专利名称：一种微囊藻毒素mc-rr快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种微囊藻毒素MC-RR的快速检测试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术：
微囊藻毒素(Microcystin，简称MC)是蓝藻产生的一类天然毒素。而科学家的研 究表明，被微囊藻毒素污染的饮用水和水产品，给人类健康带来了巨大威胁。微囊藻是一类 卑微的生物，但它们有时会表现出超乎寻常的生命力。不论常规的自来水处理工艺，还是将 水煮沸，都难以有效去除微囊藻毒素。研究显示，即使在300摄氏度高温下微囊藻毒素仍然 可以保留一部分活性。微囊藻毒素在我国存在最普遍，含量相对较多的是MC-LR和MC-RR，其中L、R分别 代表亮氨酸、精氨酸。微囊藻毒素MC-RR，是一类具生物活性的单环七肽，其化学结构式，如 图1所示。微囊藻毒素水华的频繁暴发严重威胁着生态安全和人类的饮水安全，对水中微 囊藻毒素及时准确的监测非常重要。目前对水体中微囊藻毒素检测技术的研究开发非常 活跃，主要有高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、酶联免 疫吸附试验(Emzyme-Linkde Immunosorbent Assay, ELISA)以及蛋白磷酸酶酶抑制试验 (Protein Phosphatase Inhibition Assay, PPIA)等。常规的理化检测方法，特别是液相色谱和质谱分析设备体积庞大、价格昂贵、需要 环境条件较高的室内环境、而且还需要专门的技术人员操作、前处理复杂、检测费用昂贵； 并且由于微囊藻毒素异构体众多，且性质近似，缺少相应标准品，成为微囊藻毒素大规模筛 查的限制条件。而磷酸酶酶抑制试验虽然都能很好地检测出毒素，但是存在灵敏度不高或 检测过程繁琐，样品能量小等不足。酶联免疫吸附试验(ELISA)是基于抗原一抗体特异性 反应的分析方法，具有检测特异性强、灵敏度高、分析能量大、检测速度快、费用低廉等优 点，而且能适应大规模样品的快速筛查和预警监测而被人们所重视和采用。酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)是将酶的催 化反应与抗原抗体的免疫学反应结合起来的一种检测技术。由于抗原、抗体反应的高度专 一性，加之酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，因此能使测定方法达到很高 的特异性和灵敏度。ELISA方法作为体外诊断及科学研究的手段，集中了抗原抗体反应的特 异性和酶促反应的放大作用，理想的底物显示信号使其结果的判读更为客观、简单和快捷。水中微囊藻毒素MC-RR的ELISA快速检测试剂盒还未见有此类专利报道。本实用 新型专利利用ELISA技术建立了检测水中微囊藻毒素MC-RR的快速检测试剂盒及其检测方 法。
实用新型内容本实用新型需要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强、使用方便、可以 快速地检测水中微囊藻毒素MC-RR的ELISA快速检测试剂盒，以及这种试剂盒的检测方法。[0009]为了解决上述技术问题，本实用新型的技术方案是用于检测水中微囊藻毒素 MC-RR的ELISA试剂盒的组成包括盒体，在盒体内设有微囊藻毒素MC-RR酶标物、微囊藻毒 素MC-RR标准品、包被微囊藻毒素MC-RR抗体的酶标板、酶标物稀释试剂、洗涤试剂、显色试 剂A、显色试剂B、终止试剂、标本稀释试剂。本实用新型还提供一种水中微囊藻毒素MC-RR的ELISA检测方法。本实用新型试剂盒的检测原理为一种微囊藻毒素MC-RR快速检测试剂盒是直接竞争酶联免疫吸附实验(ELISA)。 已知微囊藻毒素MC-RR浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。微囊 藻毒素MC-RR标准品和样品中的抗原竞争性地与酶标板上的微囊藻毒素MC-RR抗体结合。 再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入显色试剂A、B，和酶结合物同时作用， 产生颜色，颜色的深浅和样品中微囊藻毒素MC-RR的浓度呈比例关系。本实用新型中检测结果分析过程为用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度 平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(Btj)再乘以100%，即百分吸光度值。 计算公式为百分吸光度值(％)= (B/B0) X 100%以微囊藻毒素MC-RR标准品浓度(μ g/L)值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标 准曲线图。