专利名称：一种新的免疫荧光标记方法
技术领域：
本发明属于免疫学技术应用领域，涉及通过点击化学进行免疫荧光染色分析的 方法。
背景技术：
点击化学是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。 它尤其强调以碳-杂原子键(C-X-C)合成为基础的组合化学新方法，并借助该反应来 简单高效地获得分子多样性.由于点击化学产物无毒，且稳定性好，已被广泛用于药物 筛选、药物开发、聚合及其它生物体外和体内分析。生物偶联技术是通过小分子化合物对生物大分子进行修饰的一种技术，已经在 分子生物学和化学生物学等领域广泛的应用，如蛋白质、核酸等荧光团标记、修饰、配 体螯合、放射性同位素标记等。免疫荧光抗体技术是使用一个特殊的荧光标记物共价连接到任何一种抗原或抗 体，并通过荧光显微镜进行检测的方法。目前，FITC、罗丹明等荧光标记物已经广泛应 用于免疫荧光分析技术中，此外，利用生物素-亲和素系统的免疫检测系统，也被广泛 应用。
发明内容
本发明的目的是开发的一种新型的抗体标记技术，建立了一种新的免疫荧光抗 体分析方法，丰富了免疫学检测体系和荧光抗体检测手段，为现有的方法提供一种新的 免疫荧光标记方法及其应用。本发明首先提供了一种新型免疫荧光标记方法，该方法包括
以含有活化氨基基团和叠氮基团的双功能化合物作为蛋白质标记物，其中的活化氨 基基团能与蛋白质中的氨基反应，从而使被标记蛋白质含有叠氮基团，进而通过叠氮活 性基团与叠氮反应基团之间的点击化学反应，使蛋白质具备发光功能或偶联可被检测的 标签基团。所述的叠氮反应基团是能与叠氮基团形成三唑环的炔基化合物，其具备发荧光 特性或含有标签基团。所述的具备发荧光特性的偶联基团包括Cy3、Cy5、FITC、TRITC、ΡΕ、 DAPI、Texas red、RB200、Indo-1 和量子点等。所述的标签基团包括His、GST、FLAG、HA、Myc生物素等。本发明同时提供了一种新型免疫荧光标记方法在抗体的荧光标记及免疫荧光分 析方法中的应用。
本发明涉及两个关键的化合物6-叠氮-己酸琥珀酰亚胺活性酯(化合物1)和 4-乙炔基-N-乙基-1,8-萘酰亚胺合成(化合物2)，将合成的化合物1与抗her2抗体Anti-HP15的游离氨基偶联获得叠氮化IgG，随后通过铜离子催化化合物2中的炔基与标 记抗体的叠氮基团进行点击化学反应，实现荧光显色，其检测限可达0.1 μ g，EC50为1 yg，并在细胞水平进行荧光染色分析验证。本发明自行合成了化合物6-叠氮-己酸琥珀酰亚胺活性酯(化合物1)和4-乙 炔基-N-乙基-1,8-萘酰亚胺合成(化合物2)，前者拥有与氨基高活性反应的琥珀酰亚 胺基团和与炔基反应的叠氮基团，后者含有炔基及发光基团。以上述合成的两个化合物，本发明建立了以抗体为代表的荧光染色分析方法， 并通过细胞的免疫荧光染色和点击化学方法进行验证，同时确认了该标记方法的检测灵 敏度和检测限。本发明提供的抗体的叠氮标记方法如下
将2.4 μ L的10 mg/mL的化合物1缓慢加入到1 mL的Anti_HP15抗体溶液(0.1 mol/L, pH=9.0 Na2CO3-NaHCO3, 1 mg/mL IgG)中，室温搅拌 Ih 后，5000 r/min 离心 IOmin,吸取上清液加入超滤管中，以PBS稀释并于3500r/min反复离心洗涤，获得叠氮 标记的Anti-HP 15抗体。本发明提供的点击化学催化反应及荧光基团分析方法如下
