂精制工艺验证 按照实施例2确定的岗梅药液大孔树脂最大上样量，取岗梅提取液1508ml，相当于含125g生药，减压回收至无醇味，得岗梅浓缩液约250ml，加水稀释至625ml，过已经预处理的AB-8大孔吸附树脂，流速为1ml/min，收集过柱液；续用蒸馏水水洗，洗至澄清，收集水洗液1026ml；再用80％乙醇洗脱，收集三倍柱体积，即600ml，备用。分别测定上柱液、过柱液、水洗液及醇洗液中总皂苷和ilexoside X X IX含量，结果如下 表20 树脂精制工艺验证实验中岗梅总皂苷的含量测定及保留率
注表中皂苷含量以岗梅生药中总皂苷百分比计。
表21 树脂精制工艺验证实验中ilexoside X X IX的含量测定及保留率
*表示与上柱液比较，表中皂苷含量以岗梅生药中总皂苷百分比计。
上柱液和洗脱液的HPLC图谱见图8，图8表明醇洗液中基本保留上柱液HPLC图谱中特征峰所代表的成分。
3、过柱前后得膏率的变化验证 精密量取60％乙醇提取液120.6ml(相当于10g生药量)两份，从醇洗脱液中精密量取48ml(相当于10g生药量)两份，减压回收乙醇至流浸膏，分别转移至已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，置烘箱105℃烘至恒重，称重，计算得膏率。结果见表22。 表22 过柱前后固形物得率测定
采取精制工艺已确定的参数，经过大孔吸附树脂纯化，醇洗液中总皂苷的保留率达83.71％，ilexoside X X IX的保留率达89.46％，过柱液中总皂苷泄漏了5.62％，水洗液中总皂苷泄漏了1.31％，过柱液中没有ilexoside X X IX的泄露，水洗液中仅有0.57％的泄露。计算结果显示过柱前岗梅提取液的固形物得率为7.76％，提取液固形物中总皂苷理论含量为1×3.826％/(1×7.76％)＝49.31％，ilexoside X X IX理论含量为1×0.455％/(1×7.76％)＝5.87％；过柱后岗梅醇洗脱液的固形物得率为3.68％，醇洗脱液固形物中总皂苷理论含量为1×3.203％/(1×3.68％)＝87.03％，固形物中ilexoside X X IX理论含量为1×0.398％/(1×3.68％)＝10.83％。
实施例4 岗梅总皂苷提取物的质量检测方法的方法学验证 鉴别(TLC色谱鉴别) 取岗梅总皂苷提取物0.1g，加水10ml使溶解，用以水饱和的正丁醇提取2次，每次10ml，合并正丁醇液，加1％氢氧化钠溶液洗涤2次，每次20ml，取正丁醇液用以正丁醇饱和的水洗至中性，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。同法制成岗梅对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VIB)试验，分别吸取上述溶液各51点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(1∶6∶1.5∶0.7∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色斑点，见图9。
含量测定(HPLC-ELSD) 1、对照品溶液的制备 取ilexoside X X IX对照品(ilexoside XXIX，纯度为98.9％)5mg，精密称定(4.92mg)，置5ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得每1ml含有ilexosideX X IX0.984mg的对照品溶液。
2、供试品溶液的制备 取岗梅总皂苷提取物约2g，精密称重，用70％乙醇定容至100mL，即得岗梅总皂苷提取物供试品溶液。
