专利名称：基因毒性测试的制作方法
基因毒性测试本发明涉及用于检测导致或加剧基因组损伤的试剂的方法，且涉及可应用于此类方法的分子和转染的细胞系。具体而言，本发明涉及用于在人细胞培养物和其他哺乳动物细胞系中检测基因组损伤的生物传感器。基因组损伤可通过DNA损伤发生，DNA损伤由多种试剂(agent)如紫外光、X射线、 自由基、甲基化剂和其他诱变化合物所诱导。基因组中染色体的数量亦可由称作非整倍体诱发剂(aneugen)的化合物所改变。DNA损伤/或非整倍体诱发作用(aneugenesis)亦可间接地由影响与DNA相互作用的酶和蛋白质(包括聚合酶和拓扑异构酶)的试剂或通过前诱变剂(promutagen)(可代谢称为诱变剂的试剂)所导致。任何这些试剂可导致对包含生物遗传密码的DNA的损伤，并导致基因中的突变。在动物中，此类染色体数量的突变或改变可导致致癌作用或可损伤配子以导致后代中的先天性缺陷。此类DNA损伤剂可统称为基因毒素(genotoxin)。这些DNA损伤剂可化学地修饰组成DNA的核苷酸，打断连接核苷酸的磷酸二酯键， 或破坏碱基之间的联系(T-A或G-C)。其他基因组损伤剂可对DNA的结构组分(例如组蛋白)，核和细胞分裂的机制(例如纺锤体形成)，或基因组维持系统如拓扑异构酶和聚合酶有作用。为了对抗这些DNA损伤剂的作用，细胞进化出了大量机制。举例而言，大肠杆菌中的SOS应答是充分表征的(well-characterized)的由DNA损伤诱导的细胞应答，其中表达了一系列蛋白质，包括DNA修复酶，该酶修复损伤的DNA。在哺乳动物中，系统如核苷酸切除修复和碱基切除修复机制在DNA损伤修复中起突出作用，并且是用于去除大量DNA加成物 (adduct)和修饰的碱基的主要机制，而非同源末端连接和同源重组在链断裂的修复中是重要的。这些系统的大多数亦导致细胞周期停滞以允许细胞在进行细胞分裂之前进行修复。在许多情况下，鉴定何种试剂可导致或加剧基因组损伤是重要的。检测导致基因组损伤的试剂在当评估将个体暴露于这些试剂是否安全时是特别重要的。举例而言，检测这些试剂的方法可用作基因毒性测定以供筛选作为候选的药物、食物添加剂或化妆品的化合物以评估目标化合物是否诱导基因组损伤。或者，检测基因组损伤剂的方法可用于监测包含诱变化合物的污染物对水源的污染。多种用于确定试剂的基因毒性方法，如Ame s测试，体外微核试验和小鼠淋巴瘤测定(MLA)是已知的，但由于多种原因，是不尽如人意的。举例而言，样品的培育 (incubation)可花费许多周，而通常需要在更短的时间框架中获得基因毒性数据。此外， 许多已知的检测DNA损伤的方法(包括Ames测试和相关方法)测定的是作为终点的持续 DNA损伤，其为错误修复的DNA (突变和重组)的形式，或者为片段化DNA形式的未修复损伤。然而，多数DNA损伤在可测量此种终点之前即已修复，且持续DNA损伤仅在如此恶劣以致使得修复机制饱和的条件下发生。DNA损伤可经正确地修复，或不准确地修复从而创造突变。该突变终点可在DNA修复之后测得。持续DNA损伤如DNA双链断裂是致死的。在WO 98/44149中公开了改善的基因毒性测试，其涉及包含酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiaie)调节元件可操作地连接于DNA序列的重组DNA分子，所述元件响应DNA损伤激活基因表达，而所述DNA序列编码发光报道基因如绿色荧光蛋白(GFP)。此类DNA分子可用于转化酵母细胞以用于供检测导致或加剧DNA损伤的试剂的存在的基因毒性测试。可对该细胞施以试剂，而来自细胞的发光报道基因(GFP)的表达表明该试剂导致DNA损伤。WO 98/44149中描述的基因毒性测试检测可防止达到终点的修复活性的诱导。 WO 98/44149中描述的方法可因此用于检测DNA损伤剂的存在。US 6，344,3 公开了包含仓鼠GADD153上游启动子区的调节元件连接于编码GFP 的DNA序列的重组DNA分子，所述元件响应广泛范围的细胞应激条件而激活基因表达。该报道系统实现于人头颈鳞状细胞癌细胞系中。然而，与该报道系统相关的问题为其需要在导致少于10%的细胞存活的测试剂浓度的至少四日的处理期，然后通过流式细胞计量术分析荧光。此外，用在该毒性水平的试剂测试时任何基因诱导的生物学相关性值得商榷。此外，该发展并未公开特异性监测可导致或加剧DNA损伤的试剂的存在的手段，且GADD153诱导的机制依旧不明。因此，该系统作为人DNA损伤生物传感器的作用非常有限。PCT/GB2005/001913公开了包含人GADD45a基因的调节元件连接于发光蛋白质的重组DNA分子。该报道系统允许基因毒性测定在正常毒性范围内迅速高通量地检测基因