将0.1 1.0 mmol/L的化合物1加入至含有0.5 mmol/L化合物2、0.2 mmol/L Tris-triazoleamine、1 mmol/L CuSO4 及 2 mmol/L 抗坏血酸钠的 PBS 溶液中，室温反应 60 min。以365 nm波长激发光激发反应产物，扫描390 550 nm的发射光谱，确认最大发 射波长，并以最大发射波长测定各组荧光强度，绘制叠氮基团浓度相关的标准曲线；同 时，以3 ymol/L叠氮标记的Anti_HP15抗体替代化合物1进行点击化学反应，根据反应 产物的荧光强度确认抗体的叠氮化标记效率。
本发明的有益效果本发明采用叠氮标记抗体进行免疫荧光分析，该发明可与其他 现有的免疫荧光技术同时使用，且结果互不干扰。本发明通过开发一种新型的抗体标记 技术，建立了一种新的免疫荧光抗体分析方法，丰富了免疫荧光抗体检测手段，在未来 的免疫研究中具备发展潜力和广泛应用前景。
图1是依赖点击化学的免疫荧光分析原理； 图2是最大发射波长分析，
A化合物1与化合物2反应后的产物；B化合物2 ； C :化合物1 图3是叠氮定量曲线； 图4是叠氮标记抗体的检测灵敏度； 图5是细胞染色分析，
A 阴性对照；B 反应组；C 阳性对照； 图6是三通道荧光染色分析，
A 叠氮标记Her2抗体染色；B: FITC标记的EGFR4染色；C:生物素化的GRP94
染色；D 三通道复合分析。
具体实施例方式实施例1 Anti-HP 15的荧光标记
将1 mg NHS-FITC或NHS-罗丹明溶解于100 μ L DMSO中，随后吸取4.7 μ L NHS-FITC 或 3.5 μ L NHS-罗丹明逐滴加入 1 mL Anti-HP 15 抗体溶液(0.1 mol/L， pH=9.0 Na2CO3-NaHCO3, 1 mg/mL IgG)中，于室温下搅拌 1 h 后，5000 r/min 离心 10 min,吸取上清并于 PBS (pH=7.2, 0.02 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4, 0.15 mol/L NaCl)
中充分透析，去除未反应的NHS-FITC和NHS-罗丹明，获得FITC或罗丹明标记的 Anti-HP 15抗体，用于阳性对照。实施例2 关键化合物的合成
两个关键的化合物6-叠氮-己酸琥珀酰亚胺活性酯(化合物1)和4-乙炔基-N-乙 基-1,8-萘酰亚胺(化合物2)合成方法如下将6-溴化己酸与叠氮化钠在乙腈溶液中反 应，收集产物，向其中加入N-羟基琥珀酰亚氨和EDC，在二氯甲烷体系中反应，获得化 合物1;向4溴-1,8-萘酰亚胺中加入乙胺，在乙醇溶液中反应后收集产物，加入三甲基 硅烷基炔，在四氢呋喃体系中经四(三苯基膦)钯和碘化亚铜催化反应，获得化合物2。实施例3 Anti-HP 15的叠氮标记
将2.4 μ L的10 mg/mL的化合物1缓慢加入到1 mL的Anti_HP15抗体溶液(0.1 mol/L, pH=9.0 Na2CO3-NaHCO3, 1 mg/mL IgG)中，室温搅拌 Ih 后，5000 r/min 离心 IOmin,吸取上清液加入超滤管中，以PBS稀释并于3500r/min反复离心洗涤，获得叠氮 标记的Anti-HP 15抗体。实施例4 抗体叠氮标记量分析
将不同浓度的化合物1加入至含有0.5 mmol/L化合物2、0.2 mmol/L Tris-triazoleamine、1 mmol/L CuSO4 及 2 mmol/L 抗坏血酸钠的 PBS 溶液中，室温 60 min
