专利名称：基因毒性检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测引起或促进DNA损伤的介质(agent)的方法，并且涉及可以在这样的方法中应用的分子和转染的细胞系。特别地，本发明涉及在人类细胞培养物中用于检测DNA损伤的生物传感器。
DNA损伤由许多介质诱导，诸如紫外线，X射线，自由基，甲基化介质和其它诱变化合物。DNA损伤还可以由影响与DNA相互作用的酶和蛋白(包括聚合酶和拓扑异构酶)的介质或由前诱变剂(可以被代谢成为诱变物的介质)间接引起。这些介质的任何一种都可能引起包括生物体遗传密码的DNA的损伤并且在基因中引起突变。在动物中，这样的突变可以引起致癌作用，或可以损伤配子，在后代中引起先天性缺陷。这样的DNA损伤剂全部叫作基因毒素。
这些DNA损伤剂可以化学修饰包括DNA的核苷酸，并且还可以断裂连接核苷酸的磷酸二酯键或者破坏碱基之间的缔合(T-A或C-G)。为了抵抗这些DNA损伤剂的作用，细胞已经进化了许多机制。例如，大肠杆菌(E.coli)中的SOS应答是由DNA损伤诱发的非常有特征的细胞应答，其中一系列的蛋白被表达，包括修复受损伤的DNA的DNA修复酶。在哺乳动物中，核苷酸切除修复和碱基切除修复机制在DNA损伤修复中起重要作用，并且是用于移除大的DNA加合物和修饰的碱基的主要机制。
在许多情况下，确定是什么介质引起或促进DNA损伤是重要的。当评估将人暴露于这些介质是否安全时，检测引起DNA损伤的介质是特别重要的。例如，检测这些介质的方法可以用作用于筛选候选药物、食品添加剂或化妆品的化合物的基因毒性检测，以评估目的化合物是否诱导DNA损伤。备选地，检测DNA损伤剂的方法可以用于监测含有诱变化合物的污染物质对水源的污染。
用于确定介质毒性的许多方法，诸如埃姆斯试验，体外小核检测和小鼠淋巴瘤检测(MLA)，是已知的，但由于许多原因并不令人满意。例如，当通常需要在较短时限内获得基因毒性数据时，样品的温育却可能花费许多周。并且，许多已知的检测DNA损伤的方法(包括埃姆斯试验和相关方法)检测在错误修复的DNA形式(突变和重组)中作为末端的持久的DNA损伤或在片段化DNA形式中的未修复损伤。然而，大多数DNA损伤在这样的末端可以被检测到之前被修复，并且持久的DNA损伤只发生在条件如此严峻以致所述修复机制已经被饱和时。
WO 98/44149中公开了一种改进的基因毒性检测，其涉及包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaie)调控元件的重组DNA分子，所述调控元件应答DNA损伤而激活可有效地连接到编码发光报道蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)的DNA序列上的基因表达。这样的DNA分子可以用于转化酵母细胞，以用在检测引起或促进DNA损伤的介质的存在的基因毒性检测中。所述细胞可以受到介质的影响，并且所述发光报道蛋白(GFP)从细胞的表达表明所述介质引起DNA损伤。在WO 98/44149中所描述的基因毒性检测检测到能够防止要到达的终点的修复活性的诱导。因此，在WO 98/44149中所描述的方法可以用于检测DNA损伤剂的存在。
US 6,344,324公开了一种包括仓鼠GADD153上游启动子区域的调控元件的重组DNA分子，所述调控元件应答广泛范围的细胞胁迫条件而激活连接到编码GFP的DNA序列上的基因表达。这种报道系统在人头部和颈部鳞状细胞癌细胞系中实行。然而，与这种报道系统相关的问题是，在引起少于10％的细胞存活的检测介质浓度下，它需要至少4天的处理周期，接着通过流式细胞术进行荧光分析。另外，当在这种毒性水平下用介质检测时，任何基因诱导的生物相关性都是有争议的。并且，这种发展没有公开具体监测可能引起或促进DNA损伤的介质存在的方法，并且GADD153诱导的机制尚不清楚。因此，这一系统作为人类DNA损伤生物传感器应用非常有限。
因此，本发明实施方案的目的是阐述与现有技术相关的问题，并且提供用于在人类细胞培养物中检测DNA损伤的改进的生物传感器。
按照本发明的第一方面，提供了包括编码报道蛋白的DNA序列的表达盒，其DNA序列可有效地连接到人GADD45α基因启动子和人GADD45α基因调控元件上，其中安排所述人GADD45α基因启动子和人GADD45α基因调控元件使其应答于DNA损伤而激活所述DNA序列的表达。
术语“调控元件”，我们意指调控与其缔合的基因的转录的DNA序列，即，编码报道蛋白的DNA序列。
术语“有效地连接”，我们意指所述调控元件能够诱导所述报道蛋白的表达。
按照本发明的第二方面，提供了包括按照第一方面的表达盒的重组载体。
按照本发明的第三方面，提供了含有按照本发明第二方面的重组载体的细胞。
按照本发明的第四方面，提供了检测引起或促进DNA损伤的介质的存在的方法，其包括将按照本发明第三方面的细胞处于介质的影响下；并且监测所述报道蛋白从所述细胞的表达。
本发明第四方面的方法代表了一种新型、节约的基因毒性筛选，其可以用于为制药工业和其中需要检测显著数目的介质或化合物的其它应用提供预调控筛选检测。它提供比现有的体外和体内哺乳动物基因毒性检测更高的通量和更低的化合物消耗，并且对广谱诱变物质敏感。
本发明第四方面的方法适于评估一种介质是否引起DNA损伤。当评估将人暴露于DNA损伤介质是否安全时，对于检测引起DNA损伤的介质特别有效。例如，所述方法可以用作筛选已知的介质，诸如候选药物、制药业或工业化学药品、杀虫剂、杀真菌剂、食品或化妆品，是否诱导DNA损伤的基因毒性检测。备选地，本发明的方法可以用于监测含有DNA损伤介质的污染物对水源、沥出液和流出物的污染。
本发明第四方面的方法还可以用于评估介质是否促进DNA损伤。例如，某些介质可以通过抑制DNA修复(例如，通过妨碍修复蛋白的表达或功能)而不是直接造成DNA损伤而引起DNA损伤的累积。
令人惊讶地，除了人GADD45α基因启动子外，人GADD45α基因调控元件在按照本发明第一方面的表达盒中的应用，极大地增强所述表达盒对基因毒性胁迫以及因此在按照第三方面的细胞中的DNA损伤的应答。有利地，所述表达盒可以仅仅在24小时之内或之后简单地通过评估检测培养物中的蛋白而分析报道蛋白的表达。所述细胞可能受到所述检测介质或化合物的影响，并且报道蛋白在细胞中的表达表明所述检测介质是否引起DNA损伤。
本发明人已经发现，编码人GADD45α基因启动子和人GADD45α基因调控元件的DNA可以可有效地连接报道蛋白，以形成按照本发明第一方面的盒子，并且然后有利地用于按照本发明第四方面的基因毒性检测中。这样的盒子可以包括完整的GADD45α基因(包括编码序列)，条件是其可有效地连接到编码发光报道分子的DNA上。例如，盒子可以按照本发明第一方面制备，其包括完整的，或基本上全部的GADD45α基因(包括调控元件和启动子)，编码报道分子的DNA插入GADD45α启动子的3’(例如，在GADD45α编码序列之内或在所述编码序列的3’)。目的是安排使其应答于DNA损伤而激活所述DNA序列的表达。
优选地，人GADD45α基因启动子序列诱导RNA聚合酶结合DNA分子，并且开始转录编码报道蛋白的DNA。优选地，所述启动子序列包括人GADD45α基因启动子序列和5’非翻译区。所述启动子序列可以获得于pHG45-HC质粒，其图示在图3中。在图9中可以看到按照本发明的每一种表达盒的启动子序列，并且GADD45α基因启动子的核苷酸序列在序列表SEQ ID No.s 1，2，3，4和5中显示为碱基4-2254。应该理解，所述启动子可以包括碱基4-2254的每一个，或者备选地可以是其功能性衍生物和功能性片段。功能性衍生物和功能性片段可以容易地确定评估转录酶是否将结合推定的启动子区域，并且然后将引起标记蛋白的转录。备选地，当与GADD45α基因天然缔合时，这样的功能性衍生物和功能性片段可以通过在GADD45α启动子上进行诱变而检验，并且评估GADD45α表达是否可以发生。
