专利名称：血清中甘油三酯的两步酶测定方法
技术领域：
本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪检测血清中甘油三酯的两步酶测定方法。
背景技术：
血清中甘油三脂(TG)的测定方法一般可分为化学法、酶法和色谱法3大类。早期测定方法是以总脂质与胆固醇和磷脂之差估算。化学法用有机溶剂抽提标本中的TG，去除抽提液中磷脂等干扰物后，用碱水解(皂化)TG，以过碘酸氧化甘油生成甲醛，然后用显色反应测甲醛。比较准确的是二氯甲烷硅酸变色酸法(Van Handel-Caslson法)，此法抽提完全、能去除磷脂及甘油干扰、变色酸显色灵敏度高、显色稳定，至今还是美国疾病控制与预防中心(CDC)的内部参考方法。但因操作步骤繁多、技术要求高而不适于临床常规检测工作中应用。色谱法包括核素稀释/气相色谱/质谱等方法(ID/GC/MS)，主要用作参考系统中决定性方法的建立及参考物质的制备与定值，此法费用昂贵，样品处理复杂，难以推广应用。另外应用高效液相色谱仪测定血清中的甘油三酯，检测成本高，难以在临床推广。
目前国内几乎所有的临床实验室都用酶法检测血清TG水平，此方法分为一步法和两步法，虽然方法各异，但一般都包括以下几个基本反应步骤用最合适的脂蛋白脂肪酶(LPL)水解TG生成甘油和脂肪酸；水解后的甘油和三磷酸腺苷(ATP)在甘油激酶(GK)和甘油磷酸氧化酶(GPO)的催化下生成H2O2，在过氧化物酶(POD)的催化下，H2O2，4氨基安替比林(4-AAP)和2，4-二氯酚(也有使用4-氯酚、苯酚的衍生物、苯胺盐和苯磺酸盐，下面就以2，4-二氯酚为代表叙述，其他色原不再重复提起，)形成有色染料(常为醌亚胺类)，这些物质的生成量与样本中的甘油三酯含量成正比。最后通过分光光度法计算出相应的TG浓度。具体反应见化学反应式1～4。
生化分析仪检测血清中TG采用的是酶法，一般采用LPL、GPO、POD、4-氨基安替比林和酚等试剂的方法(GPO-PAP法)。其一步法是将LPL、GK、GPO、POD、4-氨基安替比林和2，4-二氯酚、镁盐、表面活性剂及防腐剂等成分溶解在Tris-HCl缓冲液中配制成单一试剂。按中华医学会推荐法配制Tris-HCl缓冲液每升内含有的主要成分有Tris0.15mmol(pH7.6)、2，4-二氯苯酚2.5mmol、MgSO4 10mmol、胆酸钠3.5mmol、Triton X-1000.1g、ATP1.0mmol。GK500U、GPO3000U、POD1000U、LPL3000 U、4-氨基安替比林1.2mmol。此法具有简便快速、微量、精密度高的优点，且特异性强，反应线性范围宽，易达到终点。但由于血清中TG水解后产生的甘油以及血清中原有的游离甘油都参与了反应，所以用一步法测定的是血清总甘油酯(定义为TG和游离甘油及少量甘油二酯、甘油一酯之和，习惯统称为TG)，使反应结果不能真实反映血清中TG的含量。中华医学会检验分会于1995年推荐GPO-PAP法的两步酶法作为血清TG常规测定方法。该方法是将原单一的反应试剂分成双试剂，其中LPL和4-氨基安替比林组成试剂II，其余成分组成试剂I，希望能减少游离甘油的干扰。按中华医学会推荐法配制，其试剂II每升Tris-HCl缓冲液内含有主要成分有Tris 0.15 mmol(pH7.6)、LPL30000U、4氨基安替比林1.0mmol。试剂I每升Tris-HCl缓冲液内含Tris 0.15mmol(pH7.6)、2，4-二氯酚3.0 mmol、MgSO4 12mmol、胆酸钠4.2mmol、Triton X-100 0.12g、ATP1.2mmol、GK 600 U、GPO 3600 U、POD1200 U。
