专利名称：一种免疫荧光试纸条及其定量检测方法
一种免疫荧光试纸条及其定量检测方法技术领域
本发明主要涉及荧光免疫层析检测领域，属于干化学检测方法的一种，具体的涉及一种免疫荧光试纸条。
背景技术：
荧光免疫分析技术是在标记免疫技术中逐渐发展起来的一种基于抗原-抗体反应的分析技术。其诞生的早期，一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。终于由Coons等，于1941年首次将荧光素进行用于抗体的标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术(fluorescent antibody technique)。
使用荧光免疫分析技术可以用来检测抗原，也可用来检测抗体。其中用于检测抗原的方法较为常用，通常称为荧光抗体法。将抗体进行荧光标记后用于检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术。
与传统的酶联免疫吸附(ELISA)法不同，应用荧光免疫分析技术进行检测时，其信号特异性强、敏感性高、速度较快，特别适合于体外快速诊断领域。虽然也存在非特异性染色等方面的不足。但随着优质抗体的制备成功，特别是特异性更高的基因工程抗体、单链抗体等的出现，其不足方面得到了良好的改善。并且，试剂安全无毒，对环境和操作者损伤小等，因此，受到越来越多临床检验工作者的青睐。
干化学分析法是指与传统溶液分析相对而言的，即将所需分析试剂全部固化在多层复合膜上，分析时只需要将少量待检样品(几微升)加在膜上即可进行定性或定量分析。
免疫层析技术在广义上讲，也属于干化学的一种。使用硝酸纤维素膜等作为反应物支撑的载体，利用膜的孔隙效应进行反应。该技术可分为纵向扩散和横向扩散两种。早期诞生的是纵向扩散的斑点金杂交法，但终因其操作复杂未能成为主流试剂推广使用。随着膜技术的发展，侧向流横向扩散试纸条显示出良好的优势，并得到极大的推广。侧向流免疫层析技术中应用最广泛的胶体金快速诊断试纸，用于早早孕(HCG)的检测。由于其方便、快捷、特异性高，特别适合即时诊断，因此，其应用十分广泛，成为侧向流免疫层析技术中的代表性产品。然而，该类产品往往仅能用于样品的初筛，其主要缺点是检测灵敏度较低，只能用于定性测量或者半定量测量，虽然通过一定的仪器也可以对显色条带的深浅进行判读， 但仍然无法进行定量测量。并且检测的结果不易记录和保存。发明内容
为了克服现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种免疫荧光试纸条，使用本发明可以实现对各种血清标志物、微生物抗原、病毒颗粒、违禁药品等生物大分子或小分子的定量检测，并且可以实现单一项目或多个项目的联合检测。本发明的另一个目的在于提供一种免疫荧光试纸条的定量检测方法。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现
一种免疫荧光试纸条，由依次设置在外壳上相互搭接的样品垫、反应膜和吸收垫组成，所述反应膜上固定有一条内部质控带，至少一条的检测带和一条过量抗原检测带，其中内部质控带固定有定量的抗原或抗体物质，检测带固定有可与待测物质特异性结合的抗体，过量抗原检测带固定有二抗。
优选地，所述外壳的材料可以是ABS、PS、PE、PVC或PC中的任意一种。
优选地，所述样品垫的材料可以是纤维素、玻璃纤维或纺织聚合物中的任意一种。
优选地，所述反应膜的材料可以是硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、尼龙膜或聚四氟乙烯膜中的任意一种。
优选地，吸收垫可以是纤维素、玻璃纤维素或纤维素玻璃纤维素混合体中的任意一种。
