表征细胞重编程的方法及其应用的制作方法

专利名称：表征细胞重编程的方法及其应用的制作方法
表征细胞重编程的方法及其应用I.相关申请的交叉參考本申请要求2009年7月31日提交的，名为“表征细胞重编程的方法及其应用 (Methods to Characterize Cell Reprogramming and Uses Thereof)，，的美国临时申请序列号61/230398和2009年8月3日提交的，名为“表征细胞重编程的方法及其应用 (Methods to Characterize Cell Reprogramming and Uses Thereof)，，的美国临时申甫序列号61/230，801的权益。II.背景公开的方法基于无标记生物传感器細胞途径和功能概况分析方法来全面表征干細胞和細胞重编程。对于研究和医学治疗，例如通过骨髄移植治疗白血病和相关的骨/血液癌症，干細胞因其多功能性而具有吸引力。虽然最近10年在干細胞和細胞重编程中取得许多进展，但仍难以有效而可靠地表征干细胞和细胞重编程，特别是在诱导型全能干細胞(iPS細胞)的产生中，干細胞分化期间(状态和途径(即，谱系))以及在重编程細胞和其相应的人細胞之间进行比较有困难。本文公开了利用生物传感器表征细胞和iPS以及将它们彼此比较的方法。在ー些实例中，所述生物传感器可以是无标记的。可将iPS細胞的质量和性质与胚胎干細胞(ES) 比较。可采用所公开的方法表征干細胞和iPS分化的途径和阶段。还可利用不同类型的胚胎和重编程干细胞以及衍生自干細胞的細胞，将生物传感器用于药物筛选。基于无标记细胞的试验通常利用生物传感器监测活細胞中配体诱导的应答。生物传感器通常利用转换器，例如光学、电学、量热、声学、磁力等转换器将与生物传感器接触的細胞中的分子识别事件或配体诱导改变转换成可定量的信号。III.概述本文公开的方法基于无标记生物传感器細胞途径和功能概况分析方法来全面表征干细胞和细胞重编程。本文还公开了筛选介导和控制細胞命运，特別是增强衍生自干細胞(Es、成人干细胞和iPS細胞)的神经元細胞功能的小分子的方法。本文提供的方法采用无标记共振波导光栅生物传感器細胞试验来表征干細胞和通过胚胎和诱导型全能干細胞重编程衍生的细胞以及測定干細胞分化途径和阶段。本文还提供測定原代細胞及其通过胚胎和诱导型全能干細胞重编程衍生的相应細胞之间差异的方法。本文还提供表征通过胚胎和诱导型全能干細胞重编程衍生的細胞体系和利用这些细胞体系筛选药物的方法。本文还提供筛选能介导干細胞和诱导型全能干細胞分化和控制细胞命运的小分子的方法。IV.附图简述


图1显示无标记生物传感器細胞试验以表征细胞重编程的流程图。图2显示无标记生物传感器细胞试验筛选介导细胞重编程和控制细胞命运的小分子的流程图。图3显示无标记生物传感器細胞试验表征通过干細胞重编程衍生的細胞及其相应细胞(例如，原代細胞或細胞系)的流程图。图4显示ReNcell VM人神经祖細胞系(ReN細胞)分化成多巴胺能神经元的原位分化方案的流程图。图5显示层粘连蛋白包被的Epic 生物传感器微板上，分化过程中的ReN細胞的光学显微镜才目位对比图像(light microscopic phase contrast image)。图6显示神经元祖干細胞重编程形成的神经元細胞体系的荧光图像。ReN細胞分化成多巴胺能神经元，并用4种不同标志物染色(A) β III-微管蛋白(神经元的标志物)， (B) GFAP (星形細胞的标志物)，(C)Ol (少突胶质细胞的标志物)，(D)酪氨酸羟化酶(多巴胺能神经元的标志物)，Φ) β III-微管蛋白(神经元的标志物)和(F)酪氨酸羟化酶和 bill-微管蛋白染色之间的重叠。利用相应的抗体进行染色。图7显示利用神经元細胞体系的无标记RWG生物传感器进行多巴胺受体概况分折，所述细胞体系通过人神经元祖細胞重编程产生。(A) 16微摩尔的D2激动剂PD12897的 DMR信号；(B) 16微摩尔的Dl激动剂A68930的DMR信号；(C) 128微摩尔的非选择性多巴胺受体激动剂多巴胺的DMR信号；和⑶多巴胺的剂量应答。(A-C)中还包括阴性对照的DMR 信号(即，仅加入试验缓冲液后細胞体系的应答)。图8显示表征人干細胞(例如，ReNcell VM人神经祖細胞系)的重编程阶段和谱系的生物传感器多检测点細胞概况分析方法的代表性例子。(A)ReNcell VM人神经祖細胞附着于两个不同表面层粘连蛋白包被的和组织培养处理的生物传感器表面；(B-D) 3个不同时间点的1 微摩尔多巴胺的DMR信号(B)細胞附着于层粘连蛋白包被生物传感器表面后3小时；(C)未分化条件下，层粘连蛋白包被表面上培养4天后；和(D)分化条件下培养10天后。(B-D)中还包括相应条件下阴性对照的DMR信号(即，仅加入试验缓冲液后细胞体系的应答)。图9显示表征人干細胞(例如，ReNcell VM人神经祖細胞系)的重编程阶段和谱系的生物传感器細胞概况分析方法的代表性例子。(A-L)与未分化的ReN細胞相比，用一組标志物物刺激后衍生自ReNcell VM人神经祖細胞系的分化的和成熟的神经元細胞体系的 DMR 信号(A)乙酰胆碱(10 μ Μ) ； (B)腺苷(10 μ Μ) ； (C)ATP (10 μ Μ) ； (D)精胺(10 μ Μ) ； (E) 强啡肽(dynorphin)A(lO μ Μ) ； (F)内皮肽 1 (10 μ Μ) ； (G)神经肽Β-23 (ΝΡΒ-23，10 μ Μ) ； (H) 食欲素(orexin)A(lOyM) ； (I) SFLLR-酰胺(10 μ Μ) ； (J) UDP (10 μ Μ) ； (K)神经肽(10 μ Μ) 和(L)血管活性肠肽(10 μ Μ)。未分化和分化ReN細胞之间各配体的DMR信号差异可用作 ReN细胞谱系分化成多巴胺能神经元的读出值。图10显示表征人干細胞(例如，ReNcell VM人神经祖細胞系)的重编程阶段和谱系的生物传感器細胞概况分析方法的代表性例子。(A-F)与未分化的ReN細胞相比，用一组标志物物刺激后衍生自ReNcell VM人神经祖細胞系的分化的和成熟的神经元細胞体系的 DMR 信号(A) ADP(IOyM) ； (B)多巴胺(1 μ Μ) ； (C) GABA (10 μ Μ) ； (D)阿皮林(Apelin) (10 μ Μ) ； (E) α-黑素細胞-刺激激素(10 μ Μ)；和(F)血小板生长因子(10μΜ)ο未分化和分化ReN細胞之间各配体的DMR信号差异可用作ReN细胞谱系分化成多巴胺能神经元的
读出值。图11显示表征人干細胞(例如，ReNcell VM人神经祖細胞系)的重编程阶段和谱系的生物传感器細胞概况分析方法的代表性例子。(A-H)与未分化的ReN細胞相比，用一组标志物物刺激后衍生自ReNcell VM人神经祖細胞系的分化的和成熟的神经元細胞体系的DMR信号㈧血管紧张素II (10 μ M) ； (B)高血糖素样肽(USyM) ； (C)溶血磷脂酸 (10 μ Μ) ； (D)神经牵张素(neurotein) (10 μ Μ) ； (E)P 物质(10 μ Μ) ； (F)酪胺(10 μ Μ) ； (G) UTP (10 μ Μ)；和(H)硬骨鱼紧张肽(urotensin) (10μΜ)ο未分化和分化ReN细胞之间各配体的DMR信号差异可用作ReN细胞谱系分化成多巴胺能神经元的读出值。图12显示表征人干細胞(例如，ReNcell VM人神经祖細胞系)的重编程阶段和谱系的生物传感器細胞概况分析方法的代表性例子。(A-F)与未分化的ReN細胞相比，用一组标志物物刺激后衍生自ReNcell VM人神经祖細胞系的分化的和成熟的神经元細胞体系的 DMR 信号(A) 8-CPT-2-Me-cAMP (10 μ Μ) ； (B)毛喉素(10 μ Μ) ； (C) MAS-7 (10 μ Μ)； Φ)740Υ-Ρ(10μΜ) ； (E) L783281(10yM)；禾ロ (F)PMA(IOyM) 未分化和分化 ReN 细胞之间各配体的DMR信号差异可用作ReN细胞谱系分化成多巴胺能神经元的读出值。V.详述下面參考附图(若有的话)详细描述本发明的各种实施方式。述及各种实施方式不限制本发明的范围，本发明范围仅受所附权利要求书的范围的限制。此外，本说明书中列出的任何实施例并非限制性的，而仅是列出要求保护的本发明的许多可能实施方式中的一些。定义1. A除非上下文中另有明确说明，在说明书和权利要求书中所用的単数形式“一个”、 “ー种”和“该”等术语包括复数形式。因此，例如述及“ー种HiC(蛋白激酶C)激活剂”包括两种或更多此类激活剂的混合物，等等。2.縮写可采用本领域普通技术人员熟知的縮写(例如，“h”或“hr”表示小吋、“g”或“gm” 表示克、“mL”表示毫升、“ rt”表示室温、“ nm”表示纳米以及“Μ”表示摩尔等縮写)。3.