国内大部分临床实验室采用一步酶法和两步酶法检测甘油三脂。国内一些试剂厂家生产两步酶法的试剂盒是以GK、GPO、POD、2，4-二氯酚为试剂I，以LPL、4-氨基安替比林作为试剂II。也有的厂家以GK、GPO、2，4-二氯酚为试剂I，以LPL、4-氨基安替比林和POD作为试剂II。这些试剂盒既可以作为双试剂使用，也可以将两种试剂合在一起作为单试剂使用。中华医学会推荐的两步酶方法可以消除脂血、溶血、黄疽的干扰等优点，但在实际应用中也存在以下问题 现在所用以4-氨基安替比林和脂蛋白脂肪酶组分为试剂II的两步酶方法中，在加入试剂？后的第一步预孵育期，游离甘油转化为无色的2，4-二氯酚的二聚体和苯氧自由基，见反应式5。在加入试剂？后，血清中的甘油三酯在脂蛋白脂肪酶的催化下经过化学反应式(1)～(4)的反应最终转化为红色醌亚胺。但由于2，4-二氯酚的二聚体不稳定，加入试剂？后，在4-氨基安替比林存在的情况下，2，4-二氯酚的二聚体及苯氧自由基也转化为红色醌亚胺，所测的醌亚胺实际为游离甘油和甘油三酯产生的醌亚胺之和。现有两步酶法不能消除血清中的游离甘油的干扰，使检测值偏高，给临床诊断带来误导。
发明内容
为了解决现有技术中血清中TG的测定方法存在内源性甘油干扰的问题，本发明提供一种经济方便易行，准确性更高、能够消除内源性甘油影响的血清甘油三酯的两步酶测定方法。
解决该技术问题采用的技术方案是双色原物质同在试剂I中，试剂II仅含有脂蛋白脂肪酶有效成分；其测定方法为血清先与试剂？于37℃温浴3～5分钟，血清中游离甘油与试剂I反应生成醌亚胺，加入试剂II于37℃温浴4～7分钟，甘油三酯水解后经一系列反应生成红色的醌亚胺。仪器在500nm波长处检测，以试剂？反应的醌亚胺为空白，由试剂？反应产生的醌亚胺计算出甘油三酯的含量。
上述试剂I每升Tris-HCl缓冲液内含Tris 0.10mmol～0.20mmol、2，4-二氯酚2.0mmol～4.0mmol、MgSO4 9mmol～15mmol、胆酸钠3.0mmol～5.5mmol、Triton X-1000.08g～0.15g、ATP 0.8mmol～2.0mmol、GK 400U～800U、GPO 3000U～4200U、POD 800U～1600U、4-氨基安替比林0.8mmol～2.4mmol、Proclin300防腐剂100μl～300μl；试剂II每升Tris-HCl缓冲液内含Tris 0.10mmol～0.20mmol、LPL 16000U～32000U、Proclin300防腐剂100μl～300μl。
上述试剂I中双色原物质一个为4-氨基安替比林，另一个选自2，4-二氯酚或苯酚的衍生物。
上述试剂I和试剂II中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.6±0.2。
上述测定中反应物的体积比为样品∶试剂I∶试剂II＝1∶75～80∶25～20。
本方法的试剂虽与原有的两步酶法试剂成分相同，只是将4-氨基安替比林改为与2，4-二氯酚同在试剂I，但其加入试剂I后的反应产物与原有加入试剂I后反应产物不同，测定效果明显不同。
本发明试剂I中含有GK、GPO、POD、4-氨基安替比林和2，4-二氯酚双色原物质等组分，试剂II仅含有脂蛋白脂肪酶有效组分。血清先与试剂I温浴，由于试剂I中包含有GK、GPO、POD、4-氨基安替比林和2，4-二氯酚等双色原物质，因此在试剂I的反应中游离甘油生成醌亚胺，加入试剂II后，甘油三酯通过脂蛋白脂肪酶水解生成甘油，经GK、GPO、POD、4-氨基安替比林和2，4-二氯酚双色原物质作用，使得TG水解后也生成红色的醌亚胺。通过设置仪器测定参数，仪器将试剂I反应生成的醌亚胺设为空白，由试剂II反应生成的醌亚胺计算出TG的含量，这样测定结果消除了原有游离甘油干扰的影响。