在按照本发明的表达盒中的调控元件可以包括GADD45α基因启动子序列的下游序列。所述调控元件可以包括功能性DNA序列，诸如编码用于核糖体结合的翻译起始序列的那些DNA序列，或与在DNA损伤之后促进基因表达的转录因子结合的DNA序列。按照本发明的表达盒中的调控元件可以包括GADD45α基因的至少一个外显子。例如，所述调控元件可以包括GADD45α基因的外显子1，外显子2，外显子3，和/或外显子4，或者它的至少一个区域，或它的任何组合。因此，所述调控元件可以包括GADD45α基因的4个外显子的任何组合，或它的至少一个区域。
在一个优选实施方案中，所述调控元件包括GADD45α基因外显子1的至少一个区域，并且优选地GADD45α基因外显子3的至少一个区域，并且更加优选地，GADD45α基因外显子4的至少一个区域。特别优选地，所述调控元件包括GADD45α基因外显子1的全部，并且优选地GADD45α基因外显子3的至少一个区域，并且更加优选地，GADD45α基因外显子4的全部。
在按照本发明的每种表达盒中的优选调控元件图示在图9中。GADD45α基因外显子3的核苷酸序列在序列表SEQ ID No.s 2，3和4中显示为碱基3405-3642。GADD45α基因外显子3的优选区域的核苷酸序列在SEQ ID No.4中显示为碱基3503-3642。GADD45α基因外显子4的核苷酸序列在序列表SEQ ID No.s 2，3和4中显示为碱基4716-5391。
备选地，或额外地，所述调控元件可以包括非编码DNA序列，例如，GADD45α基因的至少一个内含子。例如，所述调控元件可以包括GADD45α基因的内含子1，内含子2，和/或内含子3，或它的至少一个区域，或它的任何组合。因此，所述调控元件可以包括GADD45α基因3个内含子的任何组合，或它的至少一个区域。
在优选实施方案中，按照本发明的表达盒中的所述调控元件包括GADD45α基因内含子3的至少一个区域。GADD45α内含子3在图9中图示，并且GADD45α基因内含子3的核苷酸序列在序列表SEQ IDNo.s 2，3和4中显示为碱基3643-4715。
在优选的实施方案中，按照本发明的表达盒包括GADD45α基因的启动子序列，以及在基因组GADD45α基因序列本身的内含子中发现的基因调控元件。尽管本发明人不希望受到任何假说的束缚，但是他们相信，GADD45α基因的内含子3含有推定的p53结合基序，并且正是这种p53基序令人吃惊地增强所述表达盒针对基因毒性胁迫的应答。所述推定的p53结合基序显示为SEQ ID No.s 2，3和4的核苷酸碱基3830-3849。
本发明人还相信GADD45α基因的内含子3可以含有推定的TRE基序，其可以编码AP-1结合位点。所述推定的TRE基序显示为SEQ ID No.s2，3和4的核苷酸碱基3879-3885。因此，尽管本发明人不希望受到任何假说的束缚，但是他们假定这种推定的AP-1结合位点还可以促成针对基因毒性介质的改善的应答。
优选地，所述表达盒包括GADD45α基因内含子3的至少p53结合基序和/或AP-1结合基序。
所述调控元件可以包括GADD45α基因的3’不翻译(UTR)区域，其核苷酸序列在SEQ ID No.s 2，3和4中显示为碱基4830-5391。尽管本发明人不希望受到任何假说的束缚，但是他们相信这种3’UTR可以参与mRNA盒的稳定，并且因此，当与其余的调控元件，诸如内含子3一起应用时，可以是令人吃惊地重要。
术语“报道蛋白”，我们意指一种蛋白，当其应答本发明DNA分子的调控元件表达时，通过适当的检测方法可以检测到。优选地，所述报道蛋白包括发光报道蛋白。编码发光报道蛋白的DNA序列可以编码任何发光蛋白，例如萤光素酶和绿色荧光蛋白。然而，优选所述DNA序列编码基本上荧光的蛋白。
编码发光报道蛋白的优选DNA序列编码绿色荧光蛋白(GFP)，及其发光衍生物。GFP来自水母Aequorea victoria，并且能够吸收蓝色光和再发射易于检测到的绿色光，并且因此适于作为报道蛋白。由于其测定简单而且无需介质并且所述蛋白是无毒性的，所以GFP可以有利地用作报道蛋白。
GFP衍生物包括编码能够发生光的GFP的多肽类似物和多肽片段的DNA序列。这些衍生物中有许多在与Aequorea victoria中内源发现的GFP不同的波长下，吸收并且再发射光。
例如，按照本发明第一方面优选的表达盒包括编码人增强的GFP(hEGFP)，也叫作GFP的GFPmut1变体的DNA序列。这由含有Phe-64变成Leu，和Ser-65变成Thr的双氨基酸取代的GFP野生型组成。HEGFP基因的编码序列还含有多于190个沉默碱基改变，其与相对于天然Aequorea victoria序列的人密码子应用优先选择相对应。这对于在人类DNA损伤报道系统中的应用特别有利。所述hEGFP序列可以获得于
图1中所显示的pEGFP-N1质粒(例如，获得于Clontech)。hEGFP序列可见于图9中按照本发明的每种表达盒中，并且hEGFP的核苷酸序列在序列表SEQ ID No.s 1，2，3，4和5中显示为碱基2550-3278。
GFP产生良好量子产量的荧光，并且与在荧光激活的细胞分选仪中应用的氩离子激光的输出量相匹配。按照本发明第四方面的方法，可以应用按照本发明第三方面的细胞，其含有编码hEGFP的DNA分子。
因此，按照本发明优选的表达盒包括可有效地连接到编码GFP、或其发光衍生物或类似物(例如YFP等)的DNA序列上的人GADD45α基因调控元件和人GADD45α基因启动子。最优选的表达盒包括可有效地连接到编码GFP或其发光衍生物的DNA序列上的人GADD45α基因启动子，和GADD45α基因的内含子3。
在第一个实施方案中，按照第一方面的表达盒优选地为5-31，(在图9中图示为GD531的盒)。表达盒5-31的核苷酸序列在序列表中显示为SEQ ID No.2。
在第二个实施方案中，按照第一方面的表达盒优选地为5-32，(在图9中图示为GD532的盒)。表达盒5-32的核苷酸序列在序列表中显示为SEQ ID No.3。
在第三个实施方案中，按照第一方面的表达盒优选地为5-33，(在图9中图示为GD533的盒)。表达盒5-33的核苷酸序列在序列表中显示为SEQ ID No.4。
例如，按照本发明第二方面的重组载体可以是质粒、黏端质粒和噬菌体。当复制所述表达盒时，这样的重组载体有很大用途。并且，对于用所述表达盒转染细胞，重组载体是非常有用的，并且还可以促进报道蛋白的表达。
重组载体可以这样设计，以便所述载体在细胞的细胞质中自主的复制，或者可以用于整合到基因组中。在这种情形中，重组载体中可能需要诱导DNA复制的元件。适当的元件在本领域内是公知的，并且例如，可以衍生于pCEP4(Invitrogen，3 Fountain Drive，Inchinnan Business Park，Paisley，PA49RF，UK)，pEGFP-N1(BD Biosciences Clontech UK，21 InBetween Towns Road，Cowley，Oxford，OX4 LY，United Kingdom)或pCI和pSI(Promega UK ltd，Delta house，chilworth Science Park，SouthamptonSO16 7NS，UK)。