3、标准曲线的绘制 分别精密吸取上述对照品溶液1μl、2μl、4μl、10μl、25μl、30μl注入液相色谱仪，测定峰面积。以进样量的自然对数为横坐标，峰面积的自然对数为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为y＝1.3535x+4.7495，r＝0.9998，表明ilexoside X X IX进样量在0.984μg～29.52μg范围内的自然对数值与峰面积的自然对数值成良好线性关系。
4、精密度试验 精密吸取对照品溶液10μl，在上述色谱条件下，重复注入液相色谱仪6次，测定峰面积，计算ilexoside XXIX的含量，RSD为1.58％。
5、重复性试验 制备岗梅总皂苷提取物供试品溶液各6份，按“3”项下操作，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，计算ilexoside XXIX的含量，RSD为1.06％。
6、稳定性试验 精密吸取岗梅总皂苷提取物的供试品溶液各10μl，分别在0、2、4、8、12、24、48h进样，计算ilexoside XXIX含量，RSD为1.37％。结果表明供试品溶液在48h内保持稳定。
7、加样回收率试验 取已知含量的岗梅总皂苷提取物约0.1g，各六份，精密称定，分别精密加入ilexosideX XIX 8mg，按“2”项下供试品溶液制备方法制备，HPLC测定ilexoside XXIX含量，计算加样回收率。其平均回收率为100.4％，RSD为1.43％。
8、样品的测定 取岗梅总皂苷提取物约2g，精密称定，用70％乙醇定容至100ml，微孔滤膜滤过，注入液相色谱仪，按拟定色谱条件，测定峰面积，计算ilexoside XXIX的含量。结果见表23。
表23 岗梅总皂苷提取物中ilexoside XXIX含量测定结果(％)
HPLC-ELSD检测方法对岗梅中ilexoside XXIX分离效果好，灵敏度高，可用于岗梅总皂苷提取物中ilexoside XXIX的含量测定。
实施例5 岗梅总皂苷及ilexoside X X IX的药理作用 一、ilexoside X X IX的药理作用(ilexoside错误！未找到引用源。对醋酸致腹腔毛细血管通透性增加试验) 1.1 受试药物 岗梅ilexoside X X IXilexoside错误！未找到引用源。，纯度为98.9％。
1.2 造模及对照药品 阿司匹林，新乡中杰药业有限公司生产，配成0.5％的混悬液备用。
1.3 试验仪器 Mettler toledo(AB204-N)万分之一电子天平；Mettler toledo(CP225D)十万分之一电子天平；Thermo(Heλios-γ)紫外分光光度仪； 1.4 实验动物 小鼠为昆明种，SPF级动物，小鼠，雌雄各半(由广州中医药大学实验动物中心提供。) 1.5 实验环境 广州中医药大学动物实验环境设施清洁级动物房。
2.实验方法 2.1 实验用动物及分组 小鼠，雌雄各半，分为3组，每组15只，分别为空白对照组，阳性药阿司匹林对照组，ilexoside错误！未找到引用源。药物组。
2.2 给药时间和给药剂量 每天灌胃给药1次，连续给药7天，空白对照组给予相同体积的蒸馏水。阳性对照组给阿司匹林，各给药组给药剂量分别为20ml/kg。
2.3 试验方法 末次给药后0.5h，尾静脉注射1％伊文思蓝生理盐水溶液0.1ml/10g，并即刻腹腔注射0.6％醋酸0.2ml/只，20min后，处死小鼠(掐死)，剪开腹腔，用5ml生理盐水冲洗腹腔数次收集洗涤液，1000r/min离心5min，用紫外分光光度计于590nm波长处测吸收度，比较组间差异，进行t检验分析，结果见表24。
3.实验结果表24
注给药组、阳性对照组分别与空白对照组比较。
结论与空白对照组比较，ilexoside错误！未找到引用源。组具有抑制毛细血管通透性的作用，有一定的抗炎效果。
二、岗梅总皂苷的药理作用 I.抗病毒作用 1 实验材料 1.1 药物名称 岗梅总皂苷，由广州中医药大学新药开发研究中心提供，批号20091101。
含量每克药粉(未添加辅料)含生药27g 1.2 动物 NIH小鼠由广东省医学动物实验中心提供，小鼠饲料为广州中医药大学实验动物中心提供的富含多种营养成分的配方。饲养环境室温为23±2℃，相对湿度为75±10％。
