专利名称：一种土壤环境中痕量天然及合成雌激素含量的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种土壤中痕量雌激素的检测技术，特别是涉及一种采用液相色谱-串联质谱联用技术对土壤样品中痕量天然和合成雌激素含量的检测方法。
背景技术：
由人与动物卵巢分泌的天然雌激素雌酮Estrone，El)、17 β -雌二醇 (17 β-Estradiol, Ε2)和雌三醇 striol，E3)，以及作为口服避孕药主要成分的合成雌激素17 α -乙炔基雌二醇(17 α -Ethinyl Estradiol，EE2)，会随着粪尿排放进入污水处理系统或农田土壤中。雌激素的排放是不可避免的，近十年来雌激素作为典型的内分泌干扰物受到广泛关注。欧美等国对多家污水处理厂雌激素浓度及去除效率的调查结果显示，在污水处理厂出水及受纳水体中残留着ng/L浓度水平的雌激素，表明污水处理厂不能有效去除进水中的雌激素。畜禽养殖业排放的雌激素会通过堆肥施用或地表径流进入土壤及水体中。有关鱼类生殖异常现象的研究结果表明，污水处理厂受纳水体中所含ng/L浓度水平的雌激素是导致鱼类雌性化生殖异常现象的主要原因物质。近年来，食品安全问题受到人们的广泛关注，在有机粮食和有机蔬菜种植中，农家肥得到广泛应用。土壤施肥是雌激素在土壤环境中残留与增加的主要原因。研究结果表明， 当牧场施用鸡粪肥后，其地表径流中17 β -雌二醇的浓度为20 2530ng/L，而其土壤中的含量由0. 055ng/g增至0. 675ng/g，且取决于粪肥施用率及已施用时间。测定土壤中雌激素的含量，对于食品安全风险控制与评价具有重要意义。土壤中雌激素的含量与土壤的性质、 深度、有机质含量等因素有关，不同土壤的雌激素含量可能相差很大。近年来，雌激素的仪器检测技术有了很大的提高，如气相色谱-质谱联用(GC/ MS)、气相色谱-串联质谱联用(GC/MS/MS)、液相色谱-质谱联用(LC/MS)、液相色谱-串联质谱联用(LC/MS/MQ等，具有较高的灵敏度和精确度。由于土壤样品基体复杂，样品前处理技术在雌激素检测中起着重要的作用，如何高效地从土壤样品中提取雌激素，建立回收率高、重现性好、精确度及精密度高的土壤中痕量天然和合成雌激素分析方法，成为研究的关键。
发明内容
本发明的目的是针对土壤样品基体复杂，土壤中雌激素痕量存在，前处理技术难度大等问题，拟开发一种回收率高、灵敏度高、准确、快速的分析技术，实现对土壤样品中痕量天然和合成雌激素的定量测定。本发明的技术方案如下—种土壤中痕量雌激素含量的检测方法，该方法包括如下步骤(1) 土壤样品预处理取5g经冷冻干燥后土壤样品，采用快速溶剂萃取仪进行萃取，萃取剂为丙酮，其溶剂量为120-140mL，所采用的快速溶剂萃取条件为温度60°C，压力1500pis，静态提取2次，各8min。Waters公司的HLB固相萃取柱的活化顺序为5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL色谱纯甲醇及IOmL超纯水，流速为lmL/min ；取上述快速溶剂萃取仪的萃取液30mL，加入600mL 蒸馏水后混勻，采用已活化的固相萃取柱对该混合液进行固相萃取富集，控制流速为3mL/ min ；萃取结束后真空抽干HLB柱5min，以去除水分；利用2X3mL乙酸乙酯洗脱HLB柱，控制流速为lmL/min，洗脱液收集于IOmL玻璃离心管中；洗脱液在氮气流下缓慢吹干，加入 200 μ L乙腈/水(v/v) = 1 1，漩涡混合；冷藏等待浓度测定。(2)利用液相色谱-串联质谱联用分析雌激素浓度色谱柱Nova-Pak C18,3. 9mmX 150mmX 4 μ m ；梯度洗脱采用甲醇和pH = 10的氨水为流动相，甲醇的比例在0-1. 2min内由 15 % 升到 70 %, 1. 2-2. Omin 内升到 90%, 2. 0-3. Omin 内升到 98 %,3. 0-6. Imin 维持在 98%,6. 1-6. 2min内降至15%,6. 2-lOmin内维持在15%，以上百分比均为体积百分比；(3)标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定(4)样品的测定采集待测土壤样品，按步骤⑴对土壤样品进行预处理，再按步骤⑵进行液相色谱-串联质谱联用检测，并与步骤C3)得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测土壤样品中天然和合成雌激素的含量。本发明所述的方法还包括采用同样的土壤样品，采用浸泡加标方式按0.5ng/g 的添加量加入标准溶液，进行上述预处理并测定天然和合成雌激含量，进行回收率计算；本发明中所述的天然雌激素为雌酮、17 β-雌二醇和雌三醇，合成雌激素为 17 α-乙炔基雌二醇。本发明的有益效果是采用快速溶剂萃取仪进行提取，操作简单，萃取速度快，安全可靠；采用固相萃取柱进行富集，有机溶剂用量少，富集倍数高，操作简单；采用液相色谱-串联质谱联用进行检测，检测限低，具有较高的灵敏度和精确度。本发明提供一种检测限低、重现性好、灵敏度高、回收率较好、操作简单易行的分析方法，能够快速分析土壤中痕量天然和合成雌激素的含量。
图1为200ng/L标准品溶液的色谱图，出峰顺序为El :5. 48min ；E2 :5. 45min ；E3 4. 75min ；EE2 5.37min。图2为采用本发明的方法测定回收率的色谱图。