约对本发明实施方式的描述中利用“约”来修饰，例如，組合物中成分的量、浓度、体积、エ艺温度、エ艺时间、产率、流速、压カ等数值，及其范围，“约”指数值量中可能发生的改变，例如，用于制备化合物、組合物、浓缩物或使用制剂所用的常规测量和操作过程所致；这些过程中的偶然性误差所致；用来实施所述方法的起始材料或成分的生产、来源或纯度的差异所致；和类似因素。术语“约”还包括由于具有特定初始浓度或混合物的組合物或制剂的陈化而改变的量，以及由于混合或加工具有特定初始浓度或混合物的組合物或制剂而改变的量。无论是否受术语“约”修饰，所附权利要求书均包括这些量的等同形式。4. “整个细胞组和针对标志物组”短语“整个细胞组和针对标志物组”是指检测某分子作用于ー组細胞中各細胞的一级概况以及该分子调节标志物组的调节概况的系统过程。对于标志物/細胞配对，所述过程首先从检测分子独立作用各类细胞的ー级概况开始，然后检测同一細胞内有该分子存在下某标志物的ニ级概況。术语“针对”专门用于表示分子调节标志物诱导的生物传感器应答的能力。5. “另ー时期，，“另ー时期”或“延长的时期”等术语是在一个时期后或一次处理后连续发生的时期。所述时期可以有很大不同，从10分钟到1小吋、2小吋、4小吋、8小吋、24小吋、2天、5 天、10天、20天或30天。6.抗多巴胺抗体“杭-多巴胺抗体”或任何其它“所抗物质”的抗体(本文专门公开了对各組合物和制品的抗体)指结合相关“所抗物质”的抗体。因此，例如杭-多巴胺抗体是结合多巴胺的抗体。公开的抗体是任何动物，例如小鼠、大鼠和灵长类，如人的单克隆、多克隆以及人源化、嵌合和工程改造抗体。7.试验试验等术语指測定某物质，如分子或細胞的特征的分析，例如受ー种或多种外源刺激如配体或标志物刺激后，細胞的光学或生物阻抗应答的存在、缺乏、量、程度、动力学、 动态学或类型。细胞对刺激的应答产生生物传感器信号可以是试验。8.测定应答“测定应答”等术语表示采用某种方式表征应答。例如，如果某分子与細胞接触，可以利用生物传感器測定接触该分子后该细胞的应答。9.附着“附着”、“粘附”、“固定化”等术语通常指，例如，表面修饰物质、相容剂 (compatibilizer)、細胞、候选配体分子和本发明的类似实体通过，例如物理吸附、化学结合等过程或其组合而固定或固着在某表面上。具体而言，“細胞附着”、“細胞粘附”等术语指細胞与表面的相互作用或结合，例如通过培养、或与細胞锚定材料、相容剂(如纤连蛋白、 胶原、层粘连蛋白、明胶、聚赖氨酸等)、或两者相互作用。“贴壁細胞”、“固定化細胞”等术语指保持与基材外表面结合、固定于其上或有某种接触的細胞、細胞系或細胞体系，例如原核或真核細胞。此类細胞在培养后能承受或经受清洗和培养基交換过程而保持附着，该过程是很多細胞试验的先决条件。10.生物传感器生物传感器等术语指用于检测分析物的装置，其組合了生物组件和理化检测器组件。生物传感器通常由三部分組成生物组件或元件(例如组织、微生物、病原体、細胞、或其組合)、检测器元件(以理化方式，如光学、压电、电化学、热学或磁力工作)和与两种组件关联的转换器。生物组件或元件可以是，例如，活细胞、病原体或其組合。在各实施方式中，光学生物传感器可包括将活細胞、病原体、或其組合中的分子识别或分子刺激事件转化成可量化信号的光转换器。11.生物传感器指数“生物传感器指数”等术语是由生物传感器数据的集合构成的指数。生物传感器指数可以是生物传感器概況，例如一级概况、或ニ级概况的集合。所述指数可包含任何类型的数据。例如，概况指数可以只包括N-DMR数据点，它可以是P-DMR数据点、或二者，或者它可以是阻抗数据点。它可以是与概况曲线相关的所有数据点。12.生物传感器概况“生物传感器概況”等术语指用某分子刺激后，利用生物传感器获得的活性概況。13.生物传感器应答“生物传感器应答”、“生物传感器输出信号”、“生物传感器信号”等术语指具有细胞的传感器系统对细胞应答的任何反应。生物传感器将细胞应答转换成可量化的传感器应答。生物传感器应答是由光学生物传感器，例如包含光子晶体生物传感器的RWG或sra测得的刺激后光学应答，或是由电学生物传感器测得的刺激后細胞的生物阻抗应答，或是由声学生物传感器測定的刺激后細胞的声学应答。由于生物传感器应答与刺激后的细胞应答直接相关，在本发明的各实施方式中，生物传感器应答和细胞应答可互換使用。14.生物传感器信号“生物传感器信号”等术语指刺激后由細胞应答产生，由生物传感器测得的細胞信号。15.生物传感器表面生物传感器表面等词语是其上可具有培养的細胞的生物传感器的任何表面。生物传感器表面可经组织培养处理，或者胞外基质物质(例如，纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原等) 包被或经合成材料(例如，聚赖氨酸)包被。16.细胞細胞等术语指外部以半透膜为界的、小的、通常为微观量的原生质，任选包括ー个或多个核和各种其它細胞器，能独自或与其它类似物质相互作用执行生命的所有基本功能，并形成能独立起作用的活性物质的最小结构单元，包括合成细胞构建物、細胞模型体系和类似的人工細胞体系。細胞可包括不同的细胞类型，例如与特定疾病相关的細胞、特定来源的细胞类型、 与特定靶标相关的细胞类型、或与特定生理功能相关的细胞类型。细胞还可以是天然細胞、 工程改造細胞、转化細胞、永生化細胞、原代細胞、胚胎干細胞、成人干細胞、癌症干細胞或干细胞衍生的細胞。人体由约210种已知的不同細胞类型构成。考虑到細胞的制备(例如工程改造、 转化、永生化、或新鮮分离自人体)和获取細胞的来源(例如不同年齢或不同疾病阶段的人体等)，细胞类型几乎是无限的。17.细胞培养“细胞培养”指原核或者真核細胞在受控条件下生长的过程。“细胞培养”不单指培养衍生自多細胞真核生物的細胞，特別是动物細胞，也指培养复杂组织和器官。18.细胞命运“细胞命运”等术语指細胞定型的分化状态或重编程状态。19.細胞命运测定“细胞命运測定”等术语指细胞按照确定的細胞分化途径重编程。細胞不可逆地定型为特定状态。20.细胞组“细胞組”等术语指包括至少两类細胞的組。所述细胞可以是本文公开的任何类型或組合。21.细胞体系“细胞体系”等术语是具有多于ー类細胞的一組細胞。不同类型的細胞可以在生理学或病理生理学上彼此相关。例如，細胞体系可以由“多巴胺能細胞、星形細胞和少突胶质细胞构成的分化神经元”构成。22.细胞途径概况分析“细胞途径概况分析”等术语指获得細胞的至少ー种概況，其是细胞中特定信号传导途径的信息。该方法可利用本文所述任何工具或工具的組合以便产生无标记生物传感器概況，例如产生ー级概況。23.細胞概况分析“细胞概况分析”等术语指获得細胞的至少ー种概況，其是细胞的信息。该方法可利用本文所述任何工具或工具的組合以便产生无标记生物传感器概況，例如产生ニ级概况。24.检测点“检测点”等术语是生物传感器试验期间实施某行为，例如获得概况的任何点。“检测点n”等术语指η个检测点。“第一”、“第二”、“第三”检测点等指后续或不同的检测点。25.检测点一级概况“检测点概況”等术语，例如检测点一级概况指在检测点，例如时间点或条件点或其附近获得的，作用于细胞的分子概况。26.細胞附着概况“细胞附着概況”等术语指細胞附着于具有特定表面化学特性的生物传感器期间获得的概况。优选在将细胞置于生物传感器的0. 1、0. 5、0. 7、1、2、3、4、5、10、20分钟内获得
附着概況。27.候选重编程分子“候选重编程分子”是某种分子，其可以是调节、介导或调控细胞或干細胞重编程的分子。28.細胞重编程概况分析“细胞重编程概况分析”等术语指在一組条件下获得細胞上的生物传感器概況，所述条件是或可以是细胞重编程。29.细胞背景“细胞背景”等术语是具有特定状态的细胞类型。例如，不同类型的細胞具有不同的細胞背景(例如，细胞受体的差异表达或組成)。类型相同，但状态不同的細胞也具有不同的細胞背景。可通过培养(例如，細胞周期停滞或増殖或静息状态)或处理(例如，不同药理学试剂处理的細胞)实现同一类型細胞的不同状态。30.细胞过程细胞过程等术语指在細胞内或通过细胞发生的过程。细胞过程的例子包括但不限干増殖、凋亡、坏死、分化、細胞信号转导、极性改变、迁移或转化。31.细胞应答“细胞应答”等术语指细胞对刺激的任何反应。