1.3 毒种 甲I型流感病毒FMI株，由中国药品生物检定所提供，经小鼠增强毒力后，于鸡胚尿囊腔传代2次，并测定其半数致死量。
1.4 器材 YJ-875医用净化工作台，苏州净化设备公司；压力蒸汽灭菌器，上海南华医疗器械厂；超纯水器，Millipore；超低温冰箱，Sanyo日本；万分之一电子分析天平，FA/JA系列，上海良平仪器仪表有限公司；乙醚，天津化学试剂有限公司； 0.9％生理盐水，开开援生物制药有限公司；架盘药物天平，福州天平仪器厂； 平皿，解剖剪，眼科镊，一次性注射器等。
2.1 稀释病毒 实验前，取毒种流水冲浸融化，以无菌生理盐水稀释成每0.05ml含15个LD50，放冰水中保存。
2.2 感染小鼠 把小鼠随机分组，分阳性药物组(病毒唑)、病毒对照组及试验药物组，雌雄各半。在乙醚轻度麻醉下，用已滴定流感病毒液滴鼻感染，每鼠4滴，约0.05ml。同时设正常小鼠对照组。
2.3 给药 按照体表面积法计算岗梅总皂苷及阳性药的用药剂量，药物分为高、中、低剂量组给药，分别为20g/kg、10g/kg、5g/kg生药。阳性药物对照组用药量为0.07g/kg。以上药物均在病毒攻击前一天开始给药。共给药5天，每天一次，灌胃0.3ml给药。
2.4 测定肺指数 感染后四天，杀剖小鼠，杀剖前禁食禁水4小时以上。称鼠体重，腋下动脉放血处死后取出鼠肺，记录病变程度，结果判断标准同前，将肺放在盛有0.9％生理盐水的平碟中洗涤二次，用吸水纸吸干表面水分，称出肺重。按以下公式计算出肺指数与肺指数抑制率 肺指数＝(小鼠肺重/小鼠体重)×100 肺指数抑制率＝[(模型对照组平均肺指数-实验组平均肺指数)/模型对照组平均肺指数]×100 3 统计学处理 对所得实验数据以SPSS12.0进行t检验，求统计学的显著性。
4 实验结果表25 岗梅总皂苷对流感病毒致小鼠肺炎的抑制作用结果
注与病毒对照组相比*p＜0.01， 结果表明岗梅总皂苷提取物能改善小鼠感染甲I型流感病毒的肺指数，肺指数抑制率具有量效关系，提示岗梅总皂苷提取物具有体内抗流感病毒作用。
II.抗炎试验 1、实验材料 1.1 受试药物 名称岗梅总皂苷提取物，由广州中医药大学新药开发研究中心提供，批号20091101。
含量每克药粉(未添加辅料)含生药27g 配制方法以蒸馏水稀释至所需浓度 给药途径灌服给药 临床剂量30g生药/60Kg/天，即0.5g生药/Kg/天。
1.2 造模及对照药品 醋酸泼尼松片，由广东华南药业有限公司生产，5mg/片岗梅总皂苷提取物20、10、5g生药/kg，阳性对照组灌服醋酸泼尼松(强的松)10mg/kg，每天给药一次，连续5天；空白对照组灌服等体积蒸馏水。于末次给药后30min，在每鼠左足跖皮下注射1％角叉菜胶混悬液0.08ml，用自制测容积玻璃容器测量给药后30min、1h、2h、4h、6h足跖肿胀程度，按以下公式计算肿胀率和抑制率，t检验，结果见表3。
3、实验结果 表26 岗梅总皂苷提取物对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀的影响(x±s)
注给药组、阳性对照组与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
4.结论 表26表明与空白对照组比较，岗梅总皂苷提取物20、10、5g生药/kg均可以明显地抑制角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀(p＜0.01～0.05)。
提示岗梅总皂苷提取物具有抗炎作用。
III、镇痛试验(热板法、热水缩尾法) 1.实验材料 1.1 受试药物 同抗炎试验。
1.2 造模及对照药品 消炎痛，为中山市三才医药集团有限公司生产，25mg/片 1.3 试验仪器 同抗炎试验。
1.2 造模及对照药品 消炎痛，为中山市三才医药集团有限公司生产，25mg/片 1.3 试验仪器 电热恒温水浴锅，由上海医疗器械二厂生产。