用同样的办法计算样品的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度则可从标准 曲线上读出样本中微囊藻毒素MC-RR的含量。与现有技术相比，本实用新型具有如下的积极效果(1)本实用新型首次公开了一种检测水中微囊藻毒素MC-RR的ELISA试剂盒及检 测方法，可定性或定量分析样品中的微囊藻毒素MC-RR，适合工厂生产；(2)简单快捷。本实用新型的试剂盒所有试剂均为已配制好的工作液，可以直接 操作无需处理，减少了操作步骤，可以快速，灵敏检测水环境或藻类制品中的微囊藻毒素 MC-RR，避免了复杂的操作，对设备要求低，可以适应多种检测环境，以及多种检测需要；并 且本实用新型的试剂盒样本用量小，试剂保存时间长，对操作者无毒性，对环境无污染等；(3)灵敏度高。最小的检测浓度小于等于0. 10ng/ml ；(4)特异性强。与其它微囊藻毒素结构类似物交叉反应率小于20% ；(5)重复性好。板内、板间变异数均小于10% ；(6)准确性高。回收率高。一般大于70%。
图1 微囊藻毒素MC-RR的化学结构式；图2 检测微囊藻毒素MC-RR的试剂盒示意图；1、微囊藻毒素MC-RR标准品，2、显色试剂A、B，3、微囊藻毒素MC-RR酶标物酶标物4、酶标物稀释试剂，5、标本稀释试剂，6、洗涤试剂，7、终止试剂，8、包被微囊藻毒 素MC-RR抗体的酶标板图3 微囊藻毒素MC-RR快速检测试剂盒的标准曲线图；图4:人工抗原的合成图。4具体实施例具体实施例1人工抗原的合成及鉴定微囊藻毒素MC-RR是一种小分子多肽，分子量为1038. 2，是一种典型的半抗原。将 它与载体蛋白结合而形成免疫抗原。为满足研究需要，我们将MC-RR分别与两种载体蛋白 结合，制备了免疫抗原和包被抗原。如图4所示。1免疫抗原的制备微囊藻毒素MC-RR和匙孔血蓝蛋白KLH采用“活泼酯法”偶联，按合成反应式(1) 用 0. ImL DMF 溶解 0. 5mgMC_RR，加入溶解于 DMF 的 EDC · HCl 0. 75mg 和 NHS 0. 75mg,振荡 5min,室温反应30分钟，4°C冰箱过夜，得MC-RR活泼酯衍生物(I ) Jmg KLH溶于3mL0. IM pH9. 6碳酸盐缓冲液中，将上述MC-RR活泼酯衍生物(I )缓慢滴加入KLH溶液中，混勻，避 光室温反应2小时。用0. OlM PBS透析三天后分装，-20°C保存。抗原的鉴定采用紫外图谱分析法进行鉴定，通过波长200 400nm范围内的紫外 光谱扫描是鉴定偶联物合成是否成功的常用方法。在波长238nm，测得偶联比为17。注意KLH溶解时，轻轻摇勻，禁止剧烈振荡。2包被抗原的制备微囊藻毒素MC-RR和牛血清白蛋白采用“碳二亚胺法”偶联，按合成反应式(2)， 0.5 mg微囊藻毒素MC-RR溶解于0.25mL乙醇中，再加入0. 75mL去离子水，然后加入132 mgEDC · HC1，逐滴加入溶于lmL25%乙醇的2mgBSA，随后再加入132 mgEDC · HC1，混勻，4°C 反应过夜。用0. OlM PBS透析三天后分装，-20°C保存。具体实施例2微囊藻毒素MC-RR抗体的制备以微囊藻毒素MC-RR作为免疫原，第一次免疫1ml弗氏完全佐剂(FCA)与IOOug 抗原/ Iml PBS (一只兔子用量)充分研磨混勻，达到“油包水”的状态，分四点注射双腋 下、腹股沟；第二次免疫间隔4周，换用弗氏不完全佐剂，其余同第一次免疫；第三次免疫间隔4周，换用弗氏不完全佐剂，其余同第一次免疫；测定血清效价，间接ELISA，IOug / ml抗原包被，效价1:64000以上可以放血，也 可以再加强免疫一次生理盐水稀释抗原，耳缘静脉注射，一周内放血。具体实施例3微囊藻毒素MC-RR酶标物的制备酶标记抗体中的酶为辣根过氧化物酶(HRP)，HRP-微囊藻毒素MC-RR酶标记物采 用戊二醛交联法制备，具体如下1.取 IOmg HRP 溶于 0. 2 mLl. 25% 戊二醛(用 0. 01mol/L、pH6. 8 磷酸盐缓冲溶液 将25%戊二醛稀释为1. 25%)，室温(20°C左右)反应结合18h ；2.用0. 15mol/LNaCl平衡过的kphadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛， 或用 0. 01mol/L, ρΗ7· 2 PBS，4°C透析过夜；3.将5mg微囊藻毒素MC-RR抗体溶于ImLO. 15mol/L NaCl,再与醛化HRP溶液 (10mg/mL)混合；4.加入0. ImL lmol/L pH9. 6碳酸盐缓冲液(调节pH至9. 0 9. 6)，4°C，电磁搅 拌下结合Mh ；5.加入0. ImLO. 2mol/L赖氨酸(0. 29g溶于IOmL蒸馏水)，4°C放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应；6.装入透析袋，以 0. 01mol/L、pH7. 