32.细胞靶标“细胞靶标”等术语指能通过外部刺激改变活性的生物聚合物，例如蛋白质或核酸。最常见的細胞靶标是蛋白质，例如酶、激酶、离子通道和受体。33.组分公开了用于制备所公开组合物的组分和本文所述方法中使用的組合物本身。本文公开了这些和其它的材料，应当理解，当公开这些材料的組合、子集、相互作用、组等，但未明确公开具体述及这些分子各种不同的单独和共同組合以及排列組合吋，在本文中专门考虑和描述了其中的每ー种。因此，如果公开了ー类分子A、B和C以及公开了ー类分子D、E 和F和分子組合的实例A-D，则即使没有単独述及每ー种，每ー种单独且共同视为有意义的组合，A-E、A-F、B-D、B-E、B_F、C_D、C-E和C-F视作公开。同样，还公开这些组合的任意子集或組合。因此，例如，应认为已公开了亚组A-E、B-F和C-E。此概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制造和使用所公开组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可进行的各种附加步骤，应当理解可通过所公开方法的任一特定实施方式或实施方式組合来进行各附加步骤。34.化合物和组合物化合物和組合物在本领域具有标准意义。应当理解，在任何情况下，具体名称，例如分子、物质、标志物、細胞或试剂，都公开了包含这些名称、由其組成、和基本由其組成的組合物。因此，当使用具体名称标志物时，应当理解还公开了包含该标志物，由该标志物组成、或基本由该标志物組成的組合物。适当时，无论何处给出了具体名称，应当理解也公开了该名称的化合物。例如，如果公开了特定生物材料，例如PI3K激活剂，化合物形式的PI3K 激活剂也被公开。35.包含在本说明书的描述和权利要求中，词语“包含”和该词语的其它形式，如“含有”和 “包括”表示“包括但不限干”并且不打算排除例如其它添加剤、组分、整数或步骤。36.基本上由…组成在各实施方式中，“基本上由…組成”指例如表面組合物、在本发明的生物传感器、 制品、装置、或设备表面上制备或使用表面組合物、制剂或组合物的方法，还可包括权利要求中列出的组分或步骤，加上不实质性影响本发明組合物、制品、设备及其制备和使用方法的基本新型特性的其它组分或步骤，如所选的特定反应物、特定添加剂或成分、特定试剂、 特定細胞或細胞系、特定表面调节剂或表面条件、特定候选配体、或类似结构、材料或过程变量。可实质性影响本发明组分或步骤的基本特性或可赋予本发明不良特征的项目包括例如，细胞对生物传感器表面的亲和カ降低、刺激对细胞表面受体或胞内受体的亲和カ异常、 对候选配体或类似刺激的应答的不规则或相反細胞活性，等等特征。37.表征表征等术语指收集关于物质，如配体、分子、标志物或細胞的任何特性的信息，例如获得配体、分子、标志物或細胞的概況。38.接触接触等术语表示，如果至少两种事物，例如分子、細胞、标志物、至少ー种化合物或組合物、或至少两种組合物、或这些中的任一种与ー种或多种制品或机器之间可能有分子相互作用，则使之相互靠近从而能发生分子相互作用。例如，接触指将至少两种组合物、分子、制品或事物接触，即，它们接近以混合或碰触。例如，如果有组合物溶液A和培养的細胞 B并将组合物溶液A倾倒在培养的細胞B上，则组合物溶液A与細胞培养B接触。配体接触細胞会把配体带到细胞以确保細胞能接近配体。应当理解本文公开的任何事物可与任何其它事物接触。例如，可以使細胞接触标志物或分子、生物传感器等。39.对照术语对照或“对照水平”或“对照細胞”等术语定义为度量变化的标准，例如不对对照施以实验，而是測定整套參数，或者对照依据处理前或处理后的水平。它们或与测试平行进行，或者在之前或之后进行，或者它们可以是预先确定的标准。例如，对照可以指对象或客体或制剂在平行实验中处理的实验所得結果，除了省去受测过程或试剂或变量，该结果用作判断实验效果的比较标准。因此，可利用对照测定过程或试剂或变量等的相关效果。 例如，如果研究测试分子对细胞的作用，可以a)简单地记录该分子存在下的細胞特征，b) 进行a，然后还记录添加具有已知活性或无活性的对照分子或对照组合物(例如，试验缓冲溶液(载体))的作用，再比较测试分子与対照的作用。在某些情况中，一旦进行对照，所述对照可用作标准，不必再次进行对照实验，而在另一些情况中，要作比较时每次应平行进行对照实验。40.确定的途径“确定的途径”等术语是特定途径，例如Gq途径、(is途径、Gi途径、EGFR(表皮生长因子受体)途径、PII途径、EPAC (由CAMP直接激活的交換蛋白质)途径或H(C(蛋白激酶 C)途径。41.检测检测等术语指本发明的设备和方法发现或感应分子诱导细胞应答和区分对不同分子的感应应答的能力。42.决定因素“决定因素”等术语指调节或介导细胞命运的物质、化合物或分子。43.分化术语“分化”等术语指谱系约定(lineage commitment)的发育过程。“谱系”或“通路”指细胞发育的途径，其中前体或祖细胞经历渐进的生理改变，从而变为具有特征性功能的指定细胞类型(例如，神经细胞、肌肉細胞后内皮細胞)。分化分阶段进行，藉此细胞逐渐变得更加专门化直至它们完全成熟，这也称为“终末分化”。“终末分化的細胞”是定型为特定谱系并且达到分化的最终阶段的細胞(即，完全成熟的細胞)。44.直接作用(候选药物分子或任何其它分子、化合物或組合物)“直接作用”等术语指候选药物分子作用于细胞的結果。45. DMR 指数"DMR指数”等术语是由DMR数据集合构成的生物传感器指数。46. DMR 应答"DMR应答”等术语指采用光学生物传感器的生物传感器应答。DMR指动态物质再分布或动态细胞物质再分布。P-DMR是正DMR应答，N-DMR是负DMR应答，RP-DMR是恢复P-DMR应答。47. DMR 信号“DMR信号”等术语指光学生物传感器测得，由刺激后的細胞应答产生的細胞信号。48.多巴胺能神经元保护剂“多巴胺能神经元保护剂”等术语指保护神经元免遭多巴胺毒性的任何物质，例如分子。本文公开了其实例。49.候选药物分子药物候选分子等术语是测试其用作药物或药效团的能力的测试分子。该分子可视为先导分子。50.早期培养物早期培养物等术语是培养期间的細胞相对状态，常与其細胞周期状态或复制时间相关。早期培养物是少于或等于细胞倍增时间的时期内的細胞培养物。51.功效功效等术语指在理想或最优条件下产生所需大小的作用的能力。这些条件区分了功效和效カ相关概念，后者涉及现实条件下的改变。功效是受体占用和在分子、細胞、组织或系统水平启动应答的能力之间的关系。52.胚胎干細胞和相关术语a)干细胞“干細胞”等术语指非终末分化的細胞，其能体内或离体増殖，例如基本上永生化， 还能分化成其它细胞类型。其可分化成在分离其的组织中存在的某些分化的、定型的、不成熟的、祖细胞或成熟细胞类型，或者极大差别的细胞类型，例如衍生自相同前体細胞，如造血細胞的红细胞和淋巴細胞，或者甚至分化成与获得干細胞的组织完全不同的组织中任何阶段的细胞类型。例如，血液干細胞可变成脑細胞或肝細胞，神经干细胞可变成血細胞，从而干细胞改变它们的潜能。b)全能干細胞和全能性全能干細胞等术语是这样ー种干細胞，其可通过至少10次倍増，在一些情况中明显更长，例如20、30、50或更多次倍増，在一些情况中，看来无限地分裂，其还能分化成所有 3种胚层，中胚层、内胚层和外胚层衍生細胞。所述全能干細胞的具体例子是胚胎干細胞、胚胎生殖細胞和诱导型全能干細胞。在明显情况中，全能干細胞可在动物模型中形成畸胎瘤。“全能性”等术语指細胞具有分化成3种胚层中任一个的潜能，即，内胚层(内胃衬里、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨、血、泌尿生殖)或外胚层(表皮组织和神经系统)。全能細胞可产生任何胎儿或成人细胞类型。C)胚胎干細胞(ES細胞)术语“胚胎干細胞”(EQ等术语指从胚泡阶段胚胎分离和培养的全能細胞。ES细胞是全能的-分化成三种主要胚层的所有衍生物的能力外胚层、内胚层和中胚层。不给予分化刺激时(即，体外成长时)，細胞通过多次細胞分裂維持全能性。胚胎干細胞(ES细胞)是衍生自胚泡阶段胚胎的内细胞团的全能細胞。ES细胞是全能的。不给予分化刺激时 (即，体外成长时)，ES細胞通过多次細胞分裂維持全能性。它们的塑性和潜在的无限自我更新能力使得ES細胞成为发育和疾病建模以及开发細胞替代疗法的有力工具。这些細胞经广泛研究和表征。实际上，ES细胞惯常用于产生转基因动物。ES细胞显示体外分化成几种细胞类型，包括淋巴前体(Potocnik等·，1994，EMBO J.，第13卷(22) :527483)和神经細胞。利用许多阶段特异性标志物，例如阶段特异性胚胎标志物3和4 (SSEA-3和SSEA-4)、 高分子量糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-81及碱性磷酸酶(Andrews等.，1984，Hybridoma，第3 卷347 361 ；Kannagi 等·，1983，EMBO J.，第 2 卷2355 2361 ；Fox 等·，1984，Dev. Biol.， 第 103 卷263 266 ；Ozawa 等.，1985，Cell. Differ.，第 16 卷:169 173)表征 ES 細胞。d)诱导型全能干細胞(iPS細胞)诱导型全能干細胞(ire)是通过诱导某些基因的“強迫”表达，或直接递送重编程蛋白，或用小分子刺激而人工衍生自非全能干細胞(例如，成纤维細胞)，通常是成人体细胞的ー类全能干細胞。据信，iPS细胞是功能上相当的胚胎干細胞和其它全能干細胞。此外，iPS細胞具有的某些干細胞基因和蛋白质的基因表达、染色质甲基化模式、倍增时间、胚状体形成、畸胎瘤形成、存活嵌合体形成和潜力及分化能力相似。根据所用的方法，重编程成人細胞以获得ipse能引起极大风险，从而其在人体中的应用受限。例如，利用慢病毒载体能导致基因组中的切入性突变，或者引入原癌基因(例如，C-Myc)作为重编程因子之一能赋予所得细胞癌性。