专利名称：奶牛乳汁孕酮检测生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种奶牛乳汁孕酮检测生物传感器，用于检测奶牛乳汁孕酮水平。
背景技术：
目前我国奶牛的饲养规模不断的扩大，现在已经成为畜牧业的支柱产业，为了缩 短奶牛的产犊间隔提高奶牛的利用率，能使奶牛多产奶和多繁殖犊牛，要经常对产犊后空 怀泌乳母牛进行卵巢孕酮检查，目前在养殖现场进行卵巢孕酮检查常用的有直肠检查与采 血检查这两种方法，直肠检查法对牛的直肠粘膜卵巢等易造成机械性刺激易引起粘膜损伤 和造成出血对奶牛卵巢造成损伤，需要检查人员直检水平较高，但检查结果也不很准确；采 血检查法须将奶牛保定易造成应激有碍奶牛健康，奶牛乳汁孕酮的变化与血浆孕酮的含量 同步。所以，根据乳汁中孕酮含量可以描述出母牛生殖过程所发生的生理变化，包括黄体 的形成及其分泌活动的连续或结束等生理状态。因此，根据乳汁中孕酮含量的变化可检查 母牛的发情、妊娠诊断、产后卵巢机能活动、以及一些繁殖疾病的诊断及其治疗效果的监测 等。乳汁中孕酮含量的测定，取样方便，不损害家畜健康，不影响生产，比血浆孕酮的测定更 具有实用性。因此，采取奶牛乳汁孕酮检查法是奶牛机体孕酮含量测定的有效途径，寻求一 种奶牛乳汁孕酮生物传感器成为广大奶牛场、养殖户和兽医的祈盼。
发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的是针对上述现有的技术不足，提供一种取样方便，不损害家畜健康， 不影响生产，比血浆孕酮的测定更具有实用性的奶牛乳汁孕酮检测生物传感器。( 二 )技术方案以上为本发明目的，本发明采用如下技术方案本发明在于提供一种应用一次性丝网印刷电极研制的生物传感器，并将建立的 间接竞争ELISA法应用到生物传感器上。本发明通过抗原-抗体反应，将孕酮完全抗原修饰于丝网印刷电极上，在丝网印 刷电极上建间接竞争ELISA法。本发明所述修饰电极的孕酮完全抗原与待测抗原竞争结合孕酮单克隆抗体，辣根 过氧化物酶标记第二抗体与孕酮单克隆抗体结合。本发明建立在丝网印刷电极上的间接竞争ELISA法定量检测奶牛乳汁孕酮。本发明的制备方法是，采用丝网印刷工艺制备三电极结构的电化学传感器。首先 在PET薄膜上印刷银导电轨道，然后用碳浆印制碳电极，其中直径3mm的圆盘为工作电极， 而半环为对电极。最后，印刷绿色油墨作为绝缘层，仅露出电极和连接处。在用丝网印刷电 极制作的工作电极上滴加5 μ L P4-OVA, 37°C孵育45min ；洗涤液洗涤两次；用0. 5%牛血清 白蛋白封闭，在工作电极上滴加50μ L，37°C孵育60min ；洗涤液洗涤两次；制备好的生物传感器置于4°C密闭的环境中备用。本发明是在工作电极上滴加2. 5μ L孕酮单克隆抗体和竞争孕酮抗原5 μ L，37 °C 作用45min ；洗涤液冲洗两次；滴加酶标二抗，37°C孵育40min，洗涤液冲洗两次；在电极上 滴加底物TMB-H2O2，滴加IOOuL ；用计时电流法测定电化学信号。将所得电流值代入建立的 曲线方程求出乳汁样品中的孕酮含量。本发明的目的可通过下述技术方案实现的以酶免疫技术为基础，建立间接竞争 ELISA法定量检测奶牛乳汁孕酮，通过抗原_抗体特异性反应，将孕酮完全抗原修饰在丝网 印刷电极上制备生物传感器。可供奶牛早期妊娠诊断、发情鉴定以及相关疾病的诊断的确 诊使用，可以通过连续动态监测孕酮判断奶牛机体的生殖状态。本发明中，孕酮完全抗原修饰在丝网印刷电极上，置于37°C 45min，后用0. 5% BSA 封闭，再经过37°C恒温箱处理2h，置于4°C保存。应用该方法制备的生物传感器具有稳定性 好、操作及处理简便等优点。