本发明中2，4-二氯酚也可以选用4氯酚、苯酚的衍生物、苯胺盐和苯磺酸盐替代。
本发明与现有技术相比有如下优点本发明的血清中甘油三酯的两步酶方法检测时不受内源性甘油影响，线性范围可达11.3mmol/L。其使用方法和范围与原有两步酶法相同，不会增加实验人员的负担，不增加试剂成本，经济方便易行，是一种准确性更高的TG检测方法。
附图是本发明测定健康人体TG的反应曲线图。
具体实施例方式 下面通过实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
实施例1 试剂的组成 a.试剂I 每升Tris-HCl缓冲液内含Tris 0.15mmol(pH7.6)、2，4-二氯酚3.0 mmol、MgSO412mmol、胆酸钠4.2mmol、Triton X-100 0.12g、ATP 1.2mmol、GK 600U、GPO 3600U、POD1200U、4-氨基安替比林1.6mmol、Proclin-300防腐剂200μl。
b.试剂II 每升Tris-HCl缓冲液内含Tris 0.15 mmol(pH7.6)、LPL 24000U、Proclin-300防腐剂200μl。
c.标准液2mmol/L三油酸酯水溶液。
其中，MgSO4为甘油激酶的激活剂，Triton X-100为表面活性剂，Proclin-300为液体高效防腐剂，胆酸钠为抑菌剂。
实施例2. 试剂I中将2，4-二氯酚改为4-氯酚。含量不变。其他成分都不变，试剂II不变。
实施例3 测定程序 双试剂法在日本OLYMPUS AU2700全自动化生化分析仪上，仪器自动将2祃样品加入到150祃试剂I中混匀，37℃孵育3分钟，加入50祃试剂II混匀，37℃孵育5.1分钟，全自动分析仪在500nm波长处检测。仪器自动计算出TG结果。具体见表1 表1.本发明自动化生化分析仪测试条件
反应ODTG计算值＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)] 甘油三酯浓度＝F×ODTG 其中ODTG是甘油三酯产生的吸光度。OD1是样品加入试剂？反应后测得的吸光度，OD2是样品加入试剂？反应后测得的吸光度，SV是血清样品的体积，R1V1是试剂？的体积，R2V2是试剂？的体积。F是校正因数。
加入试剂II后OD1的稀释倍数为[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]，加入试剂II后的吸光度即为OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]。所以，由甘油三酯产生的醌亚胺的吸光度为ODTG＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]，即ODTG＝OD2(2+150)/(2+150+50)×OD1。只要测出OD1和OD2即可计算出甘油三酯的浓度。
下面通过采用三种不同的检测试剂检测血清中的甘油回收率，来进一步说明本发明的积极效果。甘油回收率是反应后测定的甘油数值与加入的甘油数值的比值的百分率。在本反应中甘油为甘油三酯的等比产物。甘油测定回收率以加入的甘油不影响甘油三酯测定为最好。即甘油回收率越低，说明甘油对甘油三酯测定影响越低。甘油未计入甘油三酯测定值内。
1.检测对象健康体检人员86人，其中男性52人，平均年龄42.5岁；女性34人，平均年龄39.5岁，空腹采血。