示范性iPS细胞描述于Takahashi等.，(2007)，Cell，131 =861-872, 或 Yu 等·，(2007)，Science, 318 :1917_1920。e)多能干細胞和多能性“多能干細胞和多能性”等术语指这样ー种細胞，其具有产生多个，但有限数量的谱系細胞的潜能。多能干細胞的例子是造血細胞-可发育成几类血細胞，但不能发育成，例如脑细胞或其它类型細胞的血液干細胞。多能性的潜能低于全能性。f)祖细胞术语“祖細胞”等术语指这样ー种細胞，其在受控和/或限定条件下会分化成给定表型的細胞。因此，成骨祖细胞是在为下述定型和分化建立的条件下培养时，定型成成骨细胞谱系并最终形成骨组织的祖細胞。祖细胞仅能分裂有限次数。g)自我更新“自我更新”等术语指細胞分裂产生ー个(不对称分裂)或两个(对称分裂)子細胞的过程，所述子細胞具有与母細胞不可区分的发育潜能。自我更新涉及増殖和未分化状态的维持。h)未分化状态“未分化状态”等术语指其中細胞没有指定的细胞类型的細胞状态。干細胞在分化成指定细胞类型之前处于未分化状态。i)单能性“单能性”等术语指細胞仅发育/分化成一类组织/细胞类型的能力。单能细胞仅可自我更新成同一类型的細胞。人的单能細胞的例子是皮肤細胞。j)成人干細胞成人干細胞也称为体干細胞，其是未分化的細胞，胚胎发育后在体内普遍可见，通过細胞分裂倍増来补充濒死细胞并使得受损组织再生。成人干細胞还能无限分裂或自我更新，产生其所源自的器官的所有细胞类型，从而可能自少数細胞再生整个器官。然而，与全能的ES細胞不同，成人干細胞是谱系局限性的(即，多能的)-产生几类不同细胞类型(例如，神经胶质細胞和神经元)的后代的能力。一般通过其组织来源指代大多数成人干細胞 (间充质干細胞、脂肪衍生的干細胞、内皮干細胞等)。然而，可能存在单能自我更新干细胞，即，局限于产生単一细胞类型的細胞。此外，全能成人干細胞是罕见的，数量通常很少但可在包括脐带血在内的许多组织中找到。成人干細胞治疗已成功地应用多年，通过骨髓移植来治疗白血病和相关的骨/血液癌症。成人干细胞还用于兽医学以便治疗马的肌腱和韧带损伤。k)重编程或細胞重编程“重编程或細胞重编程”等术语指改变或逆转细胞的分化状态的过程。細胞可以在重编程之前先部分或终末分化。重编程包括体細胞的分化状态完全逆转成全能状态。在示范性的一面，重编程是完全的，其中体細胞重编程为诱导型全能干細胞。然而，重编程可以是部分的，例如逆转为任何较低的分化状态。例如，终末分化的細胞逆转成较低分化状态的細胞，如多能細胞。1)干細胞分化和重编程干細胞分化在多个阶段发生，可导致多种途径(S卩，谱系)。为确保自我更新，干细胞经历两类細胞分裂。对称分裂产生赋予了干細胞特定的两个相同子細胞。另ー方面，不对称分裂仅产生ー个干細胞和ー个具有有限自我更新潜能的祖細胞。祖细胞可先经几轮细胞分裂，最终分化成成熟細胞。例如，许多原代人造血细胞产生接受不同細胞命运和/或显示不同增殖动力学特征的子細胞。对称和不对称分裂之间的分子差异可能在于子细胞之间細胞膜蛋白(例如⑶53、⑶62L/L-选择蛋白、⑶63/lamp-3和⑶71/转铁蛋白受体)的差
升隔1 °其它理论是干細胞因其特定小生境中的环境信号而维持未分化。当它们离开该小生境或不再接受那些信号，干细胞即分化。对果蝇卵巣的研究鉴定到信号dpp和阻止卵巣干細胞分化的粘附连接。还可利用分子，特别是小分子调节干細胞分化和細胞重编程。重编程涉及随着接合子发育成成人的細胞分化期间发生的核酸修饰(例如，甲基化)、染色质凝聚、表遗传改变、基因组印记等的至少ー些可遗传模式的改变，例如逆转。重编程不同于简单地維持已经是全能的細胞的已有未分化状态或是維持已经是多能細胞的細胞(例如，造血干細胞)的已有但低于完全的分化状态。重编程也不同于促进已经是全能或多能的細胞的自我更新或増殖，虽然本发明的組合物和方法也可用于此类目的。m)干細胞和細胞重编程的表征虽然过去数十年中干細胞和細胞重编程取得许多进展，但仍难于有效和可靠地表征干细胞和细胞重编程，特别是iPS細胞的产生、干細胞分化阶段和途径以及重编程細胞和它们各自的人細胞之间的差异。许多表征方法与利用特异性标志物的显微镜成像相关， 常检测单一細胞事件，包括細胞形态学特征、生长特性(例如，倍增时间、有丝分裂活性)、 特异性干细胞标志物(例如，细胞表面抗原性标志物SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、 TRA-2-49/6E和 Nanog)、特异性干细胞基因(例如，0ct_3/4、Sox2、Nanog、GDF3、REXl、FGF4、 ESG1、DPPA2、DPPA4和hTERT)、特异性蛋白质(例如，未分化干細胞的端粒酶和多巴胺能神经元谱系的β III-微管蛋白、酪氨酸羟化酶、AADC, DAT、ChAT, LMXlB和MAP2，和心肌细胞谱系的IM^MEFZaMYI^A.MYHC^和NKX2. 5)、或多-細胞器官形成(例如，形成畸胎瘤，其是含有衍生自3种胚层-内胚层、中胚层和外胚层-的组织的多谱系肿瘤，或者由有丝分裂活性和分化hESC的核心与所有三种胚层的完全分化細胞的外围构成的胚状体)。53.高汇合细胞汇合等术语指細胞在培养基上或其中的覆盖或増殖情況。由于多类細胞能经历细胞接触抑制，高汇合表示培养的细胞在组织培养表面或生物传感器表面达到高覆盖率 (> 90%)，对于細胞在培养基中的生长有明显限制。相反，低汇合(例如，40-60%的汇合) 表示对于培养基内/上的細胞生长无甚或没有限制，可假定它们处于生长阶段。54.更高和抑制及类似词语术语更高、提高、提升或升高等术语或这些术语的变形指提高到基础水平以上，例如与对照相比。术语低、更低、減少、降低或缩减等术语或这些术语的变形是指降低到基础水平以下，例如与对照相比。例如，在向細胞内添加分子例如激动剂或拮抗剂之前或未添加吋，基础水平是正常体内水平。抑制或抑制形式等术语指降低或阻遏。55. “有分子存在下““有分子存在下“等术语指将培养的細胞接触或暴露于该分子。所述接触或暴露可以在細胞接触刺激之前、或同时发生。56.指数指数等术语是数据的集合。例如，指数可以是具有一种或多种调节概况的列表、表格、文件、或目录。应当理解，可以由任何数据组合生成指数。例如，DMR概况可以有P-DMR、 N-DMR和RP-DMR。可以采用完整的概况数据、P-DMR数据、N-DMR数据、RP-DMR数据、或其中的任意点、或这些或其它数据的組合生成指数。指数是任何此类信息的集合。通常，比较指数吋，所述指数类似于数据，即，P-DMR到P-DMR数据。57. “重编程細胞状态的指示剂”“指示剂”等术语是进行指示的事物。具体地说，“重编程细胞状态的指示剂”表示某种事物，例如与未分化干細胞的相应重编程細胞的一組分子的生物传感器概况相比，该未分化干細胞的同一组分子的生物传感器概况的差异或相似性，这种差异或相似性可解读为重编程細胞具有与这些分子相互作用的相似或不同的功能受体，因此表明重编程細胞的状态。或者，还可利用一组已知调节剂的DMR指数作为细胞及其重编程細胞之间，或重编程細胞及其各自人天然細胞之间的相似性或差异的指示剂。58.已知的调节剂已知调节剂等术语是对至少ー种已知靶标具有已知亲和カ的调节剂。例如，已知调节剂可以是干細胞重编程抑制剂或细胞重编程增强性的，例如Wnt3蛋白。59.已知调节剂DMR指数“已知调节剂DMR指数”等术语是由已知调节剂的收集数据产生的调节剂DMR指数。例如，已知调节剂DMR指数可以由作用于细胞组(包括干細胞、其各自重编程細胞及其各自天然細胞)的已知调节剂的概况和已知调节剂针对标志物组的调节概况构成，每组标志物针对细胞组中的某种細胞。60.已知调节剂生物传感器指数“已知调节剂生物传感器指数”等术语是由已知调节剂的收集数据产生的调节剂生物传感器指数。例如，已知调节剂生物传感器指数可以由作用于细胞组的已知调节剂的概况和已知调节剂针对标志物组的调节概况构成，每组标志物针对细胞组中的某种細胞。61.已知分子已知分子等术语是药理学/生物学/生理学/病理生理学活性已知的分子，其精确作用模式可以已知或未知。62.文库文库等术语是集合。文库可以是本文公开的任何事物的集合。例如，它可以是指数的集合，指数文库；它可以是概况的集合，概况文库；或者它可以是DMR指数的集合，DMR 指数文库；它还可以是分子的集合，分子文库；它可以是細胞的集合，細胞文库；它可以是标志物的集合，标志物文库；文库可以是，例如随机或非随机的，确定或不确定的。例如，公开了已知调节剂的DMR指数文库或生物传感器指数文库。63.配体配体等术语是能与生物分子结合并形成复合物以便用于生物学目的的物质或组合物或分子。生物系统中含有配体及其靶分子之间实际的不可逆共价连接。配体与受体的结合改变了化学构象，即，受体蛋白质的三维形状。受体蛋白的构象状态决定受体的功能状态。结合的趋势或強度称为亲和力。配体包括底物、阻断剂、抑制剂、激活剂和神经递质。放射性配体是放射性同位素标记的配体，而荧光配体是荧光标记的配体；两者都可视为配体， 常用作受体生物学或生物化学研究中的示踪剂。