这样的复制载体可以在转化子中引起多个拷贝的DNA分子，并且因此当需要报道蛋白的过量表达(并且因此增加发光)时特别有用。另外，优选地，所述载体能够在人、灵长类和/或犬类细胞中复制。优选地，所述载体包括复制起点，并且优选地，至少一种选择标记。所述选自标记可以赋予对抗生素，例如，潮霉素或新霉素的抗性。因此，适当的元件衍生于pCEP4质粒(Invitrogen，3 Fountain Drive，Inchinnan Business Park，Paisley，PA4 9RF，UK)，其在图2中图示。
在第一个实施方案中，按照第二方面的重组载体优选地为pEP-GD531，如在图5中所图示。
在第二个实施方案中，按照第二方面的重组载体优选地为pEP-GD532，如在图6中所图示。
在第三个实施方案中，按照第二方面的重组载体优选地为pEP-GD533，如在图7中所图示。
按照本发明的第二方面，所述重组载体结合在细胞内。优选地，所述细胞为真核的。这样的宿主细胞可以是哺乳动物源性细胞和细胞系。优选的哺乳动物细胞包括人、灵长类、鼠科或犬类细胞。所述宿主细胞可以是淋巴瘤细胞或细胞系，诸如小鼠淋巴瘤细胞。所述细胞可以是无限增殖的，例如，淋巴细胞。
优选的宿主细胞为人细胞系。优选地，所述宿主细胞是具有完全功能性p53的人细胞系，例如，ML-1(具有野生型p53的人骨髓白血病细胞系)，TK6(具有野生型p53的人类淋巴母细胞细胞系)。然而，也考虑了宿主细胞系WI-L2-NS和WTK1(两者为TK6的姊妹系并且具有突变的p53蛋白)。这些细胞系全部可以在欧洲细胞培养物收藏中心(EuropeanCollection of Cell Cultures，ECACC General Office，CAMR，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4OJG， United Kingdom)找到。
对于按照本发明方法的应用，本发明人已经发现TK6人细胞是特别优选的细胞系。尽管本发明人不希望受到任何假说的束缚，但是他们相信TK6细胞是最有效的，原因在于它们具有完全功能性的p53。
尽管并不排除不稳定转染的(瞬时的)细胞的应用，理想地，用于表达由所述DNA分子编码的蛋白的宿主细胞稳定地转染。
按照本发明第三方面的转染细胞可以通过在实施例中描述的下述方法形成。所述细胞理想地为人细胞系，例如TK6。按照本发明第四方面的方法，可以应用这样转染的细胞来评估介质是否诱导或促进DNA损伤。应答DNA损伤诱导GFP表达，并且应用已知的适当技术，可以容易地测定GFP发出的光。
按照本发明第三方面最优选的细胞是转化了载体pEP-GAD532的TK6细胞。本申请中这些细胞叫作GenTK-T01。
还考虑到按照本发明的表达盒可以整合到宿主细胞的基因组中。有经验的技术人员应该理解用于将所述盒子整合到所述基因组的适当的方法。例如，所述表达盒可以由反转录病毒载体携带，与包装细胞系组合时，所述反转录病毒载体可以产生不需辅助病毒的重组反转录病毒，然后所述反转录病毒可以被引入宿主细胞中。然后，所述盒子可以将其本身整合到基因组中。适当的无需辅助病毒的反转录载体系统包括具有BING反转录病毒包装细胞系的pBabePuro质粒[Kinsella和Nolan，1996.Episomal VectorsRapidly and Stably Produce High-Titer Recombinant Retroviruses.HumanGene Therapy.71405-1413.]。
对于检测在低浓度诱导DNA损伤的介质，本发明第四方面的方法特别有效。所述方法可以用于筛选化合物，诸如候选药物、食品添加剂或化妆品，以评估将生命有机体，特别是人暴露于这样的化合物是否安全。备选地，本发明第四部分的方法可以用来检测水源是否被DNA损伤介质或促进DNA损伤的介质污染。例如，所述方法可以用于监测工业流出液中可能在暴露于所述污染的人或其它生物体中导致增加的DNA损伤的污染物的存在。
本发明的方法优选地这样实行，即，通过生长转染了按照本发明第二方面的重组载体(诸如pEP-GD531，pEP-GD532，或pEP-GD533)的细胞，将所述细胞用推定引起DNA损伤的介质培养预先确定的时间，并且直接从所述细胞的样品监测发光报道蛋白的表达。
细胞优选地在低荧光生长培养基中生长。这可以消除在进行测定之前洗涤细胞的需要，并且因此进一步减少所述方法步骤的数目。例如，按照本发明第三方面优选的人细胞可以在低荧光培养基中生长。适宜的培养基可以是改良的RPMI 1640培养基，并且最优选地含有低浓度的，或者优选地，没有维生素B2或酚红。本发明人已经发现，在荧光标记物，诸如GFP的检测中，这样的培养基的应用令人惊讶地有效。当测量荧光时，这样的培养基的应用减少“信号与噪声比例”。因此，按照本发明的第四方面，提供了不含有，或含有降低水平(相对于标准细胞培养基)的维生素B2或酚红的培养基，以用于荧光检测。最优选地，所述培养基不含有维生素B2并且不含有酚红。
优选地，将所述培养基这样改进，以便其不含有维生素B2。由于应该理解，培养基中通常需要维生素B2，对于有经验的人员，这样改良的培养基的应用是与直觉相反的。这是因为大多数细胞需要维生素B2才能够生长和存活。本发明人认识到，可以将在含有维生素B2的常规生长培养基中生长的细胞从这样的培养基中移出；放入没有维生素B2的培养基中；并且对于实行可靠的荧光检测的目的将保持存活。当按照本发明第四方面的方法检测时(特别当所述报道蛋白是GFP或其衍生物时)，残留在常规培养基(含有维生素B2和/或酚红)中的细胞倾向于提供更不令人满意的荧光值。
优选地，当实行按照本发明第四方面的检测时，应用按照本发明第五方面的培养基。最优选地，当用GFP作为报道子进行基因毒性检测时，应用这样的培养基。
具有低自发荧光的优选培养基是改良的RPMI 1640培养基，其不含有维生素B2或酚红。最优选的培养基在实施例1的表1中公开。
其它可以改良成低自发荧光的培养基包括Dulbecco改良Eagle培养基(D-MEM)、F-10营养混合物(Ham)、F-12营养混合物(Ham)、和Fischer’s培养基(GIBCO，Invitrogen，Paisley，UK)。最适当的培养基可以用于可被用作重组报道载体的宿主的不同的细胞类型。
按照本发明方法的优选实施方案，TK6细胞可以用pEP-GD531，pEP-GD532，或pEP-GD533转染，并且在不含有维生素B2的RPMI培养基中生长。然后，将推定的DNA损伤介质(例如，食品添加剂或潜在的药物或包含在水样或流出物样品中的介质)添加到含有所述细胞的培养基中。然后允许所述细胞生长规定的时间周期，此后，将细胞样品移出，并且测定其荧光。
有经验的技术人员应该知道荧光检测和定量的适当方法，并且在实施例中描述了一种方法。在US 6,509,161中描述了一种荧光检测的优选方法。当所述发光报道蛋白为GFP或其衍生物时，这种方法特别有效。
按照本发明方法的优选实施方案，从转染了pEP-GD531，pEP-GD532，或pEP-GD533的TK6细胞，例如，从微量培养板的孔中，记录荧光和吸收读数。适当的微量培养板的实例为96孔、黑色、透明底部的微量培养板，由Matrix ScreenMates制备，目录号4929，Apogent Discoveries，USA，或Corning(BV，NetherlandsCat.No.3651)。应用适当的微量培养板读数仪，例如，Tecan Ultra-384(Tecan UK Ltd.)微量培养板读数仪激发485nm/发射535nm，具有额外的分色镜(反射320nm-500nm，透射520nm-800nm)，可以记录荧光和吸收测定。吸收可以通过适当的滤光片，例如，620nm滤光片，进行测量。
用于实施本发明第四部分的方法的最优选的流程在实施例1，3和4中描述。
