专利名称：一种用于体外测定大豆分离蛋白消化率的方法
技术领域：
本发明涉及食品加工技术，更具体地涉及用于体外测定大豆分离蛋白消化率的方法。
背景技术：
大豆分离蛋白是以低温脱溶大豆粕为原料生产的一种全价蛋白类食品。蛋白质含量在90%以上，氨基酸种类有近20种，并含有人体必需氨基酸。其营养丰富，不含胆固醇， 近年的研究证实，大豆蛋白具有肉类蛋白所不具有的保健价值，是植物蛋白中为数不多的可替代动物蛋白的品种之一，对维系人类生命和保证人们的健康起着重要作用。但大豆蛋白分子结构紧密，对酶解具有很强的抵抗力，不利于人体内的消化和吸收，其生理活性和消化性是开发大豆蛋白加工技术的主要难题。因此，测定蛋白在人体内的消化率对提高和改善大豆蛋白加工难题具有重要的现实意义。目前对蛋白质消化的研究方法主要有化学法分析、体内消化法(人体及动物实验法)和体外模拟法等。化学分析法快速简便，但这种利用概略养分分析所测得的蛋白养分与人体消化吸收养分间存在很大差异，不足以准确地反映出蛋白的实际营养价值。体内消化法(人体及动物实验法)是测定蛋白质消化最好的方法，但是这种方法复杂、时间长、费用高；且由于很多因素影响而很难做到。与前两种方法相比，体外模拟法具有快速、简便、重复性好等优点，虽体内消化过程难以精确再现，但是，存在于体内的条件是可以在体外再现的。通过对体内真实情况的模拟，能很好的反映食物在体内消化吸收，可在短时间内对多个样品进行评定。现有技术文献中已有关于对大豆蛋白进行体外消化率测定的记载。例如，黄沧海等(几种蛋白质原料体外消化率测定方法的比较，饲料工业，高压物理学报，2005年第沈卷第20期)分别采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法、肉食性鱼类(如鲈鱼)消化道粗酶提取液消化法和草食性鱼类(如草鱼)消化道粗酶提取液消化法测定了酪蛋白、鱼粉、豆粕、菜籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉等7种蛋白原料的消化率。结果表明，胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法在测定鱼粉蛋白质消化率时可以替代鱼类消化液粗酶消化法，对于其它蛋白质原料使用该方法应慎重。Pedersen, B.禾口 Eggum, B. 0. (Prediction ofprotein digestibility by an in vitro enzymatic pH-stat procedure，1983 年第 49 期)用体外法测定了 61 种食物蛋白质的消化率，其中57种植物蛋白或植物蛋白与动物蛋白的混合物，体外实验测的消化率与体内实验(大鼠试验)有很好的相关性。李清晓等(豆粕粉碎粒度与蛋白质体外消化率的关系研究，家畜生态学报，2005年第沈卷第5期)采用胃蛋白酶一胰酶两步法，通过体外模拟鸡体消化道内环境来比较不同粉碎粒度豆粕的蛋白消化率，从而确定适合肉仔鸡生长的较适宜豆粕粉碎粒度。蛋白质在体内的消化是一个两步过程，第一步是蛋白质与预可消化性的胃蛋白酶相接触，第二步是蛋白质和氨基酸与胰蛋白酶的接触消化。目前，胃蛋白酶-胰酶两步体外消化法是公认的一种较好的测定蛋白质消化率的方法。但该方法大多用于饲料的消化率测定，虽有关于大豆蛋白体外消化的研究，但这些研究中所采用的蛋白酶没有经过酶的标准化，在体外消化中酶的活性变化范围可能会较大，且对体内条件的模拟及仿真度不高。这样，会使体内消化率的测定结果不稳定且无对比参考性。因此，还需要对现有的大豆蛋白体外消化法进行改进以提高其测定结果的稳定性和对比参考性。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于体外测定大豆分离蛋白消化率的方法。本发明在于提供一种大豆分离蛋白体外消化率的测定方法，该方法是在现有技术基础上加以改进，可提高测定结果的稳定性。根据本发明，所述用于体外测定大豆分离蛋白消化率的方法包括下列步骤配制大豆分离蛋白的水溶液(0. 01 0. 1%，g/100mL)，作为样品；使用一种或多种酶模仿人胃肠道的环境对所述样品进行体外消化；终止消化过程，获得待测样品；以及测定所述待测样品的体外消化率。在一个较佳实施方式中，在配制大豆分离蛋白的水溶液之前，可首先对所述大豆分离蛋白进行标准化检测。