配体和调节剂可互換使用。64.标志物标志物等术语是在生物传感器细胞试验中产生信号的配体。所述信号还必须是至少ー种特异性細胞信号传导途径和/或至少ー种特异性靶标介导的至少ー种特异性細胞过程的特征。所述信号可以是阳性、或阴性、或任何組合(例如振荡)。干细胞特异性标志物是干细胞的标志物，特別考虑了本文公开的任何特定干細胞的特异性标志物，例如全能干细胞标志物。类似地，重编程细胞特异性标志物是重编程細胞的特异性标志物。产生不同 DMR指数并反映细胞环境或背景差异的任何已知调节剂或分子也可用作表征细胞及其重编程細胞的标志物。65.标志物组“标志物組”等术语指包括至少两种标志物的組。标志物可以针对不同途径、同一途径、不同靶标或者甚至同ー靶标。66.标志物生物传感器指数“标志物生物传感器指数”等术语是由对标志物收集的数据产生的生物传感器指数。例如，标志物生物传感器指数可以由作用于细胞組，包括干細胞、其各自的重编程細胞及其各自的天然細胞的标志物概況，和该标志物针对标志物组的调节概况构成，各组标志物针对细胞组中的某种細胞。67.标志物DMR指数“标志物DMR指数”等术语是由对标志物收集的数据产生的生物传感器DMR指数。 例如，标志物DMR指数可以由作用于细胞組，包括干細胞、其各自的重编程細胞及其各自的天然細胞的标志物概況，和该标志物针对标志物组的调节概况构成，各组标志物针对細胞组中的某种細胞。68.材料
材料是成为物理客体的組成(化学的、生物化学的、生物的、或混合的)的有形部分。69.培养基培养基是可在其中培养细胞的任何培养基。生长培养基是微生物或細胞可在其中生长的物品。70.调节对于调节，或其形式，表示提高、降低、或維持通过细胞靶标介导的細胞活性。应当理解，在使用这些词语中的一个时，也公开了其可以是比对照提高了，例如，l^d^uo^、 20%、50%、100%、500%、或 1000%，或可以是比对照降低了，例如，1%、5%、10%、20%、 50%、或 100%。71.调节DMR信号“调节DMR信号”等术语指对分子刺激起反应而使得細胞的DMR信号或概况改变。72.调节概况“调节概況”等术语是有分子存在下标志物的ニ级概况和没有任何分子存在下标志物的一级概况之间的比较。例如，可以通过从ニ级概况中扣除一级概况或从ー级概况中扣除ニ级概况或将ニ级概况对ー级概况标准化进行比较。73.调节剂调节剂等术语是控制细胞靶标活性的分子，例如配体。它是结合細胞靶标，例如靶蛋白的信号调节分子。74.调节剂生物传感器指数“调节剂生物传感器指数”等术语是由对调节剂收集的数据，例如DMR数据产生的生物传感器指数。例如，调节剂生物传感器指数可由作用于细胞組，包括干細胞、其各自的重编程細胞及其各自的天然細胞的调节剂概况构成。75.调节剂DMR指数“调节剂DMR指数”等术语是由对调节剂收集的数据产生的DMR指数。例如，调节剂 DMR指数可以由作用于细胞組，包括干細胞、其各自的重编程細胞及其各自的天然細胞的调节剂概況，和调节剂针对标志物组的调节概况构成，各组标志物针对细胞组中的某种細胞。76.分子调节指数“分子调节指数”等术语是显示分子调节作用于细胞组的标志物组的生物传感器输出信号的能力的指数。通过把有分子存在下，标志物刺激后细胞应答的特定生物传感器输出信号參数根据没有任何分子存在下的參数进行标准化而产生调节指数。77.分子本文所用的术语“分子”等术语指以化学分子或有确定分子量的分子形式存在的生物或生物化学或化学实体。不论其大小，分子等术语是化学、生物化学或生物分子。许多分子是称为有机分子(含有碳原子等，通过共价键连接的分子)的类型，但ー 些分子不含碳(包括简单的分子气体，例如分子氧和更复杂的分子例如一些硫基聚合物)。 通用术语“分子”包括分子的许多描述性分类或分組，例如蛋白质、核酸、碳水化合物、类固醇、有机药物、小分子、受体、抗体和脂质。适当的时候，由于所述方法应用于分子亚组，本文采用这些更具描述性的术语(其中很多，例如“蛋白质”，其本身描述了多组重叠的分子)中的ー个或多个，而这些分子仍可代表通用类别“分子”和指定的亚类(例如蛋白质)。除非明确指出，“分子“ー词包括特定的分子及其盐，例如药学上可接受的盐。78.分子指数“分子指数”等术语是涉及分子的指数。79.分子混合物分子混合物等术语是指含有至少两种分子的混合物。所述两种分子可以是但不限干，结构不同(即对映异构体)、或組成不同(例如，蛋白质同种型、糖形式、或含不同聚乙ニ 醇(PEG)修饰的抗体)、或结构和組成不同(例如未纯化的天然提取物、或未纯化的合成化合物)。80.分子处理的细胞分子处理的細胞等术语是已暴露于分子的細胞。81.多检测点概况分析“多检测点概况分析”等术语表示获得細胞重编程过程中，某細胞在多余一个时间点或条件下的生物传感器概况。82.不连续方式的多检测点概况分析“不连续方式的多检测点概况分析”等术语表示在毗邻两点的概况分析之间，細胞应维持在細胞重编程的预定标准培养条件下。83.天然细胞天然細胞是未经人工遗传工程改造(S卩，过表达靶标或敲除靶标)的任何細胞。天然细胞可以是原代細胞、永生化細胞、转化細胞或干細胞。84.标准化标准化等术语表示，例如调整数据、或概况、或应答以消除至少ー个共有变量。85.任选“任选的”或“任选地”等术语表示随后描述的事件或情形可以发生或不发生，而且该描述包括事件或情形发生的实例和不发生的实例。例如，短语“组合物可任选包含組合” 是指组合物可以包含不同分子的組合或不包含組合，从而说明书包括了組合和不存在組合 (例如組合中各成员)。86.或本文所用的词语“或”等术语表示特定列表中的任何成员，还包括该列表中成员的任意組合。87.组组等术语是预定的ー组样本(細胞或途径)。可以从文库中选取样本来产生組。 组可以是ー组标志物、一組生物传感器表面、一组检测点、一組一级概况等。88. pH缓冲试验溶液pH缓冲试验溶液是经缓冲具有生理pH(pH通常为7. 1)的任何溶液。89.淘选淘选等术语指筛选存在一种或多种受体或細胞靶标的ー种或多种細胞。90. “时期”“时期”指代表时间推移的任何期间。例如，1秒、1分钟、1小吋、1天和1周的时
91.阳性对照“阳性对照”等术语是显示能产生数据集合的数据收集条件的对照。92.效能效能等术语是以产生给定强度效应所需量表述的分子活性量度。效能和亲和カ与功效成比例。亲和カ是药物分子与受体结合的能力。93. 一级概况“ー级概況”等术语指当分子接触細胞时产生的生物传感器应答或生物传感器输出信号或概況。通常，在将原始细胞应答对净零生物传感器信号(即基线)标准化以后获得ー级概況。94.原代细胞“原代細胞”等术语是未经转化的細胞或视作細胞系的細胞。95.概况概况等术语指对组合物，例如细胞收集的数据。如本文所述，概况可以从无标记的生物传感器收集。概况分析指获得概况的行为。本文公开了，例如细胞途径概况分析、原始附着概况分析、时间点概况分析，各自指代所述特定相关类型的概况或概况分析。96.出版物整篇申请中引用了各种出版物。这些出版物的内容通过引用全文納入本申请中以便更完整地描述本申请所属领域的状态。对于公开的參考文献中包含的、在所引用语句中讨论的材料，这些參考文献各自也明确通过引用納入本文。97.脉冲刺激试验“脉冲刺激试验”等术语可用于细胞仅在极短时间(例如，数秒、或数分钟)期间暴露于分子的情況。该脉冲刺激试验可用于研究作用于细胞/靶标的分子的动力学特性，及其对标志物诱导的生物传感器信号的影响。可以在添加分子后的给定时间用液体操作装置将分子溶液简单替换成細胞试验缓冲液进行脉冲刺激试验。98.静息静息等术语指处于静止、平静、休息、休眠、不活跃的状态。静息可指細胞周期中的細胞(^期；或者静息是不分裂的細胞状态。细胞静息定义为各种抗有丝分裂信号，例如促分裂原(例如生长因子)去除、接触抑制和附着丧失诱导的可逆生长/増殖停滞。99.范围在本文中，范围可以表述为始于“约”某一具体数值开始和/或止干“约”另一具体数值。表述此类范围时，另ー种实施方式包括始于某一具体数值和/或止于另一具体数值。类似地，利用前缀“约”将数值表达为近似值时，应该理解，该具体数值构成另ー实施方式。还应理解，各范围的端点是有意义的，而不论与另一端点相关还是独立于该另一端点。 还应理解，本文公开了许多数值，除了该数值本身，各数值也都公开为“约”具体值。例如，如果公开了数值“10”，那么也公开了“约10”。还应理解，当数值公开为“小于或等干”该数值吋，也公开了如技术人员适当理解的“大于或等干”该数值和数值之间可能的范围。例如， 如果公开数值“10”，则也公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，通篇申请，提供了许多不同格式的数据，这些数据代表终点和起点以及这些数据点的任意組合的范围。例如，如果公开了具体数据点“ 10”和具体数据点“ 15”，应理解，可以认为公开了大干，大于或等干，小干，小于或等干，以及等于“ 10”和“ 15”，以及在10-15之间。还应理解， 还公开了两个具体単位之间的各単位。例如，如果公开了 10和15，则也公开了 11、12、13和 14。