后，以365 nm波长激发光激发反应产物，扫描390 550 nm的发射光谱，确认最大发射波 长，并以最大发射波长测定各组荧光强度，绘制叠氮基团浓度相关的标准曲线；同时， 以3 110101/1^叠氮标记的入1^-1^15抗体替代化合物1进行点击化学反应，根据反应产物 的荧光强度确认抗体的叠氮化标记效率。扫描化合物1与2反应产物的发色光谱，确定最 大发射波长为465 nm，明显高于化合物1和化合物2 (图2)。根据测定的各反应体系 的荧光强度，绘制不同浓度的化合物1与2反应产物的荧光强度标准曲线(图3，每个化 合物含有一个叠氮基团)，换算得知抗体标记效率为每一分子抗体约标记6个叠氮基团。实施例5
叠氮标记抗体的灵敏度分析
采用酶联免疫吸附分析法测定叠氮标记抗体的检测灵敏度。向96孔酶标板中加入超 声破碎的100 μ L膜抗原5 μ g，37 ° C包被2 h后采用1% BSA 4 ° C封闭过夜，随后加入100 μ L系列稀释的浓度相同的叠氮标记的抗体、FITC标记的抗体和罗丹明标记的 抗体(10、1、0.1、0.01、0.001、0.001 和 0.0001 yg/mL)，室温反应 3 h。充分洗涤 后，向叠氮标记反应组中加入含有0.5 mmol/L化合物2、0.2 mmol/L Tris-triazoleamine、 1 mmol/L CuSO4及2 mmol/L抗坏血酸钠的PBS溶液，洗涤后，测定365 nm激发光下每 孔的荧光强度，发射波长为实施例4中确认的最大发射波长；FITC标记的抗体和罗丹明 标记的抗体以相应激发波长(488 nm和570 nm)激发并分别测定518 nm和590 nm下的 荧光强度.三者的EC5tl值几乎一致，均约为1 yg，其检出限也约为0.1 yg,即叠氮标 记抗体的检测灵敏度与已有的商品化的标记试剂NHS-FITC和NHS-罗丹明的检测灵敏度 相当，检测限一致，能够作为一种有效的补充方法应用于免疫荧光分析中。实施例6
免疫荧光分析
将人乳腺癌细胞系SK-BR-3于含有10% FBS的RPMI 1640培养基中培养3天，然后 将1.25 X IO5细胞转移到激光共聚焦培养板中培养过夜，随后以4%多聚甲醛室温固定30 min,充分洗涤封闭后，加入lmg/mL叠氮标记抗体，室温反应3 h后加入含有0.5 mmol/ L 化合物 2、0.2 mmol/L Tris-triazoleamine> 1 mmol/L CuSO4 及 2 mmol/L 抗坏血酸钠的 PBS溶液催化反应，通过激光共聚焦显微镜在365 nm下观察。同时，采用相同的未标记 的抗体和对应的FITC标记二抗进行细胞荧光染色作为阳性对照，于488 nm下进行分析； 仅加入催化反应溶液而未加入一抗的细胞作为阴性对照组于365 nm下观察。在采用叠氮 标记抗体染色分析时，365 nm下可以明显地观察到蓝色荧光(图5B)，而在未加入抗体 的阴性对照中几乎没有荧光信号(图5A)；在阳性对照中，采用FITC标记的二抗进行免 疫荧光染色分析，且荧光定位与使用叠氮标记抗体染色结果一致(图5C)，即本发明开 发的方法无论在检测灵敏度，还是在检测结果的准确性上均与已有的方法相同，可以被 广泛应用于免疫荧光检测分析中。实施例7
复合染色分析