ο本发明实施方案的一个目标是解决与现有技术相关的问题，并提供改善的生物传感器以供在人细胞培养物中检测基因组损伤。根据本发明的第一个方面，提供了包含编码Gaussia萤光素酶(GLuc)报道基因及其衍生物的DNA序列的表达盒，该DNA序列可操作地连接于人GADD45 α基因启动子和人 GADD45 α基因调节元件，其配置为响应基因组损伤激活所述编码Gaussia萤光素酶(GLuc) 报道基因的DNA序列的表达。术语“调节元件”意指调节与其相联系的基因，即编码Gaussia萤光素酶(GLuc)报道蛋白的DNA序列的转录的DNA序列。术语“可操作地连接”意指该调节元件能够诱导GLuc报道蛋白的表达。根据本发明的第二个方面，提供了包含根据第一个方面的表达盒的重组载体。根据本发明的第三个方面，提供了包含依照本发明第二个方面的重组载体的细胞。根据本发明的第四个方面，提供了检测导致或加剧基因组损伤的试剂的存在的方法，包括对依照本发明的第三个方面的细胞施以试剂；和监测来自该细胞的GLuc报道蛋白的表达。本发明第四个方面的方法代表了新颖的经济合算的基因毒性筛选，其可用于提供调节前(pre-regulatory)筛选测定，以供由医药产业和在其他需要测试大量试剂或化合物的应用中使用。其比现存的体外和体内哺乳动物基因毒性测定提供了更高通量和更低化合物消耗，并且对于广泛范围的基因毒素是灵敏的。本发明的第四个方面的方法适用于评估试剂是否可能导致基因组损伤。“基因组损伤”包括影响DNA结构组分(例如组蛋白)的试剂，包括组蛋白脱乙酰化抑制剂，影响核和细胞分裂机制(例如纺锤体形成)的试剂，或影响基因组维护系统如拓扑异构酶和聚合酶和DNA修复系统的试剂。还包括DNA损伤，如核苷酸的化学修饰或核苷酸的插入/缺失 /取代；以及染色体数量和DNA合成的改变。优选地，“基因组损伤”意指DNA损伤。检测导致基因组损伤的试剂在当评估将个体暴露于基因组损伤试剂是否安全时
4是特别重要的。举例而言，该方法可用作基因毒性测定以供筛选已知试剂，如候选的药物、 医药和工业化学品、农药、杀真菌剂、食物或化妆品，是否诱导基因组损伤。或者，本发明的方法可用于监测含基因组损伤剂的污染物对水源、浸出液和流出物的污染。描述于PCT/GB2005/001913的现存的基因毒性测定，使用包含连接于发光蛋白 GFP的人GADD45ci基因的调节元件的重组DNA分子。该系统允许使用荧光光谱的基因毒性测定在正常毒性范围内高通量检测基因毒素。本发明人决定开发其他的基因毒性测定，其中可通过生物发光检测报道蛋白。使用生物发光而非荧光以测定报道蛋白表达具有许多优势。首先，本身具荧光的测试化合物可影响荧光报道蛋白的表达的检测。如果使用生物发光报道蛋白，这不会是问题，因为测试化合物很少或几乎不可能是生物发光的。因此生物发光报道蛋白的使用会限制测定中由荧光蛋白和试剂导致的任何干扰，这表明可测定更大范围的测试化合物。同样，因为用于该测定的测试化合物为非常罕见地生物发光的，这表明在使用发光报道蛋白的基因毒性测定中需要包括的对照反应较少。因此，可平行测定更多数量的测试化合物。同样，无需包括使用破坏的或突变的发光报道蛋白的对照反应。萤光素酶是一系列在生活的生物中催化光产生化学反应的酶。它们是生物发光报道蛋白的实例。它们的表达可使用能够进行发光读数的合适的微板读数器来监测。它们可用于基于生物发光的测定。生物发光是在多种生物中进化出的化学发光的形式。通过不同的进化历史，衍生出了许多不同类型的生物发光。这些类型在其化学性质上具有广泛分歧，但它们均进行类似的化学反应，即二氧杂环丁烷(dioxetane)的生成和破坏。该类型完全基于萤光素酶与发光底物萤光素的相互作用。已从广泛范围的不同生物包括细菌、甲虫(例如萤火虫和叩头虫(click beetle))、Reni 1 la、Aequorea、Vargula 和 Gonyaulax ( 一种甲藻)和甲壳类克隆了萤光素酶。目前有许多种不同的萤光素酶可供用于生物发光测定。发明人决定将两种不同的萤光素酶的性质与GFP在基因毒性测定中进行比较。他们希望确定何种萤光素酶会最适合在基因毒性测定中用作生物发光报道蛋白。他们选择萤火虫萤光素酶(FLuc)进行研究，其为目前最常用的生物发光报道蛋白。他们还选择研究Gaussia萤光素酶(GLuc)的性质，该酶分离自Gaussia，一种哲水蚤挠足类(calanoid cop印od)，并不常作为报道蛋白用于生物发光测定。出乎他们意料之外，发明人鉴定了 Gaussia萤光素酶(GLuc)当用于基因毒性测定时的多种有利特性。