一种免疫荧光试纸条定量检测方法，包括以下步骤
步骤1.将含有目标检测物的液体加入到荧光反应试剂中，并反应Imin ；
步骤2.取定量已反应试剂滴加于本发明的免疫荧光试纸条的样品垫( 上，进行免疫反应，所述定量已反应试剂的取值够参加免疫反应即可；
步骤3.反应;3min后，将其置于一荧光分析检测器上，对荧光信号的强度进行读取。
进一步的，所述荧光反应试剂的内部包含两种或多种用于定量的标记抗体，标记抗体的荧光物质可以为直接荧光染料、乳胶颗粒、量子点或磁性纳米颗粒中的任意一种可以产生荧光的物质。
本发明在检测试纸条时，可使用激光、卤钨灯+单色器或高功率LED作为光源，激发试纸条上的荧光物质发出荧光。
本发明中荧光信号的读取装置可使用光电二极管、CCD或光电倍增管对信号进行读取。
本发明进行待测抗原定量时，使用基于反应膜上荧光信号强度的处理算法。主要是基于荧光信号的最大值或者荧光信号的面积进行计算。荧光信号主要有以下几种情况
(1)无待测抗原
(2)待测抗原浓度不超过检测范围
(3)待测抗原浓度高于最大检测限
与现有技术相比，本发明通过对试纸条上荧光信号的强弱分析，并结合优化的数据处理算法，可以实现对目标检测物的精确定量检测。本发明的免疫荧光试纸条可用于各种临床诊断生物标记物、特异性生物分子、农药残留物、微生物、水体污染物等的定量检测。 具有方便快捷、易于携带、试剂安全无毒、环境污染小的特点，特别适合体外快速诊断和快速检测领域。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。 本发明的具体实施方式
由以下实施例及其附图详细给出。
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明的免疫荧光试纸条的结构示意图。
图中标号说明1、外壳，2、样品垫、3、内部质控带，4、检测带，5、过量抗原检测带， 6、反应膜，7、吸收垫。
具体实施方式
参见图1所示，一种免疫荧光试纸条，由依次设置在外壳1上相互搭接的样品垫2、 反应膜6和吸收垫7组成，所述反应膜6上固定有一条内部质控带3，至少一条的检测带4 和一条过量抗原检测带5，其中内部质控带3固定有定量的抗原或抗体物质，检测带4固定有可与待测物质特异性结合的抗体，过量抗原检测带5固定有二抗。
实施例1 心肌肌钙蛋白I (cTnl)的检测
(1)试纸条的制备
1)反应膜的制备
选取Millipore HF180带背衬膜作为反应膜。将膜的裁成30X 1. 8cm大小备用。将羊抗兔IgG使用0. 01M, PH为7. 2的PBS调节其浓度为0. 5mg/mL,加入2 %或1 %吐温-20， 使用划膜仪将其喷于NC膜表面作为内部质控线，划膜量为每厘米0. 5 μ L。将1号cTnl抗体溶液使用0. 01Μ，ΡΗ为7. 2的PBS调节其浓度为0. 5mg/mL，加入2%或1 %吐温-20，使用划膜仪将其喷于NC膜表面，划膜量为每厘米0. 5μ L，作为检测线。将羊抗鼠I gG抗体溶液使用0. 01M，PH为7. 2的PBS调节其浓度为0. 5mg/mL，加入2%或1 %吐温-20，使用划膜仪将其喷于NC膜表面，划膜量为每厘米0. 5 μ L，作为过量抗原检测线。每两条线间的间隔为 4mm。划膜结束后立即放入37度烘箱中干燥过夜，室温干燥条件保存备用。
2)试纸条的组装
选取国产优质玻璃纤维膜BT100作为样品垫材料，将其剪裁成30 X 2cm大小备用。 选取国产优质吸水纸CH37K将其剪裁成30X 1. 8cm大小备用。
在规格为30 X 6cm的PVC底板上首先黏贴反应膜，然后将样本垫与吸水纸采取搭接的方法黏贴于底板上，搭接的长度为0. 5mm,以便于反应液的扩散。组装好后，采用特制切条刀，将试纸条切成4mm宽的试纸条，并封装与塑料外壳中，放于铝箔当中，4°C密封保存。