秒表、自制药盒(装小鼠，一侧剪成栅栏供抓着用，底部留空供甩尾用)。
2.实验方法 2.1 将体重在20±2g的雌性小鼠置于55℃±0.5℃的金属板上，以小鼠舔后足为疼痛反应信号，以疼痛反应潜伏期为痛阈指标，给药前测两次(间隔5min)，以其均值作为基础痛阈，选择痛阈值在5～30秒的小鼠50只，随机均分为5组(n＝10)。药物组分别灌服岗梅总皂苷提取物20、10、5g生药/kg，阳性对照组灌服消炎痛8.33mg/kg，每天给药一次，连续3天；空白对照组灌服等体积蒸馏水。于末次给药后1小时测痛阈值两次(间隔5min)，取平均值，计算前后痛阈值之差，即痛阈提高值，t检验，见表27。
2.2 将体重在20±2g的昆明小鼠尾浸入50℃恒温水浴3cm，记录缩尾潜伏期为痛阈指标，给药前测两次(间隔5min)，以其均值作为基础痛阈，选择痛阈值在5～30秒的小鼠50只，雌雄各半，随机均分为5组(n＝10)。各组给药情况同上。于末次给药后1小时内测痛阈值两次(间隔5min)，取平均值。计算前后痛阈值之差，即痛阈提高值，进行t检验，见表28。
3.实验结果 表27 岗梅总皂苷提取物对热板法所致小鼠疼痛的影响(x±s)
注给药组、阳性对照组与空白对照组比较。表28 岗梅总皂苷提取物对热水法所致小鼠缩尾的影响(x±s)n＝10
注给药组、阳性对照组与空白对照组比较。
4.结论 表27表明与空白对照组比较，岗梅总皂苷提取物20、10g生药/kg可延长热板所致小鼠舔后足反应的潜伏期(p＜0.05)，5g生药/kg也有一定镇痛作用，但差异无显著性意义(P＞0.05)。
表28表明与空白对照组比较，岗梅总皂苷提取物20、10g生药/kg可延长热水所致小鼠缩尾潜伏期(p＜0.05)，5g生药/kg也有一定镇痛作用，但差异无显著性意义(P＞0.05)。
实验提示岗梅总皂苷提取物有延长热水致小鼠缩尾潜伏期和热板致小鼠舔后足反应的潜伏期作用，表明岗梅总皂苷有镇痛作用。
IV、解热试验(岗梅总皂苷提取物对2，4-二硝基苯酚所致大鼠发热的影响) 1.实验材料 1.1 受试药物 同抗炎试验。
1.2 造模及对照药品 2，4-二硝基苯酚(C.P)，由上海试剂三厂生产 阿司匹林，由石家庄神威药业股份公司生产 1.3 试验仪器 欧姆龙电子体温计(精密度为0.05℃)，由日本欧姆龙株式会社生产。
2.实验方法 选用体重在200±10g大鼠50只，雌雄各半，选用体温在正常范围内的大鼠，随机均分为5组(n＝10)。药物组分别灌服岗梅总皂苷提取物20、10、5g生药/kg，阳性对照组灌服阿司匹林0.1g/kg，空白对照组灌服等体积蒸馏水。一次给药后随即对大鼠背部皮下注射2％2，4-二硝基苯酚15mg/kg，于给药后30、60、120、180、240min测其肛温变化值，t检验，结果见表29。
3.实验结果 表29 岗梅总皂苷提取物对2，4-二硝基苯酚所致大鼠发热的影响(x±s)
4.结论 表29表明与空白对照组比较，岗梅总皂苷提取物20、10、5g生药/kg均可以明显地抑制2，4-二硝基苯酚所致大鼠发热(p＜0.01～0.05)。
实验提示岗梅总皂苷提取物有抑制2，4-二硝基苯酚致大鼠发热作用。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种岗梅总皂苷的提取方法，其特征在于包括以下步骤
(1)取岗梅根或茎药材，加入4～12倍量60％乙醇提取1.5-2小时，再加2～10倍量60％乙醇提取1.0-1.5小时，滤过，合并滤液；
(2)将步骤(1)得到的滤液减压浓缩至无醇味，加水稀释至上样浓度为0.1-0.5g生药/ml，上已预处理的AB-8大孔树脂柱；
(3)水洗树脂柱至澄清，然后用60％-80％乙醇洗脱；
(4)收集60％-80％乙醇洗脱液减压浓缩，干燥得岗梅总皂苷。
2.根据权利要求1所述的岗梅总皂苷的提取方法，其特征在于所述步骤(1)中加入8倍量60％乙醇提取1.5小时，再加6倍量60％乙醇提取1小时。