当连接于GADD45ci基因元件时，GLuc作为基因组修复活性的信号在细胞中累积，且甚至在细胞死亡之后仍存留。同样GLuc在基因组修复完成时作为可测量的报道蛋白存留。与之相对，FLuc作为报道信号无法与GLuc存留一样长。这些差异表明使用 GLuc的基因毒性测定可用单个取样时间点进行以获得测试化合物的基因毒性的量度，而这对于FLuc是不可能的。该优势主要是因为下述事实FLuc是不稳定的蛋白，具有较短的半衰期。在基因毒性测定中使用GLuc而非FLuc作为报道蛋白的这些优势是未知的，且在发明人进行的研究之前是无法预测的。事实上，直至本发明，GLuc尚未作为报道蛋白用于基因毒性测定。此外，GLuc蛋白从细胞分泌，而FLuc则不。因此，当在基因毒性测定中使用FLuc作为报道蛋白时，必须裂解具有FLuc的细胞以准确测量FLuc表达水平。与之相对，GLuc 蛋白从细胞分泌，这表明当在下述基因毒性测定方法中用作报道蛋白时，通常无须裂解具有GLuc的细胞以测定GLuc表达水平。因此，使用GLuc而非FLuc作为报道蛋白意味着无须裂解细胞，从测定方法中省去了试剂添加步骤和温育步骤。基于这些发现，发明人开发了基因毒性测定，其中Gaussia萤光素酶(GLuc)表达由GADD45ci基因元件调节。该测定相对现存的基于FLuc的基因毒性测定和生物发光测定具有改进该测定可用于测量荧光测试化合物的基因毒性；在该测定中荧光化合物和试剂几乎不导致干扰；GLuc的使用意味着该测定可用单个取样时点进行以获得测试化合物的
基因毒性的量度。此外，当用于本发明的方法的基因毒性测定中时，GLuc介导的生物发光具有令人意想不到的高“信噪”比，如所附实施例中所述。这种改善的比例允许发明人开发出使用比对于基于荧光的测定而言容易使用的测定液更少体积的测定液的基于生物发光的基因毒性测定。作为直接结果，使用GLuc介导的生物发光的基因毒性测定可使用384孔微滴定板进行。与之相对，使用384孔微滴定板用于类似的基于荧光的报道测定是困难的，因为测定液体积的减少意味着细胞数量的减少，而因此意味着不良的“信噪”比。因此，本发明方法的基于生物发光的基因毒性测定可比用基于荧光的测定更方便地用于更高通量的筛选系统。这可使得测定能够用较少量的测试化合物进行，并可允许每测定微板测试更多化合物。术语“Gaussia萤光素酶(GLuc)报道蛋白及其衍生物”包括来源于海生挠足类 Gaussia princeps的蛋白，其当表达时可由萤光素酶测定所检测。编码GLuc蛋白的核酸序列可从许多不同公司商业获得；例如，Nanolight (www. nanolight, com)。其目前并未在测定方法中广泛用作报道蛋白。优选地，Gaussia萤光素酶(GLuc)报道蛋白在生物发光反应中催化腔肠荧光素 (coelenterazine)的氧化。腔肠荧光素+ — coe Ienteramide+ 光导致大量和可测量的发光的发射。编码此种蛋白的核苷酸序列可从多种不同来源获得；例如GenBank登录号 AY015993。GLuc的衍生物包括编码保留发光活性的GLuc多肽类似物或多肽片段的DNA序列。编码“人源化”Gaussia萤光素酶(GLuc)报道基因的核酸可从可得自 Nanolight (www. nano light, com)的质粒获得。该“人源化” GLuc基因的核酸序列已针对在人细胞系中的表达进行了优化。编码Gaussia萤光素酶(GLuc)的DNA序列的实例在本说明书的实施例部分末尾示于SEQ ID N0:1的沈41-3198位。因此本发明一个优选的实施方案是其中Gaussia萤光素酶(GLuc)报道蛋白是由SEQ ID NO 1的沈41_3198位所示的核苷酸序列编码的。GLuc产生高量子产率的光，不需要ATP，并可容易地通过商业上可获得的发光计检测。根据本发明第三个方面的包含编码GLuc报道蛋白的DNA分子的细胞，可根据本发明第四个方面的方法使用。令人惊讶的是，根据本发明第一个方面在表达盒中除了人GADD45 α基因启动子
6之外使用人GADD45ci基因调节元件从根本上增强了该盒对基因毒性应激的响应，并因此增强了对根据第三个方面的细胞中的基因组损伤的响应。有利地，可简单地通过在测试培养中测定该报道蛋白的活性在仅48小时之内或仅48小时之后就该报道蛋白的表达来分析该盒。可对细胞施以测试剂或化合物，且细胞中报道蛋白的表达表明该测试剂是否导致基因组损伤。发明人发现编码人GADD45a基因启动子和人GADD45 α基因调节元件的DNA可以可操作地连接于报道蛋白以形成根据本发明第一个方面的盒，然后有利地用于根据本发明第四个方面的基因毒性测试。此类盒可包含整个GADD45ci基因(包括编码序列)，只要其可操作地连接于编码GLuc报道蛋白的DNA。举例而言，可根据本发明第一个方面使盒包含整个，或基本上全部GADD45ci基因(包含调节元件和启动子)，其中编码GLuc报道子的DNA 插入GADD45 α启动子的3’(例如，在GADD45 α编码序列之内或在该编码序列的3’)并配置为响应基因组损伤激活所述编码GLuc报道蛋白的DNA序列的表达。优选地，人GADD45 α基因启动子序列诱导RNA聚合酶结合于DNA分子并起始转录所述编码GLuc报道蛋白的DNA。优选该启动子序列包含人GADD45ci基因启动子序列和5’ 非翻译区。启动子序列可从示于