3)荧光反应液的制备
将2号cTnl抗体溶液使用PBS调节其浓度为ang/mL，PH为7. 5-8. 0之间，取ImL 抗体溶液，缓慢加入浓度为lmg/mL的cy5-Se染料100 μ L，4°C缓慢搅拌反应3h，常温下继续反应lh，待反应完全后，使用PH为7. 4的PBS进行透析，除去未反应的cy5-Se。开始时， 每隔4h换一次透析液，更换2次以后每1 换一次透析液，透析完全后，回收偶联好的荧光抗体，测定偶联效率与抗体浓度后，避光保存。
将兔IgG使用与心肌肌钙蛋白蛋白荧光抗体制备相同的方法，制备出标记有cy5 的兔IgG，避光保存备用。
取lmg/mL的cTnl荧光抗体ImL与0. ImL的lmg/mL兔IgG荧光抗体混合，使用 0. 01M, PH为7. 4的PBS稀释10倍，并加入1 %吐温-20,0. 1 % BSA, 0. 1 % NaN3相混合，制备反应液，反应液每200 μ L为一管，进行分装，4°C避光保存备用。
(2)测试步骤
1)将试纸条和反应液由包装袋内取出，并放于室温平衡IOmin以上；
2)取新鲜全血20 μ L(或血清10 μ L)，加入到已分装好的荧光反应液QOOyL/ 管)中，反应lmin;中间轻轻摇勻；
3)将反应液混合物加入样品垫上，使反应混合物在试纸条上进行侧向层析免疫反应；时间为3min ；
4)反应结束后，将试纸条放于专门的荧光信号读取仪器中，读取荧光信号的大小， 进行定量测定。
实施例2 =C-反应蛋白(CRP)的检测
(1)试纸条的制备
1)反应膜的制备
选取Millipore HF180带背衬膜作为反应膜。将膜的裁成30X 1. 8cm大小备用。将羊抗兔IgG使用0. 01M, PH为7. 2的PBS调节其浓度为0. 5mg/mL,加入2 %或1 %吐温-20， 使用划膜仪将其喷于NC膜表面作为内部质控线，划膜量为每厘米0. 5 μ L。将1号CRP抗体溶液使用0. 01Μ，ΡΗ为7. 2的PBS调节其浓度为0. 5mg/mL，加入2%或1 %吐温-20，使用划膜仪将其喷于NC膜表面，划膜量为每厘米0.5 μ L，作为检测线。将羊抗鼠I gG抗体溶液使用0. 01M, PH为7. 2的PBS调节其浓度为0. 5mg/mL，加入？^或！^吐温_20，使用划膜仪将其喷于NC膜表面，划膜量为每厘米0. 5 μ L，作为过量抗原检测线。每两条线间的间隔为 4mm。划膜结束后立即放入37度烘箱中干燥过夜，室温干燥条件保存备用。
2)试纸条的组装
选取国产优质玻璃纤维膜BT100作为样品垫材料，将其剪裁成30 X 2cm大小备用。 选取国产优质吸水纸CH37K将其剪裁成30X 1. 8cm大小备用。
在规格为30 X 6cm的PVC底板上首先黏贴反应膜，然后将样本垫与吸水纸采取搭接的方法黏贴于底板上，搭接的长度为0. 5mm,以便于反应液的扩散。组装好后，采用特制切条刀，将试纸条切成4mm宽的试纸条，并封装与塑料外壳中，放于铝箔当中，4°C密封保存。
3)荧光反应液的制备
将2号CRP抗体溶液使用PBS调节其浓度为:3mg/mL，PH为7. 5-8. 0之间，取ImL 抗体溶液，缓慢加入浓度为lmg/mL的cy5-Se染料100 μ L，4°C缓慢搅拌反应池，常温下继续反应lh，待反应完全后，使用PH为7. 4的PBS进行透析，除去未反应的cy5-Se。开始时， 每隔4h换一次透析液，更换2次以后每1 换一次透析液，透析完全后，回收偶联好的荧光抗体，测定偶联效率与抗体浓度后，避光保存。
兔IgG使用与心肌肌钙蛋白蛋白荧光抗体制备相同的方法，制备出标记有cy5的兔IgG，避光保存备用。