从荧光和吸收测定中，对于按照本发明第三方面的细胞，“亮度值”和荧光诱发比例可以如在实例中所描述的那样获得。
在GADD45α-EGFP构建体中存在GFP的背景(“组成型的”)表达，因此细胞密度越高，培养物更加荧光性。为了校正随生长导致的荧光增长，将荧光数据(GFP)除以吸收数据(细胞密度)，以给出‘亮度单位’，即，每细胞平均荧光的测定。这不取决于培养物密度。因此，吸收的测定可以主要用于荧光信号的标准化，而不是DNA损伤介质毒性的测定。因此，应该考虑到，为了通过细胞生存能力和程序性细胞死亡确定毒性，二级检测可以与吸收测定联合应用。例如，应用Biovison生物发光细胞毒性检测法(Biovison Bioluminescence Cytotoxicity Assay，Biovison Incoperated，2455-D Old Middlefield Way，Mountain View，California 94043，USA)，或Vybrant程序性细胞死亡检测试剂盒(Molecular probes Inc.，29851 WillowCreek Road，Eugene，OR 97402，USA)。
有时候，化合物自发地表现出荧光，或者诱导细胞自发荧光。因此，当评估增强的GFP表达时，从报道细胞系的亮度值中减去对照细胞系的亮度值。这去除了数据的干扰。因此，优选地，按照本发明第四方面的方法应用含有对照载体的细胞，所述对照载体是基于按照本发明第二方面的报道载体。这样的对照载体可以对应于报道载体，但是具有引入发光报道基因中的无义突变。
优选地，所述重组对照载体可以是分别在图18和19中图示的pEP-GD500C或pEP-GD532C所描述的载体。
按照本发明第四方面的优选的方法将应用按照本发明第三方面的细胞(例如，GenTK-T01)和基于转化了载体pEP-GD532C的TK6细胞的对照细胞系(本文叫作GenTK-C01)。
应该理解，一些非基因毒性的化合物可以通过细胞代谢被化学改变。在哺乳动物中，这种流程通常叫作代谢激活(MA)。MA可以将某些(certina)非基因毒性化合物(例如，前诱变剂)转变成基因毒性化合物。最经常地，MA发生在肝脏中。由于这种原因，通常优选地，采用这样的基因毒性检测，即，在存在或不存在能够像在体内代谢化合物那样代谢化合物的肝脏提取物时，进行测试化合物的检测。实施例4举例说明按照本发明第四方面的优选的方法，其应用叫作S9的肝脏提取物(有经验的人员所知的)。包含这样的提取物允许测定法检测到只在通过肝脏后变成基因毒性的化合物。
本文所描述的所有特征(包括任何附属的权利要求，摘要和附图)，和/或因此公开的任何方法或流程的所有步骤，可以以任何组合与上述方面的任一个结合，但其中所述特征和/或步骤的至少一些互相排斥的组合除外。
现在，仅通过实例方式，参考下述实施例和图，将进一步描述本发明的实施方案，其中图1显示载体pEGFP-N1的限制性图谱；图2显示载体pCEP4的限制性图谱；图3显示载体pHG45-HC的限制性图谱；图4显示载体pEP-GD500的限制性图谱；图5显示载体pEP-GD531，按照本发明的一种优选的重组载体的限制性图谱；图6显示载体pEP-GD532，按照本发明的一种优选的重组载体的限制性图谱；图7显示载体pEP-GD533，按照本发明的一种优选的重组载体的限制性图谱；图8显示载体pEP-GD534的限制性图谱；图9显示按照本发明的报道表达盒的实施方案；图10显示MMS对GADD45α报道细胞系的诱导效果；图11显示通过MMS对GADD45α报道细胞系诱导的亮度效果；图12显示从在具有血清的RPMI 1640(A)或如实施例2中所讨论的具有血清的改良低自发荧光培养基(B)中培养的报道细胞系中直接测定的甲磺酸甲酯诱发的荧光；图13显示实施例2中在RPMI 1640或改良的低自发荧光培养基中的人类淋巴母细胞细胞系的生长；图14显示实施例3中48小时培养后在96孔平板检测中MMS对相对细胞密度的作用；图15显示实施例3中在96孔平板检测中MMs对荧光诱发比例的作用；图16显示实施例4中具有和不具有S9的环磷酰胺对GenTK-C01细胞的相对细胞密度的作用；图17显示实施例4中具有和不具有S9的环磷酰胺对GenTK-C01细胞的荧光诱发的作用；图18显示命名为pEP-GD500C的对照载体的限制性图谱；和图19显示命名为pEP-GD532C的对照载体的限制性图谱。
实施例1下述实施例概述在构建按照本发明第一和第二方面的一系列GADD45α-EGFP人细胞培养物DNA损伤生物传感器/报道子中应用的成分。另外，本实施例描述所述生物传感器(按照本发明第三方面的细胞)的构建，并且举例说明当在按照本发明第四方面的方法中应用时，它们怎样应答基因毒性介质，例如，甲磺酸甲酯(MMS)。
1.1系统组成(i)启动子—来自GADD45αGADD45α启动子的来源是来自Albert J.Fornace Jr.，M.D.(NationalCancer Institute，Building37，Room6144，National Institutes of Health，Bethesda，Maryland 20892，USA)的质粒pHG45-HC，其在图3中图示。
(ii)荧光蛋白-Clontech’s EGFP绿色荧光蛋白的来源是Clontech质粒pEGFP-N1(BD BiosciencesClontech UK，21 In Between Towns Road，Cowley，Oxford，OX4 LY，UnitedKingdom)，其在图1中图示。pEGFP-N1编码野生型GFP的红移变体，其已经被最优化成为哺乳动物细胞中更亮的荧光和更高的表达。(最大激发＝488nm；最大发射＝507nm。)质粒pEGFP-N1编码GFPmut1变体，其包含Phe-64到Leu和Ser-65到Thr的双氨基酸取代。EGFP基因的编码序列包含多于190个沉默碱基变化，其对应人类密码子应用的优先选择。
1.2生物传感器报道分子盒的构建应用在图2中图示的Invitrogen pCEP4质粒作为骨架，在一些步骤中进行构建一系列的重组载体，其中每一种都包含GADD45α-EGFP报道分子盒。质粒pCEP4是一种附加型哺乳动物表达载体，其应用巨细胞病毒(CMV)直接早期增强子/启动子用于在多克隆位点插入的重组基因的高水平转录。这一质粒携带埃巴病毒复制起点(oriP)和核抗原(由EBNA-1基因编码)，以允许在人类、灵长类和犬类细胞中的染色质外(extrachromosomal)复制。pCEP4还携带在转染细胞中用于稳定选择的潮霉素B抗性基因。
步骤1(将EGFP模块插入pCEP4)-EGFP模块(由人最优化绿色荧光蛋白和SV40多聚腺苷酸化信号组成)通过PCR从图1显示的Clontech质粒pEGFP-N1(BD Biosciences Clontech UK，21 In Between Towns Road，Cowley，Oxford，OX4 LY，United Kingdom)上扩增。EGFP基因两侧有BglII-Asc I(5’)和Pac I-XhoI(3’)位点。这被插入图2显示的由Bgl II-Xho I切割的pCEP4(Invitrogen)中。这一步骤还导致将CMV启动子从pCEP4去除。
步骤2(插入GADD45α启动子)—将GADD45α5’启动子从图3中图示的由Albert J.Fornace Jr.，M.D.(National Cancer Institute，Building37，Room6144，National Institutes of Health，Bethesda，Maryland 20892，USA)友好馈赠的质粒pHG45-HC PCR扩增，从-2253bp直到并且包含5’UTR(非翻译区)和起始密码子，两侧具有切割Bgl II(5’)和AscI I(3’)位点。这被插入步骤1获得的质粒中。由此获得的质粒命名为pEP-GD500，其在图4中显示。