图1的PHG45-HC质粒获得。GADD45ci基因启动子的核苷酸序列显示为实施例末尾的SEQ ID NO 1的核苷酸97至沈40。应理解的是，启动子可包含碱基97-2640中的每一个，或者可为其功能衍生物或功能片段。功能衍生物和功能片段可方便地通过评估转录酶是否结合于推定的启动子区并会随后导致标志物蛋白的转录来加以鉴定。或者，此类功能衍生物和片段可通过当GADD45 α启动子与GADD45a基因天然结合时，在GADD45ci启动子上进行诱变并评估是否发生GADD45 α表达来进行检查。根据本发明的表达盒中的调节元件可包含GADD45 α基因启动子序列下游的序列。该调节元件可包含功能性DNA序列如那些编码供核糖体结合的翻译起始序列或结合在基因组损伤之后促进基因表达的转录因子的DNA序列。优选地，术语“调节元件”并不包括GADD45ci基因启动子序列。“调节元件”包括 GADD45 α基因的基因内序列。根据本发明的表达盒中的调节元件可包含GADD45 α基因的至少一个外显子。举例而言，所述调节元件可包含GADD45 α基因的外显子1、外显子2、外显子3和/或外显子 4，或至少其部分区，或其任意组合。因此，调节元件可包含GADD45ci基因四个外显子的任意组合，或至少其部分区。在一个优选实施方案中，所述调节元件包含GADD45 α基因外显子1的至少部分区，和优选地GADD45a基因外显子3的至少部分区，和更优选地GADD45 α基因外显子4 的至少部分区。特别优选所述调节元件包含GADD45ci基因外显子1的全部，和优选地 GADD45 α基因外显子3的至少部分区，和更优选地GADD45 α基因外显子4的全部。GADD45 α基因外显子3的核苷酸序列示为SEQ ID NO 1中的碱基3325-3562。 GADD45 α基因外显子4的核苷酸序列在序列表中示为SEQ ID NO :1的碱基4636-5311。替代地，或额外地，所述调节元件可包含非编码DNA序列，例如，GADD45 α基因的至少一个内含子。举例而言，所述调节元件可包含GADD45ci基因的内含子1、内含子2和/ 或内含子3，或至少其部分区，或其任意组合。因此，所述调节元件可包含GADD45ci基因的三个内含子的任意组合，或至少其部分区。
在一个优选实施方案中，根据本发明的表达盒中的调节元件包含GADD45 α基因的内含子3的至少部分区。GADD45ci基因的内含子3的核苷酸序列示为序列表中SEQ ID NO 1 中的碱基；3563-46；35。在一个优选实施方案中，依照本发明的表达盒包含GADD45 α基因的启动子序列并且还包含见于基因组GADD45ci基因序列自身的内含子3内的基因调节元件。尽管发明人不愿拘于任何假说，但认为GADD45 α基因的内含子3包含推定的ρ53结合基序，且正是该Ρ53基序令人惊讶地增强了该表达盒对基因毒性应激的应答。该推定的ρ53结合基序在序列表中示为SEQ ID NO :1中的3746-3765。发明人还认为GADD45a基因的内含子3可包含推定的TRE基序，其可编码AP_1 结合位点。该推定的TRE基序在序列表中示为SEQ ID NO :1中的核苷酸碱基3795-3801。 因此，尽管发明人不愿拘于任何假说，但推测该推定的AP-I结合位点亦可贡献于对基因毒性剂的改善的应答。优选所述表达盒至少包含来自GADD45 α基因内含子3的p53结合基序和/或AP_1