同时抗孕酮单克隆抗体的特异性强，降低阴性成本底，提高了 生物传感器的灵敏度，应用于孕酮的检测，能够达到检测乳汁中孕酮含量的要求。(三)有益效果本发明优越性在于生物传感器的特异性、灵敏性、重复性、稳定性、回收率的性能 参数的测定，结果表明发明方法的最低检测限可达0. 16ng/mL，批内平均差异8.2%，批间 平均差异7. 72%，回收率95. 8% 115. 7%，制备成功的生物传感器可在4°C环境中保存4 天仍能保持原有活性。经对奶样测定结果显示，均符合临床情况，说明本方法对检测奶牛 乳汁孕酮来改善奶牛繁殖具有重要的商业开发价值。
图1是本发明的操作流程示意图。图2是本发明的标准曲线示意图。
具体实施例方式下面结合附图，进一步详细说明发明所述奶牛乳汁孕酮检测生物传感器的具体实 施方式，但不用来限制本发明的保护范围。实施例一通过抗原-抗体反应，将孕酮完全抗原修饰于丝网印刷电极上，制备生物传感器。孕酮完全抗原的制备采用碳化二亚胺法，应用OVA与11 α -羟基孕酮半琥珀酸偶 联制备孕酮完全抗原，具体操作步骤如下称取Imgll α-羟基孕酮半琥珀酸(11 α-0H-P4-HS)，溶于0. 02mL 二甲基甲酰 胺(DMF)中；分别称取0. 0298mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0. 534mg 二环己基碳化二亚 胺(DCC)，各自溶于0. 004mLDMF中；将上述三种溶液混合，在室温下振荡90min ；将振荡均 勻的混合液逐滴缓慢地加入溶解于含有2. Img卵清白蛋白(OVA)的0.2mol/L磷酸盐缓 冲液(PBS)中，pH7.0，然后4°C搅拌过夜；将偶联的液体装入预先处理好的透析袋中，放 入大烧杯中透析；在透析过程中用0. lMNaHC032. 2L，透析4小时；去离子水2. 2LX3次， 透析1. 5hX3次；最后用ILPBS(pH 7. 4)透析15小时。取出偶联物11 α -0H-P4-HS-0VA, 4000rpm,离心30min，取上清分装，在_20°C冻存备用。
4
分别用稀释液稀释一定浓度的完全抗原(11 α -0H-P4-HS-0VA)，卵清白蛋白 (OVA)，孕酮-11 α -半琥珀酸酯(11 α -0H-P4-HS)包被酶标板，按照间接竞争ELISA法操 作，鉴定完全抗原免疫活性。实施例二应用生物传感器定量检测奶牛乳汁孕酮方法。如图1，采用丝网印刷工艺制备三电极结构的电化学传感器。首先在PET薄膜上 印刷银导电轨道，然后用碳浆印制碳电极，其中直径3mm的圆盘为工作电极，而半环为对电 极。最后，印刷绿色油墨作为绝缘层，仅露出电极和连接处。在用丝网印刷电极制作的工作 电极上滴加5μ L P4-0VA，37°C孵育45min ；洗涤液洗涤两次；用0. 5%牛血清白蛋白封闭， 在工作电极上滴加5(^1^，371孵育601^11;洗涤液洗涤两次；制备好的生物传感器置于4°C 密闭的环境中备用。在工作电极上滴加2.5yL孕酮单克隆抗体和竞争孕酮抗原5yL，37°C作用 45min ；洗涤液冲洗两次；滴加酶标二抗，湿盒37°C孵育40min，洗涤液冲洗两次；在电极上 滴加底物TMB-H2O2，滴加IOOuL ；用计时电流法测定电化学信号。不同浓度孕酮测定结果显示孕酮浓度与电流值呈负相关，即孕酮浓度越大，电流 值越小。如图2为了建立更好的标准曲线，实验结果以孕酮浓度的对数为横坐标，电流对数 为纵坐标，建立标准曲线。将所得电流值代入曲线方程求出乳汁样品中的孕酮含量。在本 试验中，检测限0. 16ng/ml。比较广泛的线性范围为0. 16-50ng/ml，线性回归相关系数为 0. 9957，符合相关系数大于0. 99的要求。