专利名称：一组用于肺癌患者的血清代谢生物标志物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组用于肺癌患者的血清代谢生物标志物。本发明涉及在识别患有肺癌的个体方面表现出独特优势的生物标志物的鉴定和选择。本发明进一步涉及用于诊断肺 癌的生物标志物的有用组合。
背景技术：
肺癌是我国最具危害性的恶性肿瘤，随着我国工业化的进展，发病率还在逐年上 升。该病治愈率低，而且预后极差。早期诊断依据的缺乏是主要原因之一。已经有研究使 用基因组、蛋白组技术，发现了多种关键细胞内信号通路(如EGRF)的生物标志，可能与肺 癌的药物敏感性和预后有关，但是由于以下原因第一，临床使用的价值目前还未取得完全一致。而且上述绝大多数研究对象是国 外肺癌人群，事实上，不同人群的遗传差异非常明显，因此不能完全依据上述研究的结果。 例如大多数回顾性研究已经发现，非小细胞肺癌患者中EGFR突变率在北美和西欧为10%， 而亚洲一般为30-50%，有的超过75%，Gefitinib, Erlotinib的高敏感性与EGFR突变明 显相关。第二，近年来随着高通量高分辩蛋白质组学技术的发展，已有大量关于筛选肿瘤 侯选生物标志物方而的报道，但是由于肺癌的异质性(heteorogeniety)较强，肺癌的一般 蛋白质组学研究相对较少，也导致目前被美国FDA批准的可以在临床上常规应用的生物标 志物中没有一项是针对肺癌的。因此，发现新的肺癌生物标志物，并与TNM分期系统协同评 估来用于肺癌的个体化治疗也是一个重大的研究方向。第三，现今大多数抗癌药物都有严重毒副作用，在进行单一化疗或联合治疗时经 常面对癌细胞耐药性问题；如果能发现与抗肿瘤药物作用机制密切相关的蛋白质，就可能 以此为靶点设计联合用药的新方案。基于核磁共振(NMR)方法的代谢组学，主要利用核磁共振技术和模式识别方法对 生物体液和组织进行系统测量和分析，并动态跟踪检测、定量和分类生物体中随时间改变 的代谢产物。若将代谢信息与病理生理过程中的生物学事件关联起来，则可以确定相关的 生物标志物。在恶性肿瘤研究中，代谢组学最为广泛的应用是发现与肿瘤诊断、治疗相关 的代谢标记物。现有的以基因表达产物为主的肿瘤标记物检出率较低，所以临床应用受到 限制；与之相比，代谢组学方法鉴定的代谢肿瘤标志物却包括体内丰度很高的小分子，如胆 碱，丙氨酸等，使肿瘤的诊断、治疗的个体化成为现实。2005年欧洲肿瘤学年会中提出运用 核磁共振波谱作为脑瘤、乳腺癌、前列腺癌的诊断方法的提案。Pfizer和Pharmacia等六家 制药公司和Nicholson所在的英国伦敦帝国理工大学联合组成了 COMET联盟，主要利用IH NMR和模式识别技术进一步寻找各类生物标记物并建立药物的毒性评价系统等。肺癌病人的血清蛋白质与代谢物谱具有适合早期诊断的优点，由于癌细胞的加速 和非控制性生长的需要，癌细胞的代谢活动必然会有别于正常细胞，且代谢活动的异常会 先于形态异常(即肿瘤)表现出来。即在还没有形成肺癌病变组织之前就已经有代谢表达异常。如在合成代谢条件下，很多肿瘤表现出葡萄糖摄入增加以及糖酵解增强的现象，致使乳酸盐分泌增高；癌细胞快速生长所依赖的蛋白质、糖类、脂类和核酸等生物大分子的需要 量增多，也使合成代谢明显增强，因此血清代谢标志物更易于临床分析，更易于实现肺癌的 早期诊断。现有的肿瘤标志物主要以基因表达产物、蛋白类为主，这种标志物检出率低，无法 达到早期诊断的目的。目前已经有来自美国的关于肺癌的代谢物谱的研究报道，但是这些 研究还仅限于肿瘤组织和非肿瘤组织的对比，尚未有血清中代谢标志物的研究。本发明应用现代组学研究技术与肺癌的临床实践相结合，对肺癌病人的血清蛋白 质与代谢物谱进行研究，发现一组可用于早期诊断及治疗的生物标志物。
发明内容