结合基序。所述调节元件可包含GADD45 α基因的3’非翻译(UTR)区，其核苷酸序列示为SEQ ID NO 1中的碱基4750-5311。尽管发明人不愿拘于任何假说，但认为该3，UTR可涉及mRNA 盒的稳定化，并因此当与其余的调节元件如内含子3 —同使用时，可令人惊讶地为重要的。因此，根据本发明第一个方面的优选的表达盒包含人GADD45 α基因调节元件和人GADD45a基因启动子可操作地连接于编码Gaussia萤光素酶(GLuc)报道蛋白的DNA序列。最优选的表达盒包含人GADD45ci基因启动子可操作地连接于编码Gaussia萤光素酶 (GLuc)的DNA序列，禾口 GADD45 α基因的内含子3。在进一步的实施方案中，根据第一个方面的表达盒优选为如图2中所示的 ⑶532-GLuc。表达盒⑶532-GLuc的核苷酸序列在SEQ ID NO :2中给出，并对应于SEQ ID NO 1的97至5311位核苷酸。根据本发明第二个方面的重组载体可例如为质粒、粘粒或噬菌体。此类重组载体在复制表达盒时具有极大用途。此外，重组载体对于用表达盒转染细胞非常有用，且亦可促进报道蛋白的表达。重组载体可设计为使得载体会在细胞的胞质溶胶中自主复制，或可用于整合入基因组。在此情况下，在重组载体中可能需要诱导DNA复制的元件。合适的元件在本领域是公知的，且例如可来源于 pCEP4(Invitrogen,3Fountain Drive, Inchinnan Business Park, Paisley，PA49RF，UK)、pEGFP-Nl (BD Biosciences Clontech UK,21 In Between Towns Road, Cowley, Oxford, 0X4 LY, United Kingdom)或 pCI 禾口 pSI (Promega UK ltd, Delta house, chilworth Science Park, Southampton S016 7NS, UK)。此类复制载体可导致DNA分子在转化体中的多重拷贝，并因此在需要GLuc报道蛋白的过表达(和由此所致的增加的发光)时是有用的。此外，优选该载体能够在人、灵长类和/或犬类细胞中复制。优选该载体包含复制起点，并优选地，包含至少一个可选择标志物。该可选择标志物可赋予针对抗生素例如潮霉素或新霉素的抗性。合适的元件来源于 pCEP4质粒(Invitrogen, 3Fountain Drive, Inchinnan Business Park, Paisley, PA4 9RF, UK)。
在第一个实施方案中，根据第二个方面的重组载体优选为如示于图2中并在SEQ ID NO 1 中提供的 pEP-GD532-GLuc。根据本发明的第三个方面，将本发明的表达盒或重组载体并入细胞。优选该细胞为真核的。此类宿主细胞可为哺乳动物来源的细胞和细胞系。优选的哺乳动物细胞包括人、 灵长类、鼠类或犬类细胞。所述宿主细胞可为淋巴瘤细胞或细胞系，如小鼠淋巴瘤细胞。宿主细胞可为永生化的(immortalised)，例如，淋巴细胞。优选的宿主细胞为人细胞系。优选地，所述宿主细胞为具有完整功能性P53的人细胞系，例如ML-I (具有野生型p53的人髓性白血病细胞系；ECACC登录号88113007)， TK6(具有野生型p53的人类淋巴母细胞系；ECACC登录号95111725)。然而，亦涵盖宿主细胞系 WI-L2-NS(ECACC 登录号 90112121)和 WTKl (两者均为 TK6 的姊妹系(sister line) 并具有突变p53蛋白)。亦可使用H印G2(ECACC登录号85011430) ^P HepaRG(BioPredic ； http //pagesperso-orange. fr/biopredic/index. html)，月干·: !白勺 (ECACC General Office, CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, United Kingdom).发明人发现TK6人细胞对于根据本发明方法的用途是特别优选的细胞系。尽管发明人不愿拘于任何假说，但认为TK6细胞是最有用的，因为其具有完整功能性p53。用于表达由DNA分子编码的蛋白的宿主细胞理想地为稳定转染的，尽管并未排除对非稳定转染的(瞬时的)细胞的使用。根据本发明的第三个方面的转染的细胞可通过实施例中所述的下述步骤来制成。 该细胞理想地为人细胞系，例如TK6。此类转染细胞可根据本发明的第四个方面的方法来使用以评估试剂是否诱导或加剧DNA损伤。GLuc响应DNA损伤而受诱导，且由GLuc发射的光可容易地使用已知的适当技术进行测量。根据本发明的第三个方面最优选的细胞是用载体pEP-GD532-GLuc转化的TK6细胞。这些细胞在本文中称作GLuc-TOl。亦涵盖了根据本发明的表达盒可整合入宿主细胞的基因组。本领域技术人员会知道用于将该盒整合入基因组的合适方法。举例而言，可使表达盒携带于逆转录病毒载体上，该载体与包装细胞系的组合可产生无辅助病毒(helper-free)重组逆转录病毒，然后可将该病毒导入宿主细胞。然后可将该盒自身整合入基因组。