2.采用方法及试剂 2.1试剂 (1)试剂A单一试剂，按中华医学会推荐法配制Tris-HCl缓冲液每升内含Tris0.15mmol(pH7.6)、2，4-二氯苯酚2.5mmol、MgSO4 10mmol、胆酸钠3.5mmol、TritonX-100 0.1g、ATP1.0mmol。GK 500 U、GPO 3000 U、POD1000 U、LPL 3000 U、4-氨基安替比林1.2mmol。
(2)试剂B按中华医学会推荐法配制，将上述试剂分成试剂I和试剂II，其中试剂II每升Tris-HCl缓冲液内含Tris 0.15mmol(pH7.6)、LPL 30000 U、4-氨基安替比林1.0mmol。试剂I每升Tris-HCl缓冲液内含Tris 0.15 mmol(pH7.6)、2，4-二氯酚3.0 mmol、MgSO4 12mmol、胆酸钠4.2mmol、Triton X-100 0.12g、ATP 1.2mmol、GK 600 U、GPO3600 U、POD 1200 U。
(3)试剂C配制成双试剂，4-氨基氨替比林与2，4-二氯酚同在试剂I中，试剂II仅有脂蛋白脂肪酶有效成分。试剂II每升Tris-HCl缓冲液内含Tris 0.15mmol(pH7.6)、LPL24000 U、Proclin-300防腐剂200祃。试剂I每升Tris-HCl缓冲液内含Tris 0.15mmol(pH7.6)、2，4-二氯酚3.0 mmol、MgSO4 12mmol、胆酸钠4.2mmol、Triton X-100 0.12g、ATP 1.2mmol、GK 600 U、GPO 3600U、POD 1200U、4-氨基安替比林1.6mmol、Proclin-300防腐剂200μl。
(4)甘油(分析纯，sigma公司，分子量92.09，密度为1.2613mg/dl，25℃) 2.2.仪器日本Olympus AU2700型全自动生化分析仪 2.3.方法 2.3.1分别用试剂A、B、C三种试剂测定86份健康人群甘油三脂水平，并进行结果比较。
2.3.2.将上述血清混合配制成混合血清，分别加入0、0.85、1.70、3.40mmol/L甘油，分别用试剂A、B、C三种试剂测定，比较三种方法的回收试验。
2.3.3.三种试剂的测定方法 试剂A样品∶试剂＝1∶100。37℃，反应时间8.1分钟，500nm波长处终点法测定。
试剂B样品∶试剂I∶试剂II＝1∶75∶25。37℃，样品与试剂I温浴3分钟，加入试剂II，反应5.1分钟，500nm波长处终点法测定。
试剂C样品∶试剂I∶试剂II＝1∶75∶25。37℃，样品与试剂I温浴3分钟，加入试剂II，反应5.1分钟，500nm波长处终点法测定。
3.三种方法测定TG比较 通过统计学分析采用试剂A与试剂B两种测定方法测定结果无显著性差异，t＝1.04，P＝0.3338，相关性良好，r＝0.984，Y试剂A＝0.9307+0.931X试剂B，试剂A与试剂B两种测定方法均不能消除游离甘油影响见表2，采用试剂C与试剂B的测定方法测定结果有显著性差异，t＝7.03，P＝0.0026。试剂C消除了游离甘油干扰见表2。
表2.回收实验数据表(n＝34)
试剂A单一试剂中，游离甘油和TG同时反应生成醌亚胺，计算结果为游离甘油和TG之和。推荐方法试剂B中，在血清加入试剂I后，在第一步预孵育期，游离甘油转化为不稳定的无色2，4-二氯酚的二聚体，当加入试剂II后，在4-氨基安替比林存在的情况下，2，4-二氯酚的二聚体转化为红色醌亚胺，TG水解后最终也转化为醌亚胺，所测醌亚胺为游离甘油和TG产生的之和，游离甘油的影响尚未消除。本发明试剂C中，在第一步预孵育期，游离甘油转化为醌亚胺，在加入试剂II后，启动TG水解反应，TG转化为醌亚胺，反应曲线见附图。仪器将第一步反应产生的红色醌亚胺为空白，以第二步反应产生的醌亚胺计算出TG的含量，为真正TG含量。