步骤3(插入GADD45α基因序列)一各种GADD45α基因序列(基因的3’端)通过PCR与克隆位点一起扩增，并且克隆到步骤2获得的质粒(pEP-GD500)中，以给出4种其它报道子质粒。
这些质粒命名为(i)pEP-GD531(从+1034到+3149的3’序列)-如在图5中显示。这一质粒包括人GADD45α基因内含子3的全部，其包括p53结合基序；(ii)pEP-GD532(从+1147到+3149的3’序列)-如在图6中显示。这一质粒包括人GADD45α基因内含子3的全部，其包括p53结合基序；(iii)pEP-GD533(从+1248到+3149的3’序列)-如在图7中显示。这一质粒包括人GADD45α基因内含子3的全部，其包括p53结合基序；和(iv)pEP-GD534(从+3155到+3149的3’序列)-如在图8中显示。这一质粒不包括人GADD45α基因内含子3的全部，并且不包括p53结合基序。这一质粒包括GADD45α3’非翻译区。
用于步骤3的克隆位点pEP-GD531两侧有Not I(5’)和Xho I(3’)的PCR产物。克隆到Not I-XhoI切割的pEP-GD500中。
pEP-GD532两侧有EcoRV(5’)和Xho I(3’)的PCR产物。克隆到Hpa I-Xho I切割的pEP-GD500中。
pEP-GD533两侧有Pac I(5’)和Xho I(3’)的PCR产物。克隆到Pac I-XhoI切割的pEP-GD500中。
pEP-GD534两侧有Not I(5’)和Xho I(3’)的PCR产物。克隆到Not I-XhoI切割的pEP-GD500中。
步骤4(制备对照载体)—将报道子质粒用Asc I酶切，并且将5’突出端用克列诺酶填满。然后将修饰的DNA片段重新环化。这在EGFP基因中引入4bp的移码。由此获得的蛋白是无功能的。由此获得的对照质粒用字母C作后缀，并且在图18和19中图示。
质粒pEP-GD500，pEP-GD531，pEP-GD532，pEP-GD533和pEP-GD534中每种表达盒的DNA序列在序列表中分别显示为SEQ ID No.1，SEQ IDNo.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。
参考图9，显示的是分别排列在人GADD45α基因下的按照本发明的一系列报道分子盒。质粒pEP-GD531，pEP-GD532和pEP-GD533的GADD45α-EGFP报道基因融合体以如此构建以使GADD45α-EGFP融合体的全长等同于天然GADD45α基因，如在图9中所示。质粒pEP-GD531和pEP-GD532中，hEGFP的GADD45αDNA下游以及hEGFP本身被转录成为mRNA，并且经受剪接。pEP-GD533中，只有hEGFP基因被转录成mRNA。转录在GADD45α基因序列前的SV40多聚腺苷酸化信号处停止。这些质粒是按照本发明第一方面的。pEP-GD534盒更短一些，并且不包括GADD45α基因内含子3中的p53基序。
1.3细胞系选择和转染当考虑一种细胞系用作新的哺乳动物DNA损伤报道子系统的宿主时，重要的是要考虑所选择的细胞系以允许所述报道子的必要的应答的方式应答基因毒性损伤的能力。研究了P53对分子生物学和/或遗传毒性学中通常所用的两种细胞系的下游基因的地位和作用，并且本文描述了这一工作。这些细胞系为(i)TK6，人类淋巴母细胞细胞系(wt p53)；和TK6的姐妹株，(ii)WI-L2-NS(突变的p53蛋白)。
功能异常的p53蛋白可以导致增强的辐射抵抗性(即，增强的存活)和对辐射的诱变和诱裂作用增强的敏感性。尽管这些特征使得细胞系适合用于检测突变的末端，但是相同的特征意味着，在带有突变的p53状态的细胞系中，用于DNA损伤的替代的生物标记的诱导最好的情况下也是差的。为此，将TK6细胞系选作生物传感器(即，按照本发明第三方面的细胞)。据信，科学目的的其它数据可以从它的具有重组GADD45α-EGFP报道子载体的姐妹细胞系的应用中获得。
应用从Xia和Liber[Methods in Molecular biology，Vol.48Animal CellElectroporation and Electrofusion Protocols，1995.Edited by J.A.Nickoloff.Humana Press Inc.，Totowa，NJ，USA，Pages 151-160]改编的方法，将TK6细胞通过电穿孔转染载体，并且在2周后用潮霉素B选择携带所述报道子质粒的克隆。
转化了pEP-GAD532的TK6细胞在本文中叫作GenTK-T01。也制备了等价的对照细胞系，叫作GenTK-C01，其中故意将GFP报道基因置于阅读框外。因此，GFP不能从这种对照细胞系表达。
1.4测试培养基—改良的RPMI常规培养基可以用在本发明的方法中。然而，本发明人发现，在与EGFP激发(488nm最大)和发射(520nm最大)相关的波长处，许多传统的细胞培养基是自发荧光的。在本工作中，发现这种荧光的主要作用因素是维生素B2。因此，优选地，应用改良的低自发荧光的培养基。
可以制备许多这样的培养基，并且通过实例的方式，本发明研发了改良的低白发荧光RPMI 1640培养基(见表1)。这种培养基代表按照本发明第五方面应用的优选的培养基，其没有含有任何维生素B2，并且可以与生物传感器一起应用，以辅助生物传感器培养物的直接荧光读取。
表1低自发荧光哺乳动物细胞培养基成分的工作浓度。
1.5分析方法—微量培养板读取仪应用具有额外的分色镜(反射320nm-500nm，透射520nm-800nm)的Tecan Ultra-384(Tecan UK Ltd.)微量平板读取仪激发485nm/发射535nm，从微量培养板收集荧光和吸收数据。吸收通过620nm滤光片测定。将数据传输到微软Excel电子数据表中，并且转化成绘图数据。吸收数据给出增殖潜力减少的指示，并且将这些数据针对未处理的对照(＝100％生长)进行标准化处理。将荧光数据除以吸收数据，以给出‘亮度单位’，每个细胞平均GFP诱导的测定。将这些数据针对未处理的对照(＝1)进行标准化处理。这样，人们可以区别少量高度荧光性的细胞和大量微弱荧光性的细胞。为了校正诱导的细胞自发荧光和内在化合物荧光，从携带报道质粒的5种细胞系的亮度值中减去未转染的TK6细胞系的亮度值。这使得所述数据的可见评估更加可靠。用和不用这一校正核对所有的数据。从这种“亮度”数据计算荧光诱导的比例。
1.6生物传感器的MMS诱导作为报道子诱导的一个实例，将6种细胞系(TK6，没有质粒，和携带5种报道质粒之一)用不同浓度的MMS处理。本领域的那些技术人员已知MMS为一种基因毒性和细胞毒性介质，并且当应用本发明的方法时，可以用作阳性对照。
将在1ml改良的RPMI 1640培养基(见上述1.4)+10％马血清中的1×106个细胞用0μg/ml，6.25μg/ml，12.5μg/ml，和25μg/ml MMS培养过夜(37℃，5％CO2，100％湿度)。
培养后，将细胞在PBS中洗涤，重悬在300μl PBS中，并且然后分成两份注入96孔、黑色、透明底部的微量培养板的两个孔中。例如MatrixScreenMates，目录号4929，Apogent Discoveries，USA，或Corning(BV，Netherlands目录号3651)。记录荧光和吸收读数，并且计算荧光诱导比例。
这种测量重复3次，并且计算平均诱导和标准误差。所述结果在图10中图示。