合适的无辅助病毒逆转录病毒载体系统的实例包括具有BING逆转录病毒包装细胞系的pBabePuro质粒[Kinsella和 Nolan,1996. Episomal Vectors Rapidly and Stably Produce High-Titer Recombinant Retroviruses. Human Gene Therapy. 7 1405-1413.]。本发明的第四个方面的方法对于检测在低浓度诱导基因组特别是DNA损伤的试剂是特别有用的。该方法可用于筛选化合物，如候选的药物、食物添加剂或化妆品，以评估将生活生物，特别是人，暴露于此类化合物是否安全。或者，本发明第四个方面的方法可用于检测水源是否受基因组损伤剂或加剧基因组损伤的试剂所污染。举例而言，该方法可用于就可导致暴露于污染的人或其他生物中增加的基因组损伤的污染物的存在来监测工业流出物。本发明的方法优选通过培养用根据本发明第二个方面的重组载体(如 pEP-GD532-GLuc)转染的细胞，将该细胞用推定导致基因组损伤的试剂温育预定时间，并监测直接来自细胞样品的GLuc报道蛋白的表达来进行。发光检测和定量的合适方法对于本领域技术人员会是已知的，且该方法描述于实施例中。根据本发明的方法的一种优选实施方案，可从用pEP-GD532-GLuc转染的TK6细胞，例如，来自微板孔中的细胞记录发光读数。合适的微板的实例为96孔、白色、透明底 (clear-bottom)无菌微板(为了最优性能，推荐Matrix Technologies ScreenMates 目录号 4925)。同样，如上所讨论由于预料不到的高“信噪”比，本发明的基于发光的基因毒性测定方法可使用比对于基于荧光的测定容易使用的测定液较少的测定液进行(并因此使用较少的细胞和较少测试化合物)。作为直接后果，本发明方法可使用384孔微滴定板进行。因此合适的微板的进一步实例为384孔，黑色，无菌微板；合适的板亦可从Matrix Technologies ScreenMates 获得。可使用合适的微板读数器，例如具有注入器的Tecan Infinite F500来记录发光和吸光度测量。用于进行本发明第四个方面的方法的最优选的实验方案描述于所附实施例。可能存在来自GADD45 α -GLuc构建体的GLuc的背景(组成型)表达，因此细胞密度越高，培养物发光越多。为了校正任何来自生长的发光增加，将发光数据除以吸光度数据 (细胞密度)以给出‘亮度单位’，即每细胞的平均发光的量度。这独立于培养密度。相应地，吸光度的测量可主要用于标准化发光信号而非测量测试剂的基因毒性。相应地，涵盖了可与吸光度测量一同使用次级测定以通过细胞存活和细胞凋亡来确定毒性。举例而言，使用 Biovision Bioluminescence Cytotoxicity Assay(Biovision Incorporated,2455-D Old Middlefield Way, Mountain View, California 94043, USA) Vybrant Apoptosis Assay Kit(Molecular Probes Inc.,29851 Willow Creek Road, Eugene, OR 97402，USA)。根据本发明第四个方面的优选方法会使用根据本发明第三个方面的细胞(例如 GLuc-TOl)。应理解的是，一些非基因毒性化合物可通过细胞代谢而化学地改变。在哺乳动物中，该过程常常称作代谢活化(MA)。MA可将某些非基因毒性化合物(例如前诱变剂)转化为基因毒性化合物。最经常地，MA发生于肝脏。为此原因，通常优选调适基因毒性测试使得测试化合物的测定是在能够代谢化合物的肝脏提取物的存在或不存在下实施，正如其在体内受代谢一般。实施例4描述了根据本发明第四个方面的优选方法，其利用称作S9的肝脏提取物(对本领域技术人员是已知的)。此种提取物的纳入允许测定法检测仅在经过肝脏之后具有基因毒性的化合物。当在本发明的方法中使用S9肝脏提取物时，优选使用细胞染色确定细胞在群体中的密度。这是因为发明人如在实施例4中进一步所述，确定了发现用于估计细胞密度的光吸收测量的相对不灵敏度在S9代谢活化研究中导致测定对于前基因毒素 (pro-genotoxin)的降低的灵敏度。如下文实施例2中更加具体讨论，清楚定义来自常规测定的阳性和阴性结果是有用的，且此类定义来源于考虑到系统中的最大噪音和来自对其基因毒性和作用机制有明确共识的化合物的数据。