经过以上比较可看出，本发明虽与原配方组成相同，但因4-氨基氨替比林与2，4-二氯酚同在试剂I中，试剂II仅有脂蛋白脂肪酶，所以血清加入试剂I后发生的反应与现有加入试剂I后的反应不同，实际效果也完全不一样。因此，本发明通过改变试剂I、II的组分能够保证血清中甘油三酯检测的准确性。
权利要求
1.一种血清中甘油三酯的两步酶测定方法，其特征在于双色原物质同在试剂I中，试剂II仅含有脂蛋白脂肪酶有效成分；其测定方法为血清先与试剂？于37℃温浴3～5分钟，血清中游离甘油与试剂？的反应生成醌亚胺，加入试剂？后于37℃温浴4～7分钟，甘油三酯水解后经反应也生成醌亚胺；仪器在500-520nm波长处检测，以试剂？反应产生的醌亚胺为空白，由试剂？反应产生的醌亚胺计算出甘油三酯的含量，计算公式为
ODTG＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]
甘油三酯浓度＝F×ODTG
其中ODTG是甘油三酯产生的吸光度，OD1是样品加入试剂？反应后测得的吸光度，OD2是样品加入试剂？反应后测得的吸光度，SV是血清样品的体积，R1V1是试剂I的体积，R2V2是试剂II的体积，F是校正因数。
2.根据权利要求1所述的血清中甘油三酯的两步酶测定方法，其特征在于试剂I中双色原物质一个为4-氨基安替比林，另一个选自2，4-二氯酚或苯酚的衍生物。
3.根据权利要求1所述的血清中甘油三酯的两步酶测定方法，其特征在于试剂I每升Tris-HCl缓冲液内含Tris 0.10mmol～0.20mmol、2，4-二氯酚2.0mmol～4.0mmol、MgSO49mmol～15mmol、胆酸钠3.0mmol～5.5mmol、Triton X-1000.08g～0.15g、ATP 0.8mmol～2.0mmol、GK 400U～800U、GPO 3000U～4200U、POD 800U～1600U、4-氨基安替比林0.8mmol～2.4mmol、Proclin-300防腐剂100μl～300μl；试剂II每升Tris-HCl缓冲液内含Tris 0.10mmol～0.20mmol、脂蛋白脂肪酶16000U～32000U、Proclin-300防腐剂100μl～300μl。
4.根据权利要求1所述的血清中甘油三酯的两步酶测定方法，其特征在于试剂I和试剂II中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.6±0.2。
5.根据权利要求1所述的血清中甘油三酯的两步酶测定方法，其特征在于测定的体积比为样品∶试剂I∶试剂II＝1∶75～80∶25～20。
全文摘要
本发明公开了一种血清中甘油三酯的两步酶测定方法，属于利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法。本发明的技术方案是双色原物质同在试剂I中，试剂II仅有脂蛋白脂肪酶有效成分；其测定方法为血清先与试剂I于37℃温浴3～5分钟，血清中游离甘油与试剂I反应生成醌亚胺，加入试剂II后于37℃温浴4～7分钟，甘油三酯水解后经反应产生红色的醌亚胺。仪器在500-520nm波长处检测，以试剂I反应产生的醌亚胺为空白，由试剂II反应产生的醌亚胺计算出甘油三酯的含量。本发明检测时不受内源性甘油影响，其使用方法和范围与原有两步酶法相同，不增加试剂成本，经济方便易行，是一种准确性更高的甘油三酯检测方法。
文档编号G01N21/78GK101762577SQ20101030088
公开日2010年6月30日 申请日期2010年1月28日 优先权日2010年1月28日
发明者李立和 申请人:李立和