参考图11，显示来自5种报道细胞系和未转染的母本细胞系TK6的未处理的亮度值。通过测定全部GFP荧光，计算每种细胞系-MMS组合的亮度值，并且然后，用620nm的吸收将所述亮度值标准化。因此，应该理解，当与未转染的母本细胞系TK6相比较时，质粒pEP-GD531，pEP-GD532，和pEP-GD533的每一种显示背景荧光的增加，并且当用MMS处理时，这些细胞系在人细胞系TK6的荧光中显示出基本程度的剂量依赖性。相反，尽管与TK6相比较，携带质粒pEP-GD500或pEP-GD534的细胞系显示出背景荧光的增加，通过MMS处理，这种荧光不会被进一步诱导。尽管本发明人不希望受到任何假说的束缚，他们相信，在质粒pEP-GD534中添加GADD45α3’不翻译区稳定由此获得的mRNA，与携带质粒pEP-GD500的细胞系相比较，这在携带这一质粒的细胞系中导致更高背景水平的荧光。
总之，本发明应用人DNA-损伤可诱导基因GADD45α的调控序列来控制EGFP在p53野生型人类淋巴母细胞细胞系TK6中的产生。人基因GADD45α在体外激发DNA切补修复，并且抑制细胞进入S期。按照本发明的报道子不仅应用GADD45α基因的上游启动子，还结合在其基因组基因序列中发现的基因调控元件。这包括在GADD45α基因第三个内含子中的推定的p53结合位点。令人惊讶地，这些序列的应用增强了所述生物传感器对基因毒性胁迫的应答。在仅仅24小时后，通过简单测定检测培养物的荧光，对于荧光诱导，可以分析这种报道子系统。可以将细胞受到介质的影响，并且细胞的发光报道蛋白(GFP)的表达指示所述介质引起DNA损伤。据信，这种生物传感器在短期预调控性药物筛选中具有应用。
实施例2为了可以开发优选的培养基以用于按照本发明第四方面的方法，实施进一步的实验来评估由常规培养基引起的自发荧光的作用。
除非指明相反，应用实施例1中所描述的构建体、细胞和方案。
除了维生素B2(见1.4)，本发明人确定，细胞培养基自发荧光的第二主要的贡献因素是酚红(通常用在培养基中的pH指示剂染料)。酚红的荧光还随着pH而变化。因此，优选地，将按照本发明应用的培养基配制成改良的低自发荧光的培养基，其中酚红或维生素B2，但是优选地酚红和维生素B2两者，被省略(见表1)。
参考图12，常规RPMI 1640培养基的应用减少荧光信号与噪声的比例，并且增加荧光测量的可变性。因此，对于直接的荧光读数，常规RPMI1640培养基的荧光不是最优的。相反，改良的低自发荧光细胞培养基的应用(对应正常的培养基，除了维生素B2和酚红被省略)有助于基因毒素诱导的荧光读数的直接测定。
参考图13，发现从培养基中省略维生素B2和酚红两者导致低自发荧光的培养基，其在96小时期间不会影响细胞生长和4种细胞分裂。因此，这样的培养基是按照本发明第五方面应用的优选培养基。
因此，应该理解，优选地，按照本发明第四方面的方法中应用的培养基可以包括常规培养基(例如，RPMI 1640)，但是优选地按照本发明第五方面改良，以便其不包含酚红或维生素B2。
实施例3
实施进一步的实验来研发对于在96孔平板中实行按照本发明第四方面的方法的最优选的方案。
除非指明相反，应用实施例1中所描述的构建体、细胞和方案。
按照本发明第四方面检测DNA损伤的优选的方法包括步骤(1)准备用于检测的微量培养板；(2)在微量培养板中实行检测；(3)收集并分析数据；和(4)做出关于DNA损伤和所述结果的判断。
下面给出实施DNA损伤的最优选的检测的步骤(1)-(4)的详情。
3.1微量培养板准备.
检测在96孔、黑色、透明底板的微量培养板中进行。例如MatrixScreenMates，目录号4929，Apogent Discoveries，USA，或Corning(BV，Netherlands目录号3651)。尽管发现独立的制造商的平板之内和之间的可变的背景吸收和荧光是可变的，并且在一些情形中是不可接受的，还是评估了许多备选的微量培养板。因此，应该理解，按照本发明所用的微量培养板优选地在平板和其批次之间具有一致的吸收和荧光。应该理解，当选择适当的微量培养板时，有经验的技术人员应该给予认真的考虑。
应用液体操作机器人，可以充满检测平板。例如来自Hamilton GB Ltd.，Birmingham的MicroLabS单一取样器(probe)，或Genesis 8-取样器机器人(Tecan UK Ltd.Theale.UK)。还可以应用多通道移液管快速并且有效地将微量培养板充满。
3.2检测可以遵循下述标准方案。在2％v/v水性DMSO中制备测试化学药品或含有推定引起DNA损伤的样品的2mM或1000μg/ml(最低的那一个)储液，并且将所述储液用于在96孔微量培养板上制备2份同样的稀释系列和对照(见下文)。为了获得这种结果，将150微升测试化学药品溶液注入2个微量培养板孔中。通过转移75微升到75微升2％DMSO中，混合，并且然后取出75微升到下一个孔中，将每种样品连续稀释。这产生每份75微升的9次连续稀释。在微量培养板上，测试化学药品/样品的最终顶点浓度为1mM或500μg/ml。
对照按如下添加a.测试化合物/含有仅在检测培养基中的介质的样品，以提供关于化合物吸收/荧光的信息b.仅用1％DMSO稀释的人细胞培养物，以给出最大增殖潜力的测定c.MMS作为基因毒性和细胞毒性对照‘high’＝50μg/ml，‘low’＝10μg/ml v/vd.仅有2％DMSO稀释液，以确定没有稀释物吸收/荧光e.仅有生长培养基，以确定无菌/没有污染将按照本发明的细胞系(例如GenTK-C01和GenTK-T01)的指数生长培养物在D-PBS中洗涤，并且以2×106个细胞/ml的密度悬浮在按照本发明的两倍浓度的低自发荧光的检测培养基中。将75微升细胞悬浮液添加到稀释的化学药品的每个孔中GenTK-C01到一个系列，和GenTK-T01到第二个，并且到适当的标准和对照中。将平板充满后，应用透气性膜(例如，Breath-easy，Diversified Biotech，USA)或塑料盖将它们密封，并且然后不摇动在37℃，5％CO2，95％湿度培养24小时。
3.3数据收集和处理.
紧接着24小时培养后，从所述微量培养板收集荧光和吸收数据。应用结合荧光和吸收函数的两种不同的微量培养板，并且获得参照数据。这些是Tecan Ultra-384(Tecan UK Ltd.)激发485nm/发射535nm，具有额外的分色镜(反射320nm-500nm，透射520nm-800nm)，和WallacVictor2(PerkinElmer Life and Analytical Sciences，Monza，Italy)激发485nm/发射535nm。在两种仪器中，通过620nm滤光片测量吸收。应用透气性膜(例如Breath-easy，Diversified Biotech，USA)或塑料盖将微量培养板重新密封，并且然后不摇动在37℃，5％CO2，95％湿度继续培养24小时。然后收集进一步的吸收和应用测定。将所述结果传输到微软Excel电子数据表中，并且转化成绘图数据(参见实施例2的图14和15中的典型数据)。数据处理是最小化的吸收数据给出增殖潜力降低的指示，并且将这些数据用未处理的对照(＝100％生长)标准化处理。将荧光数据除以吸收数据，以给出‘亮度单位’，每个细胞的平均GFP诱导测定。将这些数据用未处理的对照(＝1)标准化处理。这样，人们可以区别少量高度荧光性的细胞和大量微弱荧光性的细胞。为了校正诱导的细胞自发荧光和内在化合物荧光，从GenTK-T01细胞系的亮度值中减去GenTK-C01细胞系的亮度值。这使得所述数据的可见评估更加可靠。用和不用这一校正核对所有的数据，并且关于化合物是否分类为基因毒性的决定(见下文)不受影响。
3.4决定阈值.