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当该测定包括S9肝脏提取物时，基因毒性阈值设为1. 5的相对GLuc诱导(即50% 增加)。因此若测试化合物产生大于该1. 5阈值的相对GLuc诱导则断定为阳性基因毒性结果⑴。当该测定不包括S9肝脏提取物时，基因毒性阈值设为1. 8的相对GLuc诱导(即 80%增加)。因此若测试化合物产生大于该1. 8阈值的相对GLuc诱导则断定为阳性基因毒性结果⑴。同样，在遗传毒理学领域，有时需要以承认不同化合物之间基因毒性作用效力的差异的方式来评估测定结果。因此，亦可使用下述标准评估GLuc诱导若一种或多种测试化合物浓度产生大于该1. 5或1. 8阈值的发光诱导，则断定为阳性(+)基因毒性结果。当
化合物稀释无一产生高于该1. 5或1. 8阈值的相对GLuc诱导时，断定为阴性基因毒性结果 ㈠。发明人接着发现了可使用荧光细胞染色来替代光吸收测量。这是因为这两种方法事实上是估计相同事物的不同的方式。令人惊讶的是，使用细胞染色的方法改善了细胞数估计的灵敏度，并因此改善了对前基因毒素的检测。优选地，用于经调适的实验方案中的细胞染料为花青染料，更优选为三唑橙 (triazole orange, TO)，其为结合于DNA和RNA的花青染料。TO对DNA的结合极大地增强了其荧光强度，允许无需洗去背景未结合的TO而对其进行检测。优选地，在本发明的第四个方面的方法中，在暴露于测试化合物起46至50小时之后监测GLuc报道蛋白的表达；最优选在48小时之后。在本发明第四个方面的一些实施方案中，检测导致或加剧基因组损伤的试剂的存在的方法包括监测来自细胞的GLuc报道蛋白的表达的步骤。GLuc报道蛋白在发光反应中催化底物腔肠荧光素的氧化。发明人确定在一些反应条件中(特别是当顺序进行多个反应时)，腔肠荧光素可为不稳定的，使得向发光信号引入差异程度，其可影响测定的灵敏度和鲁棒性(robustness)。在进一步的调查中，发明人确定腔肠荧光素可由氧化剂如抗坏血酸(维生素C)的存在而稳定化。或者，腔肠荧光素可由三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)(优选在pH 7.4和终浓度IOOmM)的存在而稳定化。而且，腔肠荧光素可进一步由β-环糊精的存在而稳定化。因此本发明的优选方法是其中腔肠荧光素作为5mM储液在酸化甲醇中制备。制备发光缓冲液(400mM Tris-HCl ；5πιΜβ -环糊精；去离子水；用ION NaOH缓冲至pH 7. 4)。然后将该腔肠荧光素储液在发光缓冲液中稀释2000倍以得到2. 5 μ M腔肠荧光素溶液(通过 TRIS缓冲至pH 7.4)。其为注入溶液，将其添加至反应测定(导致腔肠荧光素进一步的4 倍稀释)。所有本文中所述的特征(包括任何所附权利要求、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤，可与任何上述方面以任意组合合并，但其中至少一些此类特征和/或步骤相互排斥的组合例外。现在进一步仅通过实例的方式描述本发明的实施方案，其中引用下述实施例和附图图 1 显示载体(A)pEP-GD532 ； (B)pHG45_HC 质粒；和(C)pCMV-GLuc-l 的限制图。图2 (A)显示载体pEP-GD532-GLuc的质粒图和(B)表达盒GD532_GLuc的概略图。
图3显示FLuc、GLuc和GFP报道蛋白活性的甲基亚硝基脲(MNU)诱导。图4显示来自终点时间过程实验的4种测试化合物对于具有GADD45 α -FLuc表达盒的细胞的实例数据。图5显示两种测试化合物对于具有⑶532-GLuc表达盒的实例数据；㈧非基因毒素；(B)基因毒素。图6显示来自利用GFP报道蛋白的使用高度荧光性测试化合物的测定的数据；(A) 用吖啶橙的GFP数据；⑶用吖啶橙的GLuc数据。图7显示来自在S9提取物存在下用GLuc报道蛋白的前基因毒素的测定的结果； (A)用细胞数校正三唑橙(TO) ； (B)当将TO细胞数整合入该测定时，来自用6-氨基草屈的 S9测定的数据。对于+S9提取物，阳性判定阈值为1.5，而对于-S9提取物的阳性判定阈值为1.8 ；两者均示于图上。图8显示来自使用384孔微滴定板对于基因毒素4_硝基喹啉氧化物(NQO) 的基于GLuc的基因毒性测定的数据；(A)使用实施例4内描述的荧光细胞染色(TO)方法测得的对于NQO的相对毒性曲线；⑶对于NQO的相对GLuc发光诱导。实施例1 克隆 pEP-GD532_GLuc为了在GADD45 α报道构建体中用GFP ORF交换Gaussia萤光素酶(GLuc) 0RF。实验方案使用PCR 从质粒 pCMV-GLuc-I(Nanolight)克隆 Gaussia 萤光素酶 0RF。 pCMV-GLuc-Ι质粒由NEB作为pCMV-GLuc商业出售。pCMV_GLuc_l的质粒图提供于图1。使用PWO高保真聚合酶(Roche)以最小化PCR诱导的突变的产生。正向和反向引物包含分别编码限制性内切核酸酶XhoI和NotI的识别位点的8个附加的(非互补的)核苷酸。PCR 反应的实验方案如下所示。引物