100.受体受体等术语是包埋在细胞的质膜或胞质内的，可以结合移动信号传导(或“信号”)的蛋白分子。与受体结合的分子称为“配体”，可以是肽(例如神经递质)、激素、药物或毒素，当发生此类结合吋，受体发生的构象变化通常启动细胞应答。但是，ー些配体只是阻断受体而不诱导任何应答(例如拮抗剤)。配体诱导的受体变化导致生理变化，这构成配体的生物学活性。101.相应细胞“相应細胞”等术语是在功能(即，生理学功能)上等价的細胞。对于衍生自干细胞的心肌細胞的例子，其相应细胞应是原代心肌細胞。102.应答应答等术语是指对任何刺激的任何反应。103. “强效生物传感器信号”“强效生物传感器信号”指生物传感器信号的幅度显著超过噪音水平或阴性对照应答(例如3xU0x,20xU00x或IOOOx)。阴性对照应答通常是添加试验缓冲溶液(即载体)后細胞的生物传感器应答。噪音水平是不额外添加任何溶液时细胞的生物传感器信号。值得注意的是，在添加任何溶液前，細胞总是被溶液覆盖。104. “强效 DMR 信号，，“强效DMR信号”等术语指“强效生物传感器信号”的DMR形式。105.样品样品等术语表示如本文所述作试验的动物、植物、真菌等；天然产物、天然产物提取物等；动物的组织或器官；细胞(对象内、或直接取自对象、或在培养物中維持的細胞或来自培养細胞系的細胞)；细胞裂解物(或裂解物的部分)或细胞提取物；或含有衍生自细胞或細胞材料的ー种或多种分子(例如多肽或核酸)的溶液。样品还可以是含有細胞或细胞组分的任何体液或分泌物(例如，但不限于血液、尿液、粪便、唾液、泪液、胆汁)。106. ニ级概况“ニ级概況”等术语是有分子存在下，細胞对标志物起反应的生物传感器应答或生物传感器输出信号。ニ级概况可以用作分子调节标志物诱导细胞应答或生物传感器应答的能力的指示剂。107.含血清的培养基含血清的培养基等词语是含有血清(例如，胎牛血清)的任何細胞培养基。胎牛血清是血液凝结后留下的血浆部分，在该过程中血浆蛋白纤维蛋白原转化成纤维蛋白并维持在凝块中。胎牛血清来自在屠宰场，通过密闭系统静脉穿刺从未出生的牛胎儿通过取得的血液。胎牛血清(FBS)是最广泛使用的血清，因为它的抗体含量低并含有更多的生长因子，从而能应用于许多不同领域。FBS用于培养真核細胞。108.血清消耗培养基
血清消耗培养基是不含血清的任何細胞培养基。109. “短期”“短期”等术语是通常短于标准培养条件下细胞复制的时期。110.信号传导途径“确定的途径”等术语是从接收信号(例如外源配体)到细胞应答(例如細胞靶标表达提高)的細胞途径。在一些情况中，配体与受体结合导致的受体激活与细胞对配体的应答直接偶联。例如，神经递质GABA能激活作为离子通道一部分的細胞表面受体。GABA与神经元上GABA A受体的结合打开了作为受体一部分的氯选择性离子通道。GABA A受体激活使带负电的氯离子移动进入神经元从而抑制神经元产生动作电位的能力。然而，对于许多細胞表面受体，配体-受体相互作用不与细胞应答直接相关。在配体对细胞行为的最终生理效应产生之前，激活的受体必须首先与細胞内的其它蛋白质相互作用。通常，一系列的数个相互作用細胞蛋白质的行为在受体激活后被改变。由受体激活诱导的整套细胞变化称为信号转导机理或途径。信号传导途径可以较简单或相当复杂。111.相似性和指数相似性“指数相似性”等术语表示针对分子的两种指数、或至少三种指数之间基于指数的模式和/或评分矩阵的相似性的术语。评分矩阵与其对应物密切相关，例如在相应细胞中不同分子的ー级概况的签名，和不同分子对某标志物的调节概况的性质和百分比。例如，给予更相似的特征更高的分数，给予不相似的特征较低或负的分数。因为分子调节指数只有三种调节类型，正、负和中性，相似性矩阵相对简単。例如，样品矩阵给正调节指定评分+1， 负调节指定评分-1，中性调节指定评分0。或者，对具有不同水平的一种调节类型可以给予不同分数。例如，可相应给予 10%、20%、30%、40%、50%、60%、100%、200% 等正调节评分为 +1、+2、+3、+4、+5、+6、 +10、+20。相反，对于负调节，可以给予相似但相反的评分。根据该方法，图IOC显示了酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrph0Stin)51针对标志物组的调节指数，表明已知的EGFR抑制剂酪氨酸磷酸化抑制剂51差异性调节不同标志物诱导的生物传感器应答在A549細胞中， 吡那地尔(0% )、聚(IC) (+5% )、PMA(-6% )、SLIGKV-酰胺(0% )、毛喉素(-23% )、组胺(+6% )；和在静息A431細胞中，肾上腺素(-68% )、畑酸(+4% )、EGF(P_DMR，-36% )、 EGF(N-DMR, -5 % )和组胺(-16 0Z0 )。因此，HA1077调节指数的协同评分可以指定为 (0,0. 5、-0. 6、0、-2. 3,0. 6、0、-6. 8,0. 4、-3. 6、-0. 5、-1. 6)。一旦产生分子指数，可将该分子指数与已知调节剂文库比较以测定感兴趣分子的作用模式。从酪氨酸磷酸化抑制剂51的生物传感器指数，可以得出酪氨酸磷酸化抑制剂51显示多重药理学特性 (polypharmacology)的结论，因为它用作EGFR抑制剂(抑制A431中EGF诱导的DMR信号)， 还用作PDE4抑制剂(抑制A431中的肾上腺素和组胺应答，以及A549中的毛喉素应答)。 除了指示某分子的药理学特性的DMR指数，分子DMR指数还可用于区分不同类型细胞的细胞背景。112.细胞饥饿細胞饥饿等术语指在細胞培养期间驱动細胞进入静息的过程。在細胞培养期间去除細胞培养基中的促分裂原(例如，血清或生长因子)是细胞饥饿的最常用手段。促分裂原去除可与其它手段(例如，接触抑制)联用。
113.物质物质等术语是指任何物理客体。材料是物质。分子、配体、标志物、細胞、蛋白质和 DNA可视作物质。机器或物品应视作由物质组成，而本身不视作物质。114.同步细胞同步细胞等术语指細胞群，其中微量滴定板ー个孔中的大多数細胞处于同一状态 (例如，同一細胞周期(如Gtl或ら))。同步细胞等术语还可指操控细胞周围的环境或細胞的生长条件，从而产生其中大多数細胞处于同一細胞周期阶段的細胞群。115.稳定用于药物組合物吋，术语“稳定”等术语在本领域一般理解为表示在特定保存条件下，在给定时期内的活性成分损失低于一定量，通常为10%。认为组合物稳定所需要的时间是相对各产品的用途而言的，并由生产所述产品、保持以便质控和检查、运输到批发商或直接到消费者在其最终使用前被再次保存等商业化实践所決定。包括数月时间的安全因子， 药物的最短产品寿命一般是一年，优选超过18个月。本文所用术语“稳定”參考了这些市场现实情况和在不难获得的环境条件，例如2°C _8°C冷藏条件下保存与运输产品的能力。116.对象全文使用的对象等术语指个体。因此，“对象”可以包括，例如家养的动物，如猫、狗等，牲畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和哺乳动物、非人哺乳动物、灵长类动物、非人灵长类动物、啮齿动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼和任何其它动物。一方面，对象是哺乳动物，例如灵长类动物或人。对象可以不是人。117.悬浮细胞“悬浮細胞”指优选在培养基中培养，其中培养期间细胞不附着或粘着基材表面的細胞或細胞系。然而，悬浮細胞通常可以通过化学(例如共价结合、或抗体-細胞表面受体相互作用)、或物理方式(例如，由于重力作用力沉降到包埋了生物传感器的孔底部)与生物传感器表面接触。因此，悬浮細胞也可用于生物传感器細胞试验。118.测试分子测试分子等术语是在获得该测试分子一些信息的方法中使用的分子。测试分子可以是未知分子或已知分子。119.处理的组织培养物“处理的组织培养物”等术语指在制备条件下预处理細胞培养平板的过程(例如， 等离子体处理并作进ー步灭菌或不作进ー步灭菌)。120.时间检测点或时间点“时间检测点或时间点”等术语指細胞培养期间，操控或表征细胞培养的事件。例如，“时间检测点”可以是将分子或物质加入細胞培养物或利用无标记生物传感器表征细胞培养的事件。細胞培养期间可以有数个“时间检测点”。121.处理处理等术语至少可以两种方式使用。首先，处理等术语可以指对对象采取的给药或行为，从而操控对象。其次，处理等术语可以指将任何两种事物，例如任何两种或多种物质，如分子和細胞混合在一起。这种混合把至少两种物质汇集到一起，从而它们之间可发生接触。例如，“处理细胞以达到高度汇合”表示照料或操控细胞以便它们在表面上达到高度汇合。当处理等术语用于患有疾病的对象时，并不意味治愈或甚至例如症状的减轻。当治疗等术语与处理等术语联用吋，其表示潜在疾病的症状减轻，和/或引起症状的ー种或多种潜在的細胞、生理、或生化诱因或机理减轻。应当理解，本文使用的减轻是相对疾病的状态而言，包括疾病的分子状态，而不仅指疾病的生理状态。122.