本发明的目的针对我国肺癌人群，采用基于核磁共振(NMR)方法的代谢组学与 肺癌的临床实践相结合，对肺癌病人的血清蛋白质与代谢物谱进行研究，寻找出一组用于 肺癌患者的血清生物标志物以用于肺癌的早期诊断与个体化治疗。本发明的技术方案1、采用预饱和法压制水峰，Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)脉冲序列抑制血 清中较宽的共振信号，观测小分子代谢物。对所获谱图进行相位和基线校正后，参照乳酸的 甲基共振峰(CH3, δ 1. 30)对1H NMR谱的化学位移进行定标，并对肺癌患者和健康志愿者血 清1H NMR中尖峰信号进行归属。2、采用SIMCA-P软件进行主成分分析，求出主成分(principal components,PC)， 对肺癌患者和正常对照者的血清的NMR数据进行分析。3、从因子载荷图中观察离群的化学位移值，并对这些化学位移值相对应的代谢物 进行指认。通过对肺癌引起的代谢物的变化研究，来寻找肺癌血清生物标志物，为肺癌的早 期诊断、预后和治疗提供一定的科学依据。将癌症患者和对照者的血清分别与D2O混合制成样品溶液，放入高场NMR谱仪中， 获得1H NMR谱。将样品氢谱数据导入SIMCA-P软件进行模式识别分析。研究发现，肺癌患 者的血清与正常人群相比，有数种代谢物水平表现明显偏高，包括乳酸，葡萄糖，丙氨酸， 缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甘氨酸，谷氨酸盐，脯氨酸，乙酰醋酸盐，糖蛋白，胆碱，3-羟基丁 酸。其中葡萄糖，乳酸的水平因受个人因素影响较大，如饮食、运动等，而不适于作为标志 物；但其他小分子代谢物较稳定，受外界环境影响较小，可作为临床诊断标志物。这些标志 物，全部或其中一部分组合如果高于正常人将导致整个代谢物图谱明显异于正常人。由此， 建立了模型将肺癌患者与正常人的血清加以甄别，分成两类。按此模型，将疑似肺癌病例的 血清套入模型进行分析，如果发现该患者血清图谱落入其中一类，即可诊断为肺癌或正常。本发明指认的一组用于肺癌早期诊断和辅助治疗的血清代谢生物标志物，包括 丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甘氨酸，谷氨酸盐，脯氨酸，乙酰醋酸盐，糖蛋白，胆碱， 3_羟基丁酸的一种或二种以上的有用组合。本发明所述的一组用于肺癌早期诊断和辅助治疗的血清代谢生物标志物，优选丙 氨酸和甘氨酸的组合。本发明所述的一组用于肺癌早期诊断和辅助治疗的血清代谢生物标志物，优选亮氨酸和异亮氨酸的组合。本发明的一组用于肺癌早期诊断和辅助治疗的血清代谢生物标志物，其血清样本是对个体空腹取血，离心分离得到的血清样本。只需要就医者提供一般的静脉采血，普通生 化检验之后所余血清即可满足本发明所需样品。本发明的一组用于肺癌早期诊断和辅助治疗的血清代谢生物标志物的用法，其特 征在于，将个体血清样本中代谢生物标志物的代谢水平与该代谢生物标志物在正常人群中 的代谢水平相比较，实现个体正常或异常的判断。本发明的一组用于肺癌早期诊断和辅助治疗的血清代谢生物标志物的用法，将其 中两种或多种血清代谢生物标志物联合用于早期肺癌的诊断及肺癌肿瘤程度的预测。通 过分析由肺癌引起的血清代谢生物标志物代谢产物的变化，可以更好的理解个体的病变过 程，有助于辅助临床诊断。本发明的一组用于肺癌早期诊断和辅助治疗的血清代谢生物标志物的用法，将病 例血清样本中一组代谢生物标志物的代谢水平与该代谢生物标志物在正常人群中的代谢 水平相比较，如果两组标志物的代谢水平具有明显的差别，即可作出肺癌的诊断和辅助诊 断。
图1、肺癌患者(case group)血清的1H NMR特征谱全谱2、健康人群(control group)血清的1H NMR特征谱全谱3、肺癌患者血清的1H NMR特征谱局部放大4、健康人群血清的1H NMR特征谱局部放大5、肺癌患者血清的1H NMR特征谱局部放大6、健康人群血清的1H NMR特征谱局部放大7、肺癌患者和健康人群两组血清代谢组PCA分值(t[l]vs t[2])散点分布图， 其中A组为病例组，C组为健康人群图8、A、C组血清1H NMR的积分数据的PClvs. PC2因子载荷图，数字代表化学位移。
具体实施例方式按照前述的技术方案进行1.对肺癌患者和健康人群清晨空腹取血，4°C下静置lh，8000r/min离心分离得到