名称序列5’ -3，TmSEQ ID No.GLuc-Fgggtcgagagtcaaagttctgtttgccctg50. 4"C (69. 9"C )3GLuc-Rgcggccgcattagtcaccaccggcccc50. 2"C (77. 9"C )4 反应混合物
试剂VolumedNTP混合物(每种1 OmM)Ιμ pGLuc-F (ΙΟμΜ)3μ1pGLuc-R (ΙΟμΜ)3μ1
1权利要求
1.一种表达盒，包含编码Gaussia萤光素酶(GLuc)报道蛋白及其衍生物的DNA序列， 该DNA序列可操作地连接于人GADD45 α基因启动子和人GADD45 α基因调节元件，其配置为响应基因组损伤激活所述编码Gaussia萤光素酶(GLuc)报道蛋白的DNA序列的表达。
2.权利要求1的表达盒，其中所述调节元件包含GADD45ci基因的外显子1、外显子2、 外显子3和/或外显子4，或至少其部分区，或其任意组合。
3.权利要求2的表达盒，其中所述调节元件包含GADD45ci基因的外显子1的至少部分区，GADD45 α基因的外显子3的至少部分区和GADD45 α基因的外显子4的至少部分区。
4.前述任一项权利要求的表达盒，其中所述调节元件包含GADD45α基因的内含子1、 内含子2和/或内含子3，或至少其部分区，或其任意组合。
5.权利要求4的表达盒，其中所述调节元件包含GADD45α基因的内含子3的至少部分区。
6.权利要求5的表达盒，其中所述调节元件包含推定的ρ53结合基序。
7.权利要求5或权利要求6的表达盒，其中所述调节元件包含推定的AP-I基序。
8.前述任一项权利要求的表达盒，其中所述基因组损伤是DNA损伤。
9.前述任一项权利要求的表达盒，其中编码Gaussia萤光素酶(GLuc)的DNA序列示于 SEQ ID NO 1 的 2641-3198 位。
10.一种表达盒⑶532-GLuc，其基本上如图2所示并提供于SEQ ID NO :2。
11.一种重组载体，其包含权利要求1-10任一项所述的表达盒。
12.一种重组载体pEP-GD532-GLuc，基本上如图2所示并提供于SEQ ID NO :1。
13.一种细胞，包含权利要求1-10任一项所述的表达盒或权利要求11或12任一项所述的重组载体。
14.权利要求13的细胞，其中所述细胞为人细胞。
15.权利要求14的细胞，其中所述细胞为具有完整功能性p53的人细胞。
16.权利要求15的细胞，其中所述细胞为TK6人细胞系。
17.—种检测导致或加剧基因组损伤的试剂的存在的方法，包括对权利要求13-16任一项所述的细胞施以试剂；和监测来自该细胞的GLuc报道蛋白的表达。
18.权利要求17的方法，其中进一步筛选所述试剂以评估将活生物暴露于该试剂是否安全。
19.权利要求17或权利要求18的方法，其中所述试剂是候选的药物、食物添加剂或化妆品。
20.权利要求17-19任一项所述的方法，包括制备权利要求13-16的细胞的群体，或用权利要求11或12的重组载体转染的细胞，将所述细胞与所述试剂温育预定的时间，并直接从所述细胞的样品监测GLuc报道蛋白的表达。
21.权利要求20的方法，其中所述方法是在S9肝脏提取物存在下进行的。
22.权利要求21的方法，其中所述群体中的细胞的密度是使用细胞染料确定的。
23.权利要求22的方法，其中所述细胞染料是花青染料。
24.权利要求23的方法，其中所述花青染料是噻唑橙。
25.权利要求17-M任一项所述的方法，其中GLuc报道蛋白的表达是从暴露于测试化合物起46至50小时之后进行监测的。
全文摘要
本发明涉及检测推定导致或加剧DNA损伤的试剂的存在的方法，包括对细胞(其包含编码Gaussia萤光素酶(GLuc)报道蛋白的DNA序列，该DNA序列可操作地连接于人GADD45α基因启动子和人GADD45α基因调节元件，其配置为响应DNA损伤激活该DNA序列的表达)施以试剂；和监测来自该细胞的GLuc报道蛋白的表达。本发明还涉及可根据此种方法使用的表达盒、载体和细胞，以及可应用于本发明的方法的优选实施方案和测定中的修饰的介质。
文档编号G01N33/50GK102449168SQ201080023133
公开日2012年5月9日 申请日期2010年3月26日 优先权日2009年3月28日
发明者A.拉比诺维茨, M.塔特, R.瓦尔姆斯利 申请人:金特罗尼克斯有限公司