将人乳腺癌细胞系SK-BR-3以含10% FBS的RPMI 1640培养3 d，然后，将1.25 X IO5细胞转移到激光共聚焦培养皿中，培养过夜，经PBS洗涤后加入4%的多聚甲醛 固定，充分洗涤封闭后同时加入叠氮标记Anti_HP15、兔抗EGFR4抗体和生物素化的 抗GRP94抗体，室温反应Ih后，在培养皿中加入0.5 mmol/L化合物2、0.2 mmol/L Tris-triazoleamine、1 mmol/L CuSO4 及 2 mmol/L抗坏血酸钠的 PBS 溶液，室温反应 1 h， 充分洗涤后，向培养皿中加入FITC标记羊抗兔IgG和strepadivin_CY3，室温1 h后，充 分洗涤，以激光共聚焦显微镜分别观察365 nm、488 nm和550nm激发光下的荧光信号。 当激发波长为365nm时，在细胞膜的内测可观测到明显的蓝色荧光信号(图6A)，即化 合物2在改变电子分布后产生自发荧光；在488 nm激发光下，在细胞膜外侧可观测到明 显的FITC绿色荧光信号(图6B)；在550 nm激发光下，可以观测到明显的Cy3红色荧 光信号(图6C)。荧光信号叠加结果如图6D显示，3种荧光信号可以进行有效合并， 并且信号互不干扰，即叠氮标记后的荧光抗体分析方法可以与已有的常规方法并用。实施例8
荧光试剂的合成与显色分析分别将 Cy3、Cy5、FITC> TRITC、ΡΕ、DAPK Texas red、RB200、Indo-l> 量子点
等荧光基团进行化学修饰，使之含有炔基基团。随后依据实施例6进行点击化学反应， 使炔基与抗体上的叠氮基团反应，形成稳定的三唑环，进而使得被检测样品具备发光功 能，便于检测。
实施例9
荧光试剂的合成与显色分析
分别将含有His、GST、FLAG、HA、Myc生物素等标签基团进行化学修饰，使之含
有炔基基团。随后依据实施例6进行点击化学反应，使炔基与抗体上的叠氮基团反应， 形成稳定的三唑环，随后加入各种标签对应的亲和配体，进而使得被检测样品具备发光 功能，便于检测。
权利要求
1.一种新的免疫荧光标记方法，其特征在于以含有活化氨基基团和叠氮基团的双功能化合物作为蛋白质标记物，其中的活化氨 基基团能与蛋白质中的氨基反应，从而使被标记蛋白质含有叠氮基团，进而通过叠氮基 团与叠氮反应基团之间的点击化学反应，使蛋白质具备发光功能或偶联可被检测的标签基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的叠氮反应基团是能与叠氮基团形成 三唑环的炔基化合物，其自身具备发荧光特性或含有标签基团。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的具备发荧光特性的基团包括Cy3、 Cy5、FITC> TRITC、ΡΕ、DAPK Texas red> RB200、Indo-1 和量子点。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的标签基团包括His、GST、FLAG、 HA和Myc生物素。
5.权利要求1所述方法在抗体的荧光标记及免疫荧光分析方法中的应用。
全文摘要
一种新的免疫荧光标记方法。本发明分别合成了含有叠氮基团和炔基基团的两个关键化合物，将前者与抗体偶联获得叠氮化IgG，再与含有荧光基团的后者进行点击化学反应，实现荧光显色。采用该技术，在细胞水平进行染色分析，叠氮标记抗体可有效应用于免疫荧光染色分析；并且采用本发明开发的方法标记的抗体可与其他现有的免疫荧光技术同时使用，且结果互不干扰。本发明通过开发一种新型的抗体标记技术，建立了一种新的免疫荧光抗体分析方法，丰富了免疫荧光抗体检测手段，在未来的免疫研究中具备发展潜力和广泛应用前景。
文档编号G01N33/533GK102012425SQ20101061028
公开日2011年4月13日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者侯洁, 张奇, 潘鹏炜, 白芳, 白钢, 高智慧 申请人:南开大学