在一个较佳实施方式中，所述大豆分离蛋白的蛋白质含量优选在90% (干基)以上。在一个较佳实施方式中，所述水优选为双蒸水。在一个较佳实施方式中，所述酶可选自胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶、以及胰凝乳蛋白酶。在一个较佳实施方式中，消化所述样品的过程可包括以下步骤调节所述样品的pH到大约1. 5 ；加入胃蛋白酶；温育所述样品；提高pH到大约7. 8;加入胰蛋白酶；以及温育所述样品。在一个较佳实施方式中，终止消化过程的步骤可包括加入Na2CO3溶液于所述待测样品中，并立即将所述待测样品放入冰浴中冷却。在一个较佳实施方式中，可采用三氯乙酸-可溶性氮法进行体外消化率测定。与现有技术中的测定方法相比，本发明的用于体外测定大豆分离蛋白消化率的方法具有以下优点1、本发明采用的方法，模拟食物在体内的消化条件，尽量贴近人体消化环境，安全环保，工艺操作简单方便，易于控制管理。2、本发明采用的方法，避免了由于酶种类、活力差异引起的测定差别，3、本发明采用的方法，对掌握大豆分离蛋白体外消化率，建立大豆分离蛋白体内消化模型，能够提供直接而重要的参考依据。
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为了更好理解本发明的本质，下面结合附图，通过对本发明较佳的实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。
图1为本发明的体外测定大豆分离蛋白消化率的流程图。
具体实施例方式本发明所述测定方法的流程如图1所示。在本发明的一个具体实施方式
中，本发明所提供的用于体外测定大豆分离蛋白消化率的方法可包括下列步骤1)配制大豆分离蛋白的水溶液，作为样品；2)使用一种或多种酶模拟人体胃肠道的环境对所述样品进行体外消化；3)终止消化过程，获得待测样品；以及4)测定所述待测样品的体外消化率。本发明的用于体外测定大豆分离蛋白消化率的方法通过模拟人体内的消化环境 (PH和温度等)，用胃肠蛋白酶对大豆分离蛋白进行胃蛋白酶-胰酶两步体外消化，体外消化的时间模拟食物经过人体的消化道所需要的时间，并且采用三氯乙酸-可溶性氮法进行蛋白消化率的测定，从而能够为准确地评价蛋白质饲料的营养价值和方法提供资料。该方法可一般性地用于各种大豆分离蛋白(包括经热处理或高压处理得到的变性大豆分离蛋白)体外消化率的测定。在步骤幻中，所述酶可选自于胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶等。所用酶优选为标准化酶，例如sigma公司的胃蛋白酶和胰蛋白酶，以提高测定结果的重现性和可比性。本发明所述的用于体外消化的酶根据美国药典标准进行生产，酶的活性高度一致。美国药典USP是一种非政府组织，它通过建立技术状态标准来确保药物质量和其他健康护理技术以促进公共健康。这些标准通过公众参与的过程得以发展并为世界所接受。在一个较佳实施方式中，所述步骤2、包括以下步骤a)调节pH到大约1.5 ；b)加入胃蛋白酶；c)温育样品；d)提高pH到大约7. 8 ；e)加入胰蛋白酶；f)温育样品。在本发明中，终止消化过程的步骤可包括加入Na2CO3溶液于样品中，并立即将样品放入冰浴中冷却。在配制大豆分离蛋白的水溶液之前，通常首先对所述大豆分离蛋白进行标准化检测。检测标准可为所述大豆分离蛋白的蛋白质含量一般应在90% (干基)以上， 杂质少，水分含量在5%左右。本发明所述的大豆分离蛋白标准化检测，依据国家标准 (GB/T 5009. 5-2003食品中蛋白质的测定、GB/T5009. 3-2003食品中水分的测定、GB/T 5009. 6-2003食品中脂肪的测定和GB/T5009. 4-2003食品中灰分的测定)要求，进行原料的蛋白、水分、脂肪、灰份等的检验，保证原料符合高蛋白少杂质的要求，检测方法简单操作。其中，配制水溶液所用的水可为蒸馏水或双蒸水。在本发明的一个较佳实施方式中，所述水优选为双蒸水。蒸馏水是不含任何矿物元素和杂质的纯水，双蒸水就是把蒸馏水在进行一次蒸发，纯净度更高。因一定量的杂质会对超高压处理样品产生一定影响，故优选双蒸水。在一个具体实施方式
中，消化所述样品的过程可包括以下步骤