血清样品。2.采用预饱和法压制水峰，Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)脉冲序列抑制血 清中较宽的共振信号，观测小分子代谢物。对所获谱图进行相位和基线校正后，参照乳酸的 甲基共振峰(CH3, δ 1. 30)对1H NMR谱的化学位移进行定标，并对肺癌患者和健康志愿者血 清1H NMR中尖峰信号进行归属。3.将各个样品的氢谱以0. 04ppm为单位将64K个数据点的1H NMR划分成多个等 宽的区域，并对各个区域进行分段积分。4.采用SIMCA-P软件将病例样品1H NMR的积分数据套入模型进行分析，求出主成 分(principal components，PC)，如果发现该患者血清图谱落入其中一类，即可诊断为肺癌或正常。然后对肺癌患者和正常对照者的血清的NMR数据进行分析，绘制肺癌患者和健康人群两组血清代谢组PCA分值(t[l]vs t[2])散点分布图和PClvs.PC2因子载荷图。5.从因子载荷图中观察离群的化学位移值，并对这些化学位移值相对应的代谢物 进行指认。如果差异代谢物的指认结果和已筛选的肺癌代谢生物标志物中一种或多种相 同，即可诊断为肺癌，根据代谢物的差异水平还可以预测肺癌肿瘤的发展程度。实施例11.材料与方法血液样品选自于湖北某肿瘤医院的肺癌患者。400 μ 1的血清与100 μ 1的D2O混 合制成血清样品，放入Varian INOVA 600MHz NMR谱仪中，以获得核磁共振的氘锁信号即1H 匪R谱。2. NMR谱图的数据整理利用软件对所有谱图数据进行相位校正和基线校正，并对血清中代谢物的化学位 移和多重性进行归属。肺癌患者(case group)和健康人群(control group)血清的1H NMR 特征谱全谱图见图1-6 ；肺癌患者和健康人群血清1H NMR中部分尖峰信号的归属结果见表 1 ；然后，对各个样品的氢谱进行桶形积分，划分成多个等宽区域，并将这些分段积分数据进 行归一化处理，抵消各样品间在总体浓度中的浓度差异。再把数据导入SIMCA-P软件中进 行模式识别分析。表 1
代谢物Metabolite1H化学位移(ppm)、多重性及归属
0.96(d, CH3)
缬氨酸Valine1.01(d, CH3)
3.54(d，α-CH)
中一1.28(d, CH3)
苏氨酸Threonine
3.56(d, α-CH) 1.30(d, CH3)
乳酸Lactate
4.09(q，CH)
丙氨酸Alanine1.45(d，CH3)
醋酸盐acetate1.89(s)
丙酮acetone2.20(s)
肌氨酸酐Creatinine3.02(s)
谷氨酸盐Glutamine2.40(m)
异亮氨酸Isoleucine0.92(t, CH3)0.98(d，CH3)
亮氨酸Leucine0.93(d)
精氨酸Arginine3.22⑴
氧化三甲胺TMAO3.24(s) β-葡萄糖β-Glucose，4.62 (d)
α-葡萄糖α-Glucose5.21 (d)
赖氨酸Lysine3.75(d, α-Η)
脯氨酸Proline3.35(d，δ-Η)
肌醇Myo-inositol3.51(m)
3-羟丁酸盐3-hydroxylbutyrate1.17(d)
甲酸盐formate8.43(s)
二甲胺dimethylamine2.70(s)
三甲胺trimethylamine2.79 (s)3.模式识别分析对谱图进行处理后，用SIMCA-P软件对数据进行主成分分析。方法的特点是将分 散在一组变量上的信息集中到几个综合指标即主成分(principal component,PC)上，用较 少的综合性的关键性变量替代原来众多的相关性变量，对数据进行降维处理。肺癌患者和 健康人群血清的1H NMR积分数据主成分分析结果如下图7为肺癌患者和健康人群两组血清代谢组PCA分值(t[l]vs t[2])散点分布图， 其中A组为病例组，C组为健康人群，从图7中可以看到病例组A组集中分布在椭圆散点分 布图的右侧，正常对照组集中分布在散点分布图的左侧，两组沿PC2的方向分开，且两组间 并无明显的交叉和重叠，表明肺癌患者和健康人群的血清代谢物之间存在一定的差异。