对常规检测的阳性和阴性结果的清楚定义是有用的，并且，考虑到系统的最大噪声和其中关于基因毒性和作用机制存在清楚的结果的化学药品的数据，已经得到这样的定义。本质上，对于使用者审查所述数字和绘图数据并得出他们自己的结论是可能的。例如没有越过阈值的基因毒性数据的向上趋势仍旧可以区别两种化合物。决定阈值设定如下细胞毒性阈值设定在未处理的对照细胞达到的细胞密度的80％。这大于背景的标准偏差的3倍。如果1或2个化合物稀释液产生低于80％阈值的终细胞密度，那么推定为阳性细胞毒性结果(+)。当(i)3个或更多个化合物稀释液产生低于80％阈值的终细胞密度，或(ii)至少1种化合物稀释液产生低于60％阈值的终细胞密度时，推定为强阳性细胞毒性结果阳性(++)。当没有化合物稀释液产生低于80％阈值的终细胞密度时，推定为阴性结果(-)。最低有效浓度(LEC)是产生低于80％阈值的终细胞密度的最低的测试化合物浓度。
如果测试化合物是显著吸收性的，化合物吸收对照允许产生警告。如果化合物对照孔与仅充满培养基的孔的吸收比例＞2，那么存在干扰解释的风险。细胞毒性对照表明，所述细胞系表现正常。‘高’MMS标准应该将终细胞密度减少到80％阈值以下，并且应该是比‘低’标准更低的值。
基因毒性阈值设定在1.5的相对GFP诱导(即，50％增加)。这大于背景标准偏差的3倍。如果1或2个化合物稀释液产生大于1.5阈值的相对GFP诱导，那么推定为阳性基因毒性结果(+)。当(i)3个或更多个化合物稀释液产生大于1.5阈值的相对GFP诱导，或(ii)至少1种化合物稀释液产生大于1.8阈值的相对GFP诱导时，推定为强阳性基因毒性结果(++)。当没有化合物稀释液产生大于1.5阈值的相对GFP诱导时，推定为阴性基因毒性结果(-)。LEC是产生大于1.5阈值的相对GFP诱导的最低的测试化合物浓度。基因毒性对照证明所述细胞系正常应答DNA损伤。‘高’MMS标准必须产生＞2的荧光诱导，并且是比‘低’MMS标准更大的值。当所述毒性引起低于空白的30％的终细胞密度时，产生反常的亮度数据。不计算超出这一毒性阈值的基因毒性数据。再检测基因毒性检测为阴性的化合物，直到10mM或5000μg/ml，或者到溶解度或细胞毒性的极限。
当化合物是高度自发荧光性时，所述化合物荧光对照允许产生警告。如果化合物对照孔与充满培养基的孔的荧光比例＞5，那么存在干扰解释的风险。在这些情形中，可以应用荧光极化(polarisation)来区别GFP与荧光的其它来源(Knight等.，2000，2002)。Tecan仪器具有这一工具。有时候，尽管化合物自身不是荧光性的，但是化合物诱导细胞的自发荧光。在不存在来自只有化学药品的对照的荧光时，这显而易见地是来自对照(GenTK-C01)细胞系中增加的亮度。从GenTK-T01数据中常规减去GenTK-C01去除了对所述数据的干扰。
实施例4为了在具有和没有S9代谢激活作用的24孔平板中实施按照本发明第四方面的方法，实施进一步的研发工作，以开发其它最优选的方案。
S9是肝脏提取物(有经验的技术人员已知)，其可能区别基因毒性化合物和可以通过肝细胞新陈代谢被化学改变而在体内产生基因毒性化合物的非基因毒性化合物。
除非指明相反，应用实施例1中所描述的构建体、细胞和方案。
按照本发明第四方面检测DNA损伤的优选方法包括步骤(1)准备用于代谢激活检测的24孔板；(2)在24孔平板中实施检测并且在96孔平板中处理样品；(3)收集并分析数据；和(4)做出关于DNA损伤和所述结果的判断。
下面给出实施DNA损伤的最优选的检测的步骤(1)-(4)的详情。
4.1微量培养板准备.
检测在24孔平板(Corning BV，Schiphol-Rijk The Netherlands)和96孔、黑色、透明底部的微量培养板上实行。例如Matrix ScreenMates，目录号4929，Apogent Discoveries，USA，或Corning(BV，Netherlands目录号3651)。尽管独立的制造商的平板之内和之间的可变的背景吸收和荧光通常是不可接受的，还是评估的许多备选的微量培养板，这导致现在优选的选择。因此，应该理解，按照本发明所用的微量培养板优选地在平板和其批次之间具有一致的吸收和荧光。
应用液体操作机器人，可以充满检测平板。例如来自Hamilton GB Ltd.，Birmingham的MicroLabS单一探针，或Genesis 8-探针机器人(Tecan UKLtd.Theale.UK)。还可以应用多通道移液管快速并且有效地将微量培养板充满。
4.2检测可以遵循下述标准方案。对于24孔平板的每一排，将1ml下列细胞系培养基组合添加到每个孔中i)在RPMI 1640培养基中的1×106个细胞/ml GenTK-C01ii)在RPMI 1640培养基中的1×106个细胞/ml GenTK-T01iii)在RPMI 1640培养基+10％S9混合物中的1×106个细胞/mlGenTK-C01iv)在RPMI 1640培养基+10％S9混合物中的1×106个细胞/mlGenTK-T01RPMI 1640培养基优选为如本发明第五方面所定义的改良的培养基(例如表1中公开的培养基)。
在100％v/v水性DMSO中制备测试化学药品或含有推定引起DNA损伤的样品的100mg/ml储液，并且将所述储液用于在24孔平板上制备4份同样的稀释系列和‘对照’(见下文)。为了获得这种结果，将200微升测试化学药品溶液注入无菌的7ml玻璃小瓶或1.5ml小型管中。通过转移100微升到100微升100％DMSO中，混合，并且然后取出100微升到下一个孔中，将每种样品连续稀释。这产生每份100微升的3次连续稀释。对于24孔平板的每个孔，在24孔平板上，测试化学药品/样品的最终顶点浓度为1mg/ml。
对照按如下添加a.仅用10μl 100％DMSO稀释的人细胞培养物，以给出最大增殖潜力的测定b.在S9存在下，30μg/ml环磷酰胺作为阳性基因毒性和细胞毒性对照。
将所述平板充满后，应用透气性膜(例如Breath-easy，DiversifiedBiotech，USA)或塑料盖将它们密封，并且然后不摇动在37℃，5％CO2，95％湿度培养24小时。在24小时培养之后，将细胞转移到1.5ml微量管中，并且通过在2500rcf离心5分钟收集下来。将细胞在500μl预温的D-PBS(Sigma-Aldrich，Gillingham，UK)中洗涤，并且通过如前述的离心收集下来。将细胞重悬在150μl D-PBS中，并且将细胞悬浮液转移到视觉上透明底、黑色聚苯乙烯96孔微量培养板(MatrixTechnologies，Wilmslow，UK)的孔中。作为空白，将150μl D-PBS添加到2个孔中。
4.3数据收集和处理.
将细胞悬浮液转移到96孔平板中后，收集荧光和吸收数据。应用结合荧光和吸收函数的2中不同的微量培养板读数仪，并且获得参照数据。这些是Tecan Ultra-384(Tecan UK Ltd.)激发485nm/发射535nm，具有额外的分色镜(反射320nm-500nm，透射520nm-800nm)，和WallacVictor2(PerkinElmer Life and Analytical Sciences，Monza，Italy)激发485nm/发射535nm。在两种仪器中，通过620nm滤光片测量吸收。将所述结果传输到微软Excel电子数据表中，并且转化成绘图数据(参见实施例3的图16和17中的典型数据)。数据处理是最小化的吸收数据给出增殖潜力降低的指示，并且将这些数据用未处理的对照(＝100％生长)标准化处理。将荧光数据除以吸收数据，以给出‘亮度单位’，每个细胞的平均GFP诱导测定。将这些数据用未处理的对照(＝1)标准化处理。这样，人们可以区别少量高度荧光性的细胞和大量微弱荧光性的细胞。为了校正诱导的细胞自发荧光和内在化合物荧光，从GenTK-T01的亮度值中减去GenTK-C01细胞系的亮度值。这使得所述数据的可见评估更加可靠。用和不用这一校正核对所有的数据，并且关于化合物是否分类为基因毒性的决定(见下文)不受影响。
4.4决定阈值.