触发触发等术语指引起或启动事件，例如应答的行为。123.超高汇合超高汇合等术语指細胞培养结束时具有至少99%汇合的細胞群。124.未知分子未知分子等术语是具有未知生物学/药理学/生理学/病理生理学活性的分子。125.数值组分、成分、添加剤、细胞类型、标志物等方面的公开的具体和优选数值及其范围仅用于说明；它们不排除其它限定的数值或限定范围内的其它数值。本发明的組合物、设备和方法包括具有本文所述的任何数值或数值的任何組合、具体数值、更具体数值和优选数值的那些组分、设备和方法。因此，所公开方法、組合物、制品和机器的組合方式可以包含本文讨论的各种组分、步骤、分子和組合物等，或由它们组成、或基本由它们组成。例如，它们可用于表征本文定义的分子，包括配体的方法；本文定义的产生指数的方法；或本文定义的药物发现方法。126.弱贴壁细胞“弱贴壁細胞”是指細胞培养期间与基材表面相互作用、结合或接触较弱的細胞、 細胞系或細胞体系，例如原核或真核細胞。然而，这些类型的細胞，例如人胚胎肾(HEK)细胞通过清洗或培养基交換等物理干扰方式从基材表面解离。无标记細胞试验无标记細胞试验常利用生物传感器监测活細胞中化合物诱导的应答。所述化合物可以是天然产生或合成的、纯化或未纯化的混合物。生物传感器常利用转换器，例如光学、 电学、热量、声学、磁力等转换器将与生物传感器接触的細胞中的分子识别事件或配体诱导的改变转化成可定量的信号。这些无标记生物传感器可用于涉及表征分子复合物如何随时间形成和解离的分子相互作用分析，或用于涉及表征细胞对刺激如何起反应的细胞应答分折。可用于本发明方法的生物传感器包括但不限干，光学生物传感器系统，如表面等离振子共振(SPR)和共振波导光栅(RWG)生物传感器，包括光子晶体生物传感器，共振镜、椭圆计， 和电学生物传感器系统，如生物阻抗系统。可利用公开的方法、組合物和机器表征分化状态经历改变的細胞。如果細胞，例如細胞培养物处于分裂和増殖中，細胞可处于同一分化水平或状态，向分化増加进展或向分化降低进展。如本文所述，如果细胞向分化増加或降低进展，则细胞发生重编程。这种重编程状态通过时间改变或条件改变而发生。可采用公开的方法、組合物和机器获得细胞重编程状态上时间改变或条件改变中的任何单一点或多点组的无标记生物传感器输出結果，例如一级概况、ニ级概况、调节指数等。此外，对于不处于重编程状态，但处于分裂状态的细胞，例如全能或多能干細胞，可采用所述方法、組合物和机器获得本文所述的无标记生物传感器結果。公开了监测细胞重编程过程的方法。例如，重编程方法包括干細胞分化。这些类型的方法通常涉及多检测点，常利用一組或多组标志物。标志物也可以是任何事物，无需具有某些特异性。还公开了表征重编程細胞的性质和质量的方法。这些类型的方法通常利用ー组标志物，但不涉及多检测点。公开了比较未分化細胞、其相应细胞及其重编程細胞的其它方法。这些类型的方法通常利用一组标志物，涉及不同类型細胞的比较。公开的方法也设计用于测定干細胞(即，全能干細胞、子干細胞)的神经元細胞分化谱系，例如神经元分化。可改进所有公开的方法以便用作筛选方法来筛选，例如介导细胞重编程(包括干細胞分化或其它公开的活性)的分子，例如筛选加强所需重编程细胞产物功能的分子。本文公开了采用无标记共振波导光栅生物传感器细胞试验表征干細胞和通过胚胎及诱导型全能干細胞重编程衍生的細胞，及測定干細胞分化途径和阶段的方法。具体地说，公开的方法涉及细胞重编程期间，在多检测点的细胞应答概况分析。如图1所示，未分化的干細胞或干細胞样细胞与生物传感器接触。立即记录細胞附着概况来表征预定一組表面上(例如，层粘连蛋白包被的、纤连蛋白包被的、天然束枪包被的(natural beam gun coated)、細胞粘附肽包被的、组织培养处理的，等等)的細胞附着行为。随后，可在細胞重编程期间，在多个时间点进行細胞信号传导途径概况分析，例如細胞附着于生物传感器表面后3小吋，細胞分化启动后3天，細胞分化后10天和分化细胞达到成熟之吋。細胞培养期间，多检测点概况分析可进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、50或100次。可采用不连续方式进行此类多检测点概况分析；即，毗邻两点的概况分析之间，细胞应维持在预定的标准培养条件下。可在给定的生物传感器内，或在生物传感器阵列内或生物传感器亚组内进行不同时间点的不同概况分析。例如，在384孔生物传感器微量滴定板内，具有細胞的生物传感器亚组用于初始附着概况分析，而具有細胞的第二组生物传感器用于给定时间点的细胞途径概况分析，具有細胞的第三组生物传感器用于另ー时间点的概况分析，等等。 类似地，可利用ー批生物传感器微量滴定板；其中至少ー个微量滴定板用于ー种测试。对于细胞途径概况分析，細胞应培养在预定表面上(例如，层粘连蛋白包被表面)，从而可采用不同时间点之间的比较来表征指定培养条件下細胞重编程的途径和阶段。本文还公开了筛选能介导干細胞和诱导型全能干細胞分化并控制細胞命运的小分子的方法。如图2所示，未分化的干細胞或干細胞样细胞与一組生物传感器表面接触。立即记录附着概况来表征预定一組表面上(例如，层粘连蛋白包被的、纤连蛋白包被的、天然束枪包被的、細胞粘附肽包被的、组织培养处理的，等等)的細胞附着行为。或者，未分化的干細胞或干細胞-样细胞与预定的生物传感器表面接触。然后，在没有或有分子存在下培养細胞。可在細胞培养期间的特定时间，或多个时间点将所述分子引入細胞。例如，細胞培养期间，可引入分子1、2、3、4、5、10、15或20次。生物传感器可用于表征細胞培养期间不同时间检测点的细胞应答概況。生物传感器可以是无标记生物传感器。在分化期间的任何时间检测点，利用一组标志物表征细胞重编程的阶段。如果与多种细胞培养物相比，暴露于分子的細胞培养物具有不同细胞应答概况，则该分子可分类为决定因素。
本文还公开了測定原代細胞(或天然細胞)和通过胚胎及诱导型全能干細胞重编程衍生的其相应细胞之间差异的方法。如图3所示，衍生自干細胞或干細胞样细胞的重编程或分化細胞与一組生物传感器表面接触。立即记录細胞附着概况来表征预定一組表面上 (例如，层粘连蛋白包被的、纤连蛋白包被的、天然束枪包被的、細胞粘附肽包被的、组织培养处理的，等等)的細胞附着行为。记录附着概况是任选的步骤。随后，在标准条件下连续培养细胞一段时间，从而细胞达到所需汇合以便利用无标记生物传感器作細胞概况分析。 培养结束吋，用一组标志物分析細胞概况以表征重编程細胞的功能。同吋，立即表征相应细胞(例如，原代細胞或无需增殖或转化細胞系)在与分化細胞相同的表面上的細胞附着行为。随后，在标准条件下连续培养细胞一段时间，从而细胞达到所需汇合以便利用无标记生物传感器作細胞概况分析。在原代和各細胞培养物之间进行细胞应答概况比较。比较结果用作重编程细胞的质量和性质的指示剂。原代和各細胞培养物的细胞应答概况非常相似或相同表明重编程细胞的质量和性质与原代細胞非常接近。原代和各細胞的细胞应答概况不同表明重编程细胞的质量和性质与原代細胞不同。可在細胞培养期间的数个时间检测点进行比较。例如，細胞培养期间，可进行1、2、3、4、5、10、15或20次比较。本文还公开了在生物传感器微量滴定板上将干細胞原位分化成分化細胞的方法。 如图3所示，该方法包括(1)用UV臭氧新鲜清洁生物传感器微量滴定板，随后作乙醇处理； (2)用含有細胞附着分子(例如，胞外基质蛋白层粘连蛋白)的溶液覆盖生物传感器孔给定的时间；C3)除去额外的溶液，用缓冲液洗涤生物传感器微量滴定板；(4)然后将培养基中的干細胞施加于各孔作細胞接种；( 然后在未分化培养基中培养干細胞一段时间；和(6) 然后用不含生长因子的培养基洗涤细胞来除去生长因子，从而干細胞经历分化；和(7)分化所需时间后，检测細胞。本文还公开了表征通过胚胎及诱导型全能干細胞重编程衍生的細胞体系，和利用这些細胞体系筛选药物的方法。干細胞或干細胞-样细胞可在受控方式(例如，基因操控、 环境控制)经历分化，从而形成多类细胞构成的細胞体系。此类細胞体系对于药物发现有明显优势。例如，祖干細胞可分化成至少三类细胞构成的神经元細胞体系多巴胺能神经元、星形細胞和少突胶质细胞(图4和图5所示例的)。例如，可首先表征和分析多细胞类型构成的体系来进行药物筛选。将药物加入该体系。暴露于药物后，表征并分析細胞。体系中的改变表明药物影响至少ー种细胞类型。可鉴定ー种或多种特定的细胞类型以便进一步测定作为药物的潜在靶标。可利用生物传感器进行该体系的表征。生物传感器可以是无标记生物传感器。本文还公开了利用高分辨率光学生物传感器成像系统，例如表面等离振子成像、 共振波导光栅成像、或共振镜成像、或椭圆计成像来表征通过胚胎及诱导型全能干細胞重编程衍生的細胞体系或混合細胞群的方法。本文还公开了利用高频获取生物传感器系统，例如高频生物传感器系统分析快速细胞应答(例如，通过干細胞重编程衍生的心肌細胞跳动)概况的方法。本文还公开了增强通过干細胞或干細胞样细胞重编程衍生的神经细胞的无标记生物传感器应答的方法。具体地说，所述方法利用抗多巴胺抗体来螯合神经细胞释放到培养基中的多巴胺。