取lmg/mL的cTnl荧光抗体ImL与0. ImL的lmg/mL兔IgG荧光抗体混合，使用 0. 01M, PH为7. 4的PBS稀释10倍，并加入1%吐温_20，0. 1% BSA, 0. 1% NaN3相混合，制备反应液，反应液每200 μ L为一管，进行分装，4°C避光保存备用。
(2)测试步骤
1)将试纸条和反应液由包装袋内取出，并放于室温平衡IOmin以上；
2)取新鲜全血20 μ L(或血清10 μ L)，加入到已分装好的荧光反应液QOOyL/ 管)中，反应lmin;中间轻轻摇勻；
3)将反应液混合物加入样品垫上，使反应混合物在试纸条上进行侧向层析免疫反应；时间为3min ；
4)反应结束后，将试纸条放于专门的荧光信号读取仪器中，读取荧光信号的大小， 进行定量测定。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种免疫荧光试纸条，由依次设置在外壳(1)上相互搭接的样品垫O)、反应膜(6) 和吸收垫(7)组成，其特征在于所述反应膜(6)上固定有一条内部质控带(3)，至少一条的检测带(4)和一条过量抗原检测带(5)，其中内部质控带C3)固定有定量的抗原或抗体物质，检测带固定有可与待测物质特异性结合的抗体，过量抗原检测带(5)固定有二抗。
2.根据权利要求1所述的免疫荧光试纸条，其特征在于所述外壳(1)的材料可以是 ABS、PS、PE、PVC或PC中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的免疫荧光试纸条，其特征在于所述样品垫O)的材料可以是纤维素、玻璃纤维或纺织聚合物中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的免疫荧光试纸条，其特征在于所述反应膜(6)的材料可以是硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、尼龙膜或聚四氟乙烯膜中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的免疫荧光试纸条，其特征在于吸收垫(7)可以是纤维素、玻璃纤维素或纤维素玻璃纤维素混合体中的任意一种。
6.一种使用权利要求1至5中任意一项所述的免疫荧光试纸条定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1.将含有目标检测物的液体加入到荧光反应试剂中，并反应Imin ；步骤2.取定量已反应试剂滴加于本发明的免疫荧光试纸条的样品垫( 上，进行免疫反应；步骤3.反应;3min后，将其置于一荧光分析检测器上，对荧光信号的强度进行读取。
7.根据权利要求6所述的免疫荧光试纸条定量检测方法，其特征在于所述荧光反应试剂的内部包含两种或多种用于定量的标记抗体，标记抗体的荧光物质可以为直接荧光染料、乳胶颗粒、量子点或磁性纳米颗粒中的任意一种可以产生荧光的物质。
全文摘要
本发明公开了一种免疫荧光试纸条，由依次设置在外壳上相互搭接的样品垫、反应膜和吸收垫组成，所述反应膜上固定有一条内部质控带，至少一条的检测带和一条过量抗原检测带，其中内部质控带固定有定量的抗原或抗体物质作为内参，检测带固定有可与待测物质特异性结合的抗体，过量抗原检测带固定有二抗。本发明的免疫荧光试纸条可用于各种临床诊断生物标记物、特异性生物分子、农药残留物、微生物、水体污染物等的定量检测。具有方便快捷、易于携带、试剂安全无毒、环境污染小的特点，特别适合体外快速诊断和快速检测领域。
文档编号G01N33/52GK102539751SQ20101058138
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者唐玉国, 尹焕才, 王弼陡 申请人:苏州生物医学工程技术研究所