对常规检测的阳性和阴性结果的清楚定义是有效的，并且，考虑到系统的最大噪声和其中关于基因毒性和作用机制存在清楚的结果的化学药品的数据，已经得到这样的定义。本质上，对于使用者审查所述数字和绘图数据并得出他们自己的结论是可能的。例如没有越过阈值的基因毒性数据的向上趋势仍旧可以区别两种化合物。决定阈值设定如下细胞毒性阈值设定在未处理的对照细胞达到的细胞密度的80％。这大于背景的标准偏差的3倍。如果1或2个化合物稀释液产生低于80％阈值的终细胞密度，那么推定为阳性细胞毒性结果(+)。当(i)3个或更多个化合物稀释液产生低于80％阈值的终细胞密度，或(ii)至少1种化合物稀释液产生低于60％阈值的终细胞密度时，推定为强阳性细胞毒性结果阳性(++)。当没有化合物稀释液产生低于80％阈值的终细胞密度时，推定为阴性结果(-)。最低有效浓度(LEC)是产生低于80％阈值的终细胞密度的最低的测试化合物浓度。
如果测试化合物是显著吸收性的，化合物吸收对照允许产生警告。如果化合物对照孔与仅充满培养基的孔的吸收比例＞2，那么存在干扰解释的风险。细胞毒性对照表明，所述细胞系表现正常。
基因毒性阈值设定在1.3的相对GFP诱导(即，30％增加)。这大于背景标准偏差的3倍。如果1或2个化合物稀释液产生大于1.3阈值的相对GFP诱导，那么推定为阳性基因毒性结果(+)。当(i)3个或更多个化合物稀释液产生大于1.3阈值的相对GFP诱导，或(ii)至少1种化合物稀释液产生大于1.6阈值的相对GFP诱导时，推定为强阳性基因毒性结果(++)。当没有化合物稀释液产生大于1.3阈值的相对GFP诱导时，推定为阴性基因毒性结果(-)。LEC是产生大于1.3阈值的相对GFP诱导的最低的测试化合物浓度。基因毒性对照证明所述细胞系正常应答于DNA损伤。具有S9时，环磷酰胺标准必须产生＞1.3的荧光诱导，没有S9时，不能产生＞1.1的荧光诱导。当所述毒性引起低于空白的30％的终细胞密度时，产生反常的亮度数据。不计算超出这一毒性阈值的基因毒性数据。再检测基因毒性检测为阴性的化合物，直到10mM或5000μg/ml，或者到溶解度或细胞毒性的极限。
序列表<110>杰特尼克斯杰特尼克斯有限公司<120>基因毒性检测<130>PCB/AH/P89625PWO<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3516<212>DNA<213>智人<220>
<221>GADD45α启动子<222>(4)..(2254)<223>
<220>
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<220>
<221>EGFP基因<222>(2550)..(3278)<223>
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<221>SV40 polyA<222>(3432)..(3482)<223>
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1.一种表达盒，其包括编码报道蛋白的DNA序列，其中所述DNA序列可有效地连接到人GADD45α基因启动子和人GADD45α基因调控元件上，安排所述人GADD45α基因启动子和人GADD45α基因调控元件使其应答于DNA损伤而激活所述DNA序列的表达。
2.按照权利要求1的表达盒，其中所述调控元件包括GADD45α基因的外显子1，外显子2，外显子3，和/或外显子4，或其至少一个区域，或其任何组合。
3.按照权利要求2的表达盒，其中所述调控元件包括GADD45α基因外显子1的至少一个区域，GADD45α基因外显子3的至少一个区域，和GADD45α基因外显子4的至少一个区域。
4.按照前述权利要求任一项的表达盒，其中所述调控元件包括GADD45α基因的内含子1，内含子2，和/或内含子3，或其至少一个区域，或其任何组合。
5.按照权利要求4的表达盒，其中所述调控元件包括GADD45α基因内含子3的至少一个区域。
6.按照权利要求5的表达盒，其中所述调控元件包括推定的p53结合基序。
7.按照权利要求5或权利要求6的表达盒，其中所述调控元件包括推定的AP-1基序。
8.按照前述权利要求任一项的表达盒，其中所述DNA序列编码发光报道蛋白。
9.按照前述权利要求任一项的表达盒，其中所述DNA序列编码绿色荧光蛋白(GFP)，及其发光衍生物。
10.按照前述权利要求任一项的表达盒，其中所述DNA序列编码人增强的GFP(hEGFP)，其由含有Phe-64到Leu和Ser-65到Thr的双氨基酸取代的GFP野生型组成。
11.表达盒5-31，基本上如在图9中图示的那样。
12.表达盒5-32，基本上如在图9中图示的那样。
13.表达盒5-33，基本上如在图9中图示的那样。
14.一种重组载体，其包括按照权利要求1-13中任一项的表达盒。
15.按照权利要求14的重组载体，其中所述载体包括来自pCEP4质粒的DNA。
16.重组载体PEP-GD531，基本上如在图5中图示的那样。
17.重组载体PEP-GD532，基本上如在图6中图示的那样。
18.重组载体PEP-GD533，基本上如在图7中图示的那样。
19.一种含有按照权利要求15-18中任一项的重组载体的细胞。
20.按照权利要求19的细胞，其中所述细胞为人细胞。
21.按照权利要求20的细胞，其中所述细胞为具有完全功能性的p53的人细胞。
22.按照权利要求20的细胞，其中所述细胞为TK6人细胞系。
23.一种检测引起或促进DNA损伤的介质的存在的方法，其包括使按照权利要求19-22中任一项的细胞经受介质的影响；并且监测所述报道蛋白从所述细胞的表达。
24.按照权利要求23的方法，其中所述介质被进一步筛选，以评估将有生命的生物体暴露于所述介质是否安全。
25.按照权利要求23或权利要求24的方法，其中所述介质是候选药物、食品添加剂或化妆品。
26.按照权利要求23-25中任一项的方法，其中发光报道蛋白从所述细胞的表达被监测。
27.按照权利要求26的方法，其中所述发光报道蛋白是绿色荧光蛋白。
28.按照权利要求27的方法，其包括生长转染了按照权利要求14-18中任一项的重组载体的细胞，用所述介质培养所述细胞持续预先确定的时间，并且直接监测绿色荧光蛋白从所述细胞样品的表达。
29.按照权利要求23-28中任一项的方法，其中所述细胞在低荧光生长培养基中生长。
30.按照权利要求29的方法，其中所述低荧光生长培养基是不包含维生素B2的RPMI培养基。
31.按照权利要求29或30的方法，其中所述低荧光生长培养基是不包含酚红的RPMI培养基。
32.按照权利要求26-31中任一项的方法，其中荧光通过比较来自按照本发明第三方面的细胞的荧光和来自包括按照本发明第二方面的载体的对照细胞的荧光而确定，其中编码发光报道子的核酸被置于阅读框外。
33.不包含或包含相对于标准细胞培养基减少水平的维生素B2或酚红的细胞培养基在荧光检测中的应用。
34.按照权利要求33的应用，其中所述培养基是如权利要求30或31所定义的培养基。
35.按照权利要求33或34的应用，其中所述荧光检测是由权利要求23-32中任一项所定义的方法。
全文摘要
本发明涉及检测推定引起或促进DNA损伤的介质的存在的方法，其包括将细胞(含有编码可有效地连接到人GADD45α基因启动子和人GADD45α基因调控元件DNA序列，其中安排所述人GADD45α基因启动子和人GADD45α基因调控元件使其应答于DNA损伤而激活所述DNA序列的表达)处于介质的影响下；并且监测所述报道蛋白从所述细胞的表达。本发明还涉及可以按照这样的方法应用的表达盒、载体和细胞，并且还涉及可以在荧光检测和本发明方法的优选实施方案中应用的改良的培养基。
文档编号C12Q1/68GK1961080SQ200580016172
公开日2007年5月9日 申请日期2005年5月18日 优先权日2004年5月20日
发明者P·哈斯特威尔, R·沃姆斯利 申请人:杰特尼克斯有限公司