调节所述样品的pH到大约1. 5 ；加入胃蛋白酶；温育所述样品；提高pH到大约7. 8 ；加入胰蛋白酶；以及温育所述样品。在一个具体实施方式
中，终止消化过程的步骤可包括加入Na2CO3溶液于所述待测样品中，并立即将所述待测样品放入冰浴中冷却。其中，可采用三氯乙酸-可溶性氮法进行体外消化率测定。本发明所述的三氯乙酸-可溶性氮法，是依据大分子蛋白质不溶于三氯乙酸溶液中，只有小分子肽类和游离氨基酸才溶于其中的原理。这是经典的区别大分子蛋白质和其水解产物肽、游离氨基酸的方法。例如，在一个较佳实施方式中，本发明所述的测定方法可包括下列步骤1)大豆分离蛋白粉的标准化检测2)原料液配制选用含蛋白质90% (干基)以上的大豆分离蛋白(SPI)为原料，在20 25°C下用双蒸水配制溶液，浓度为0. 1%。3)蛋白酶溶液配制所述蛋白酶为胃蛋白酶和胰蛋白酶。用0. OlM HCl溶液配成浓度为5mg/mL胃蛋白酶溶液，用PH 7. 0磷酸缓冲盐溶液配成5mg/mL的胰蛋白酶溶液。两种蛋白酶溶液均须新鲜配制。4)体外消化模拟大豆分离蛋白在人胃肠道的消化过程，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法进行体外消化。用双蒸水调配成0.1% 1.0%的大豆蛋白溶液，调节PH到1.5。将样品放入 37°C恒温振荡摇床，加入胃蛋白酶溶液，使其用量达到 5%，开始消化。30min后，调 PH到6.0中止反应。随后升高温度到401，调？!1为7.8。加入新鲜的胰蛋白酶溶液1 % 5%，继续消化60min。5)终止消化终止消化的方法包括加入Na2CO3溶液于正在反应的样品中，并立即将消化物放入冰浴中冷却。6)体外消化率测定采用三氯乙酸-可溶性氮(TCA-NSI)法对样品的体外消化率进行测定。步骤如下 将IOmL的不同消化液加入IOmL的10% TCA,于5000Xg离心30min后，倒出上清液。沉淀部分再用IOmL的10% TCA洗涤，并于同样条件下离心，得到TCA不溶组分。蛋白质总氮和 TCA不溶性氮含量采用凯氏定氮法测得。消化过程氮释放量(％ )由下式计算而得
权利要求
1.一种用于体外测定大豆分离蛋白消化率的方法，该方法包括下列步骤 配制大豆分离蛋白的水溶液，作为样品；使用一种或多种酶模拟人体胃肠道的环境对所述样品进行体外消化； 终止消化过程，获得待测样品；以及测定所述待测样品的体外消化率。
2.权利要求1所述的方法，其中，在配制大豆分离蛋白的水溶液之前，对所述大豆分离蛋白进行标准化检测。
3.权利要求2所述的方法，其中，所述大豆分离蛋白的蛋白质含量在90%(干基)以上。
4.权利要求1、2和3中的任意一项所述的方法，其中，所述水为双蒸水。
5.权利要求1、2、3和4中的任意一项所述的方法，其中，所述酶选自胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶、以及胰凝乳蛋白酶。
6.权利要求5所述的方法，其中，所述酶为标准化酶。
7.权利要求1、2、3、4、5和6中的任意一项所述的方法，其中，体外消化所述样品的过程包括以下步骤调节所述样品的PH到大约1. 5 ； 加入胃蛋白酶； 温育所述样品； 提高PH到大约7. 8 ； 加入胰蛋白酶；以及温育所述样品。
8.权利要求1、2、3、4、5、6和7中的任意一项所述的方法，其中，终止消化过程的步骤包括加入Na2CO3溶液于所述待测样品中，并立即将所述待测样品放入冰浴中冷却。
9.权利要求1、2、3、4、5、6、7和8中的任意一项所述的方法，其中，采用三氯乙酸-可溶性氮法进行体外消化率测定。
全文摘要
本发明提供一种用于体外测定大豆分离蛋白消化率的方法。该方法的步骤包括配制大豆分离蛋白的水溶液，作为样品；使用一种或多种酶模仿人胃肠道的环境对所述样品进行体外消化；终止消化过程，获得待测样品；以及测定所述待测样品的体外消化率。该方法具有操作简易方便，节能环保，安全高效等优点。
文档编号G01N33/68GK102329853SQ20101022745
公开日2012年1月25日 申请日期2010年7月12日 优先权日2010年7月12日
发明者刘威, 张兰芳, 曹有福, 李树君, 杨炳南, 苏丹, 赵凤敏, 赵小鹏 申请人:中国农业机械化科学研究院