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步的描述。(1) 土壤样品预处理采集好的土壤样品先进行冷冻干燥处理。取5g冷冻干燥后的样品，以丙酮为萃取剂进行快速溶剂萃取，其溶剂量为120-140mL，得到丙酮萃取液并测量其体积。所采用的快速溶剂萃取条件为温度60°C，压力1500pis，静态提取2次，各8min。Waters公司的HLB固相萃取柱的活化顺序为5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL色谱纯甲醇及IOmL超纯水，流速为ImL/ min。取30M1上述丙酮提取液加入600mL蒸馏水后混勻，采用已活化的固相萃取柱对该混合液进行固相萃取富集，控制流速为3mL/min。萃取结束后真空抽干5min，以去除水分，利用2X3mL乙酸乙酯洗脱HLB柱，洗脱液收集于IOmL玻璃离心管中，控制流速为lmL/min。 洗脱液在氮气流下缓慢吹干，加入200 μ L乙腈/水(ν/ν) = 1 1，漩涡混合后，待测。(2)利用液相色谱-串联质谱联用分析雌激素浓度液相色谱-串联质谱联用选择的条件3200Qtrap 型液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1. 4. 1数据处理软件，美国AppliedBiosystem公司；Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，自动进样器，美国Agilent公司。色谱柱Nova_PakC18 (3. 9mmX 150mmX4 μ m) ,Waters 公司。离子源电喷雾离子化源(ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压:-4500V ；温度4500C ；源内气体1 (GSl，N2)压力45psi ；气体2(GS2，N2)压力45psi ；气帘气体(N2)压力20psi ；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N2)压力Medium。采用甲醇和PH= 10的氨水为流动相，梯度洗脱条件详见表1。表1流动相梯度条件
权利要求
1.一种土壤环境中痕量天然及合成雌激素含量的检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)土壤样品预处理取5g经冷冻干燥后土壤样品，采用快速溶剂萃取仪进行萃取，萃取剂为丙酮，其溶剂量为120-140mL，所采用的快速溶剂萃取条件为温度60°C，压力1500pis，静态提取2次， 各8min。Waters公司的HLB固相萃取柱活化的顺序为5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL色谱纯甲醇及IOmL超纯水，流速为lmL/min ；取上述快速溶剂萃取仪的萃取液30mL，加入600mL蒸馏水后混勻，采用已活化的固相萃取柱对该混合液进行固相萃取富集，控制流速为3mL/min ； 萃取结束后真空抽干HLB柱5min，以去除水分；利用2X3mL乙酸乙酯洗脱HLB柱，控制流速为lmL/min，洗脱液收集于IOmL玻璃离心管中；洗脱液在氮气流下缓慢吹干，加入200 μ L 乙腈/水(ν/ν)=1 1，漩涡混合；冷藏等待浓度测定。(2)利用液相色谱-串联质谱联用分析雌激素浓度色谱柱Nova-Pak C18,3. 9mmX 150mmX 4 μ m ；梯度洗脱采用甲醇和PH= 10的氨水为流动相，甲醇的比例在0-1. aiiin内由15% 升到 70%, 1. 2-2. Omin 内升到 90%, 2. 0-3. Omin 内升到 98%, 3. 0-6. Imin 维持在 98%, 6. 1-6. 2min内降至15%，6. 2-10min内维持在15%，以上百分比均为体积百分比。(3)标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定。(4)样品的测定采集待测土壤样品，按步骤(1)对土壤样品进行预处理，再按步骤( 进行液相色谱-串联质谱联用检测，并与步骤C3)得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测土壤样品中天然和合成雌激素的含量。
2.根据权利要求1所述土壤环境中痕量雌激素含量的检测方法，其特征在于，还包括采用浸泡加标方式测定回收率的步骤，添加量为0. 5ng/g。
3.根据权利要求1所述土壤环境中痕量雌激素含量的检测方法，其中所述的天然雌激素为雌酮、17 β -雌二醇和雌三醇，合成雌激素为17 α -乙炔基雌二醇。
全文摘要
本发明涉及一种土壤中痕量天然及合成雌激素的检测技术，特别是涉及一种采用液相色谱-串联质谱联用技术对土壤样品中痕量天然和合成雌激素含量的检测方法。本方法将采集好的土壤品进行冷冻干燥，采用丙酮进行快速溶剂萃取，得到萃取液，采用固相萃取柱浓缩富集其中的雌激素，采用乙酸乙酯将雌激素从固相萃取柱上洗脱下来，利用液相色谱-串联质谱联用分析雌激素浓度。该方法环境友好、易于操作、且回收率较高，能够快速分析土壤样品中痕量天然和合成雌激素的含量。
文档编号G01N30/72GK102236001SQ201010154070
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月23日 优先权日2010年4月23日
发明者史江红, 曹金玲, 杨志峰, 陈庆彩, 韩蕊 申请人:北京师范大学