2 PBS，4°C透析过夜，或通过 kphadex G-200 凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1峰洗脱液，加入等量60%甘油，测工作效价后，小量分装， 4°C或_20°C保存。具体实施例4检测微囊藻毒素MC-RR直接竞争ELISA试剂盒的组建ELISA检测试剂盒包括以下组分1.微囊藻毒素MC-RR标准品浓度分别为 0 μ g/L、0. 1 μ g/L、0. 25 μ g/L、0. 50 μ g/ LUyg/L 和 2μβ/1，共六瓶；2.包被微囊藻毒素MC-RR抗体的96孔聚苯乙烯酶标板，其制备方法如下按照常规方法用离子强度为0. 05mol/广0. 10mol/L, pH9. 0 9. 6碳酸盐缓冲液稀 释包被抗体，将适量的包被抗体溶液加在聚苯乙烯酶标板上，4°C过夜。次日，加磷酸盐缓冲 液洗板后，拍干，用包被液量1509^200%体积比的BSA溶液(3g/L)封闭。然后，在硅胶干燥 器内放置过夜，加干燥剂密封包装；3.微囊藻毒素MC-RR酶标物HRP_微囊藻毒素MC-RR酶标物浓度为1_10 mg/L ；4.底物显色液:A液为0. lmol/L pH值为5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成 0. 3%过氧化氢储备液，每ImL缓冲液加入15 μ L储备液，制成使用液；B液为四甲基联苯胺， 先用丙酮配成0. 2mg/mL溶液，用0. lmol/L pH值为5. 0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成 0. 2mg/L 溶液；5.洗涤液含0. 05%吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7. 4 ；6.酶标物稀释液含0. 01%吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7. 4 ；7.样品稀释液含0. 1%吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7. 4 ；8.终止液2. Omol/L 的 H2SO4 溶液；9.盖板膜为8cmX 12cm遮光防水不胶膜，可在潮湿环境下多次使用；10. 一次性滴管，包括广3mL —次性塑料刻度滴管；所有试剂在盒内按使用顺序摆放，试剂盒的保存温度为4°C保存。具体实施例5样品中微囊藻毒素MC-RR的检测1.样品前处理取待测水样，用样品稀释液1:10稀释，制备样品溶液。2.试剂盒检测(1)将向包被微囊藻毒素MC-RR抗体的酶标板中加入样品或微囊藻毒素MC-RR标 准品，并加入微囊藻毒素MC-RR酶标物，同时设置空白和阴性对照孔；(2)轻轻振荡30秒，37°C 30分钟；(3)倾去孔内的液体，用洗涤液注满各孔，然后倒掉洗涤液，如此反复2-5次，最后 一次在吸水纸上拍干；(4)加入显色溶液A、B到酶标板孔中，37°C反应10-15min，颜色显蓝色，再加入终止液，立即变成黄色；(5)用酶标仪读出0D450nm值，以不加微囊藻毒素MC-RR酶标物的小孔作为空白调零。3.结果分析绘制标准曲线，相对应每一个样品中微囊藻毒素MC-RR的含量可从标准曲线上读6出，也可以用回归方程计算出样品中微囊藻毒素MC-RR的含量。测得的吸光度与样品中的 微囊藻毒素MC-RR含量成反比，可通过标准曲线计算微囊藻毒素MC-RR的含量。 虽然结合以上实施例来描述本实用新型，但应当理解本实用新型并不限于所公开 的实施例和附图，而是覆盖了落在本实用新型精神和范围内的所有修改和变形。
权利要求1. 一种微囊藻毒素MC-RR快速检测试剂盒，组成包括微囊藻毒素MC-RR酶标物、 微囊藻毒素MC-RR标准品、包被微囊藻毒素MC-RR抗体的酶标板、酶标物稀释试剂、洗涤试 剂、底物试剂、显色试剂、终止试剂、标本稀释试剂。
专利摘要本实用新型提供一种微囊藻毒素MC-RR的快速检测试剂盒。试剂盒的组成包括微囊藻毒素MC-RR酶标物、微囊藻毒素MC-RR标准品、包被微囊藻毒素MC-RR抗体的酶标板、酶标物稀释试剂、洗涤试剂、显色试剂A、显色试剂B、终止试剂、标本稀释试剂。本实用新型还公开了一种应用上述试剂盒检测水中微囊藻毒素MC-RR的方法，它包括首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。应用ELISA试剂盒检测水中的微囊藻毒素MC-RR，具有检测特异性强、灵敏度高、分析能力大、检测速度快、费用低廉等优点，能适应大规模样品的快速筛查和预警监测。
文档编号G01N33/543GK201828561SQ20102054817
公开日2011年5月11日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者单金莲, 孙秀兰, 张根义, 朱程琳, 杜前明, 赵春城, 郑立功, 陈波 申请人:无锡百奥森科技有限公司