3.根据权利要求1所述的岗梅总皂苷的提取方法，其特征在于所述步骤(2)中上样浓度为0.2g生药/ml。
4.根据权利要求1所述的岗梅总皂苷的提取方法，其特征在于以岗梅总皂苷计，所述步骤(2)中最大上样量为119.43mg岗梅总皂苷/g干树脂。
5.根据权利要求1所述的岗梅总皂苷的提取方法，其特征在于所述步骤(3)中用3倍柱体积80％乙醇洗脱。
6.根据权利要求1-5任一项所述的提取方法所得的岗梅总皂苷在制备抗炎、镇痛、解热或抗流感病毒药物，或在制备饮料、漱口水、牙膏或口香糖日化健康产品中的应用。
7.一种岗梅总皂苷提取物的质量检测方法，其特征在于包括以下步骤
(1)岗梅总皂苷的鉴别
取岗梅总皂苷提取物0.1-0.2g，加水5-15ml使溶解，用以水饱和的正丁醇提取2-3次，每次5-15ml，合并正丁醇液，加0.8％-1.2％氢氧化钠溶液洗涤2-3次，每次15-25ml，取正丁醇液用以正丁醇饱和的水洗至中性，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；同法制成岗梅对照药材溶液；照《中国药典》2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，分别吸取上述溶液各5μl点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为1∶6∶1.5∶0.7∶0.1的氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶水∶甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上，显相同颜色斑点；
(2)岗梅总皂苷中ilexosideX X IX的含量测定
①色谱条件
以C18柱为固定相，乙腈-0.2％甲酸为流动相，进行梯度洗脱；漂移管温度40℃，载气压力2.5bar，流速1ml/min，柱温室温；理论塔板数以ilexosideX X IX计大于4000，对称因子为0.95～1.05，与相邻峰的分离度大于1.5；
②对照品溶液的制备
取ilexosideX X IX对照品5mg，精密称定，置5ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
③供试品溶液的制备
取岗梅总皂苷2g，精密称定，用70％乙醇定容至100ml，微孔滤膜滤过，即得；
分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按①色谱条件测定，计算ilexosideX X IX的含量。
8.根据权利要求7所述的岗梅总皂苷的质量检测方法，其特征在于所述岗梅总皂苷提取物中ilexosideX X IX的重量百分含量为5％-15％。
全文摘要
本发明公开了一种岗梅总皂苷的提取方法及其质量检测方法，提取方法包括步骤取岗梅根或茎药材，加入4～12倍量60％乙醇提取1.5-2小时，再加2～10倍量60％乙醇提取1.0-1.5小时，滤过，合并滤液；减压浓缩至无醇味，加水稀释至上样浓度为0.1-0.5g生药/ml，上已预处理的AB-8大孔树脂柱；水洗树脂柱至澄清，然后用60％-80％乙醇洗脱；收集60％-80％乙醇洗脱液减压浓缩，干燥得岗梅总皂苷；质量检测方法包括TLC色谱鉴别和岗梅总皂苷中ilexosideX XIX的含量测定。采用本发明的精制工艺，岗梅总皂苷和ilexosideX XIX的保留率得到了极大的提高，所得提取物中纯度更高；所得岗梅总皂苷具有抗炎、镇痛、解热及抗病毒等作用；采用特征性皂苷ilexoside X XIX为对照品，准确度和精确度更高，结果更具可信度；岗梅总皂苷提取物的质量检测方法可为岗梅总皂苷提取物的质量控制提供参考。
文档编号G01N30/90GK101766664SQ201010120930
公开日2010年7月7日 申请日期2010年3月4日 优先权日2010年3月4日
发明者张军, 张晓琦, 李润美, 汤毅, 叶文才, 赖小平 申请人:广州中医药大学