图 8为A、C组血清1H NMR的积分数据的PClvs. PC2因子载荷图，数字代表化学位移，根据核磁 共振信号的归属结果(表1)可以推断出相应的代谢物，从图8中可以看到大部分化学位移 点相对比较集中，重叠在一起，样本间高度相似，即具有相同的代谢产物，只有少数点远离 重叠点，比较分散，正是这些离群点所代表的化合物造成了 A、C两组血清代谢物上的差异， 因此，A、C两组血清中改变较明显的代谢组分有3-羟丁酸盐(δ 1. 18)、丙酮(δ 2. 22)、三 甲胺(δ 2. 82)、醋酸盐(δ 1.90)、乳酸(δ 1.30,4. 1)等。本发明将肺癌患者血清与正常人群相比，有多种代谢物的水平表现明显异常，包 括乳酸，葡萄糖，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甘氨酸，谷氨酸盐，脯氨酸，乙酰醋酸 盐，糖蛋白，胆碱，3羟基丁酸；其中葡萄糖，乳酸的水平因受个人因素影响较大，如饮食、运 动等，而不适于作为标志物；但其他小分子代谢物较稳定，受外界环境影响较小，可作为临 床诊断标志物。确认标志物直接关系到肺癌的早发现早治疗及早期诊断标，这将极大地提 高这一类患者的疗效，甚至可以有效防止癌变的发生。
权利要求
一组用于肺癌患者的血清代谢生物标志物，其特征在于，该标志物包括丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甘氨酸，谷氨酸盐，脯氨酸，乙酰醋酸盐，糖蛋白，胆碱，3-羟基丁酸的一种或二种以上的组合。
2.如权利要求1所述的一组用于肺癌早期诊断和辅助治疗的血清代谢生物标志物，其 特征在于该标志物为丙氨酸和甘氨酸的组合。
3.如权利要求1所述的一组用于肺癌早期诊断和辅助治疗的血清代谢生物标志物，其 特征在于该标志物为亮氨酸和异亮氨酸的组合。
4.如权利要求1-3任一项所述的一组用于肺癌早期诊断和辅助治疗的血清代谢生物 标志物，其特征在于，其血清样本是对个体空腹取血，离心分离得到的血清样本。
5.权利要求1-3任一项所述的一组用于肺癌早期诊断和辅助治疗的血清代谢生物标 志物的用法，其特征在于，将个体血清样本中代谢生物标志物的代谢水平与该代谢生物标 志物在正常人群中的代谢水平相比较，实现个体正常或异常的判断。
6.权利要求1所述的一组用于肺癌早期诊断和辅助治疗的血清代谢生物标志物的用 法，其特征在于，将其中两种或多种血清代谢生物标志物联合用于早期肺癌的诊断及肺癌 肿瘤程度的预测。
7.权利要求1-3任一项所述的一组用于肺癌早期诊断和辅助治疗的血清代谢生物标 志物的用法，其特征在于，将病例血清样本中一组代谢生物标志物的代谢水平与该代谢生 物标志物在正常人群中的代谢水平相比较，如果两组标志物的代谢水平具有明显的差别， 即可作出肺癌的诊断和辅助诊断。
全文摘要
一组用于肺癌患者的血清代谢生物标志物。癌症患者和对照者的血清分别与D2O混合制成样品溶液，采集1H NMR谱。将样品氢谱数据导入SIMCA-P软件进行模式识别分析。肺癌患者的血清与正常人群相比，有数种代谢物水平表现明显偏高，包括乳酸，葡萄糖，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甘氨酸，谷氨酸盐，脯氨酸，乙酰醋酸盐，糖蛋白，胆碱，3-羟基丁酸。其中葡萄糖，乳酸的水平因受个人因素影响较大不适于作为标志物；其他较稳定，受外界环境影响较小，作为临床诊断标志物。由此，建立模型将肺癌患者与正常人的血清加以甄别，分成两类。按此模型，将疑似肺癌病例的血清套入模型进行分析，如果发现该患者血清图谱落入其中一类，即可诊断为肺癌或正常。
文档编号G01N33/96GK101806805SQ201010126898
公开日2010年8月18日 申请日期2010年3月16日 优先权日2010年3月16日
发明者宋丹丹, 崔艳芳, 康翠欣, 王琳, 胡胜 申请人:华中师范大学