最低检测量根据建立的标准曲线，实验用生物传感器测定了 10个经过去激素处 理的空白奶样，求出它的平均数(Xtl)和标准差(s)计算出X(I-2S，再将此值代入方程，计算 出检测的灵敏度。生物传感器的最低检测量为0. 16ng/mL。精密度在精确度的研究中，对批间变异系数和批内变异系数的竞争分析进行了 比较。基于标准曲线中，选取三种不同浓度的孕酮，0. 5ng/ml、10ng/ml和40ng/ml，表示低， 中，高浓度，进行了研究。选取在4°C保存的生物传感器，定在不同的时间即连续4天，每 天检测一次三个水平的孕酮标准品，根据间接ELISA操作程序，比较产生电流，确定变异系数。选取保存于4°C的4个批次的孕酮检测生物传感器，同时检测三个水平浓度的孕 酮乳样标准品，并设定3个重复。根据反应操作程序，比较产生电流，确定变异系数。结果 平均批内变异系数为8. 2%，平均批间变异系数为7. 72%。以上为本发明的最佳实施方式，依据本发明公开的内容，本领域的普通技术人员 能够显而易见地想到的一些雷同、代替方案，均应落入本发明保护的范围。
权利要求
奶牛乳汁孕酮检测生物传感器，其特征在于通过抗原 抗体反应，将孕酮完全抗原修饰于丝网印刷电极上，在丝网印刷电极上建间接竞争ELISA法。
2.根据权利要求1所述的奶牛乳汁孕酮检测生物传感器，其特征在于所述修饰电极 的孕酮完全抗原与待测抗原竞争结合孕酮单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记第二抗体与孕 酮单克隆抗体结合。
3.根据权利要求1或2所述的奶牛乳汁孕酮检测生物传感器，其特征在于用建立在 丝网印刷电极上的间接竞争ELISA法定量检测奶牛乳汁孕酮。
4.根据权利要求1或2所述的奶牛乳汁孕酮检测生物传感器，其特征在于制备方法 采用丝网印刷工艺制备三电极结构的电化学传感器，首先在PET薄膜上印刷银导电轨道， 然后用碳浆印制碳电极，其中直径3mm的圆盘为工作电极，而半环为对电极，最后，印刷绿 色油墨作为绝缘层，仅露出电极和连接处，在用丝网印刷电极制作的工作电极上滴加5μ L P4-OVA, 37°C孵育45min ；洗涤液洗涤两次；用0. 5%牛血清白蛋白封闭，在工作电极上滴加 5(^1^，371孵育601^11;洗涤液洗涤两次；制备好的生物传感器置于4°C密闭的环境中备 用。
5.根据权利要求3所述的奶牛乳汁孕酮检测生物传感器，其特征在于生物传感器 的使用方法在工作电极上滴加2.54 1^孕酮单克隆抗体和竞争孕酮抗原54 1^，371作用 45min ；洗涤液冲洗两次；滴加酶标二抗，湿盒37°C孵育40min，洗涤液冲洗两次；在电极上 滴加底物TMB-H2O2，滴加IOOuL ；用计时电流法测定电化学信号，将所得电流值代入建立的 曲线方程求出乳汁样品中的孕酮含量。
全文摘要
本发明研究了一种间接竞争抗原抗体免疫反应方法，应用修饰的孕酮完全抗原(P4-OVA)和待测抗原竞争孕酮单克隆抗体，最后酶标记第二抗体与单克隆抗体结合，在丝网印刷电极的工作电极端修饰P4-OVA制成对奶牛孕酮有特异敏感性的生物传感器，然后将此方法转移至生物传感器，用电化学技术检测辣根过物氧化酶作催化3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢(H2O2)藉此确定孕酮含量。
文档编号G01N33/64GK101915847SQ20101019974
公开日2010年12月15日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者刘骞, 吴凌, 夏成, 张洪友, 徐闯, 高维明, 黄海波 申请人:黑龙江八一农垦大学