公开的方法还在分化期间利用小分子预处理衍生的神经细胞以加强多巴胺应答。小分子包括但不限于多巴胺神经元保护剂，例如类固醇雌ニ醇。可在細胞分化期间的不同阶段(増殖或分化期)引入此类多巴胺神经元保护剂，例如17β_雌ニ醇。本文还公开了分析成人干细胞变成全能状态和成人体细胞变成全能干細胞的重编程过程的概况的方法。公开的方法还涉及筛选上述调节和控制这些細胞命运的分子。本文公开了重编程干細胞，例如全能干細胞、诱导型全能干細胞、胚胎干細胞、成人干细胞和神经祖細胞，如ReNcell VM的方法。本文公开了測定原代細胞和通过全能干細胞重编程衍生的其相应细胞之间差异的方法。本文公开了表征通过胚胎和诱导型全能干細胞重编程衍生的細胞体系，和利用这些细胞体系筛选药物的方法。还公开了筛选可介导干細胞和诱导型全能干細胞分化并控制細胞命运的小分子的方法。公开的方法中，可在给定的生物传感器内，或在生物传感器阵列内或生物传感器亚组内进行不同时间点的不同概况分析。例如，在384孔生物传感器微量滴定板内，具有细胞的生物传感器亚组用于初始附着概况分析，而具有細胞的第二组生物传感器用于给定时间点的细胞途径概况分析，具有細胞的第三组生物传感器用于另ー时间点的概况分析，等等。对于细胞途径概况分析，細胞应培养在预定表面上(例如，层粘连蛋白包被表面)，从而可采用不同时间点之间的比较来表征指定培养条件下細胞重编程的途径和阶段。公开的方法包括获得未分化細胞，使该未分化細胞附着于无标记生物传感器系统的生物传感器表面，培养附着的細胞直至第一检测点，获得标志物的第一检测点ー级概况。公开的方法还包括培养附着的細胞直至第二检测点，和获得标志物的第二检测点 ー级概況。此外，方法中加入第三、第四或η个检测点和相伴行为(η个或任何亚组)。公开的方法包括获得分化的細胞，使该分化的細胞附着于生物传感器表面，培养附着的細胞直至第一检测点，直至达到所需汇合，获得标志物的第一检测点一级概况，获得相应細胞，使该相应細胞附着于生物传感器表面，培养该相应细胞直至第一检测点，和获得生物传感器細胞信号传导特征。公开的方法包括获得分化的細胞，使该分化的細胞附着于生物传感器表面，培养附着的細胞直至第一检测点，获得某标志物的第一检测点ー级概況，获得相应細胞，使该相应细胞附着于生物传感器表面，培养该相应细胞直至第一检测点，获得该标志物的第一检测点ー级概況。公开的方法还包括获得生物传感器表面的細胞附着第一概況，其中在附着后的10 小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、0. 5小时、0. 2小
时或0. 1小时内获得所述附着概況，还包括为ー组生物传感器表面重复步骤a和b，获得该组生物传感器表面中各生物传感器表面的細胞附着概況，包括为ー组检测点η重复步骤c 和d，从而产生一组检测点η —级概况，还包括温育分子、未知分子、候选药物分子或候选重编程分子与細胞，然后获得ー级概况，还包括在多于ー个时间点温育该分子、该未知分子、 该候选药物分子或该候选重编程分子与该细胞并获得各时间点的ー级概况，还包括利用一组标志物表征该细胞并产生各标志物的一组ー级概況，或本文公开的这些或任何其它特征的任何組合。
公开的方法还包括产生多于ー个时间点或細胞的一組条件下各标志物的ー级概况，还包括产生温育分子、未知分子、候选药物分子或候选重编程分子对于ー组标志物中各标志物的ニ级概況，其中在各检测点产生各标志物的ー级概況，其中生物传感器表面包含层粘连蛋白、组织培养处理的生物传感器表面、纤连蛋白、天然束枪(natural beam gun), 細胞粘附肽、组织培养处理，其中所述第一检测点在附着后的3小时或不到、3天或不到、7 天或不到、10天或不到，开始分化吋，分化后，或成熟前，其中所述第二检测点在附着后的3 小时或不到、3天或不到、7天或不到、10天或不到，其中所述第三检测点在附着后的3小时或不到、3天或不到、7天或不到、10天或不到，其中所述第一检测点在附着后的3小时或不到、3天或不到、7天或不到、10天或不到，开始分化吋，分化期间，或分化成熟后，其中細胞信号传导表征包括利用标志物，或这些或本文公开的任何其它特征的任何組合。还公开的方法中所述标志物组包含一组标志物乙酰胆碱、腺苷、ATP、精胺、 强啡肽A、内皮肽1、神经肽B-23 (NPB-23)、食欲素A、SFLLR-酰胺、UDP、神经肽、血管活性肠肽、ADP、多巴胺、GABA、阿皮林、α-黑素細胞-刺激激素、血小板生长因子、血管紧张素II、高血糖素样肽、溶血磷脂酸、神经牵张素、P物质、酪胺、UTP、硬骨鱼紧张肽 II、8-CPT-2-Me-cAMP、毛喉素、MAS_7、740Y_P、L783281 和 PMA，其中标志物的浓度是 0. 0005 μ Μ-1000 μ Μ、0· 01 μ Μ-100 μ Μ、0· 1 μ Μ-50 μ Μ、0· 1 μ M-IO μ Μ、1 μ M-IO μ Μ、 0. 001 μ M-IO μ Μ，其中所述标志物组包括选自以下的一组标志物G蛋白-偶联受体激动剂、受体酪氨酸激酶激动剂、激酶激活剂、酶激活剂、酶抑制剂和受体激动剂，它们的ー级概况用作未分化細胞的重编程細胞的性质和质量的指示剂，其中所述标志物组包含选自以下的一组标志物G蛋白-偶联的受体激动剂、受体酪氨酸激酶激动剂、激酶激活剂、酶激活剂、酶抑制剂和受体激动剂，它们的一级概况用作未分化細胞、其重编程細胞和其相应细胞中差异的指示剂，其中所述标志物组包含已知调节剂，其DMR指数用作未分化細胞的重编程細胞的性质和质量的指示剂，其中标志物组包含一組已知调节剂，其DMR指数用作未分化細胞、其重编程細胞和其相应细胞中差异的指示剂，其中所述标志物组选自乙酰胆碱、 腺苷、ATP、精胺、强啡肽A、内皮肽1、神经肽B-23、食欲素A、SFLLR-酰胺、UDP、神经肽、血管活性肠肽、ADP、多巴胺、GABA、阿皮林、α -黑素細胞_刺激激素、血小板生长因子、血管紧张素II、高血糖素样肽、溶血磷脂酸、神经牵张素、P物质、酪胺、UTP、硬骨鱼紧张肽II、 8-CPT-2-Me-cAMP、毛喉素、MAS_7、740Y_P、L783281和PMA，其中对于干细胞或祖干细胞的神经元細胞分化谱系，标志物组选自乙酰胆碱、腺苷、ATP、精胺、强啡肽A、内皮肽1、神经肽B-23、食欲素A、SFLLR-酰胺、UDP、神经肽、血管活性肠肽、ADP、多巴胺、GABA、阿皮林、 α -黑素細胞-刺激激素、血小板生长因子、血管紧张素II、高血糖素样肽、溶血磷脂酸、神经牵张素、P物质、酪胺、UTP、硬骨鱼紧张肽II、8-CPT-2-Me-cAMP、毛喉素、MAS_7、740Y_P、 L783281和PMA，其中EPAC-PII途径的下调或改变指示了干細胞或祖干細胞的神经元細胞分化谱系，其中PKC途径的下调或改变指示了干細胞或祖干細胞的神经元細胞分化谱系， 其中选自Dl受体、NPY受体、食欲素A受体、阿片类物质受体、毒蕈碱受体和P2Y受体的神经元細胞-相关GPCR的功能信号传导指示了干細胞或祖干細胞的神经元細胞分化谱系，或这些或本文公开的任何其它特征的任何組合。还公开了，其中进行多检测点概况分析，其中所述多检测点概况分析以不连续方式进行，其中无标记生物传感器是表面等离振子共振系统(SPR)、RWG生物传感器系统、阻抗系统、高分辨率光学生物传感器成像系统、共振镜成像系统、椭圆计成像系统、高频获取生物传感器系统，其中所述相应細胞包括原代細胞、永生化細胞系或转化細胞系，还包括比较重编程細胞及其相应细胞的细胞应答概況，还包括依据细胞应答概况鉴定細胞，还包括細胞体系，其中所述细胞体系包含多于ー种分化的细胞类型，其中所述细胞体系包含多巴胺能神经元、星形細胞和少突胶质細胞，其中所述细胞体系通过全能或多能干細胞重编程产生，或者这些或本文公开的任何其它特征的任何組合。还公开了以下方法，其中所述相应細胞包括原代細胞、永生化細胞系或转化細胞系，还包括比较未分化細胞、其重编程細胞及其相应细胞的細胞应答概况，还包括依据细胞应答概况鉴定細胞，还包括多于ー类衍生自干細胞或祖干細胞的细胞组成的細胞体系，还包括通过生物传感器表面上干細胞或祖干細胞原位分化获得的細胞体系，其中产生重编程細胞，其中所述重编程細胞包括神经細胞，还包括温育该细胞与抗多巴胺抗体，还包括温育该细胞与多巴胺神经元保护剂，其中所述多巴胺神经元保护剂包括类固醇雌ニ醇，其中所述类固醇包括17 β-雌ニ醇，其中所述类固醇雌ニ醇在增殖阶段引入，其中所述类固醇雌 ニ醇在分化阶段引入，其中所述类固醇雌ニ醇在分化細胞成熟后引入，或者这些或本文公开的任何其它特征的任何組合。还公开了以下方法，其中监测某細胞重编程为全能干細胞，其中将某分子施加于该细胞以测定该分子是否介导该细胞重编程，其中将某分子施加于该细胞以测定该分子重编程该細胞，其中生物传感器表面包括多孔板，其中所述多孔板包括96或384或1536个孔，或者这些或本文公开的任何其它特征的任何組合。所述标志物可以是上述标志物的任何亚组。生物传感器127. SPR 和系统表面等离振子共振(SPR)依靠棱镜把覆盖入射角范围的楔形偏振光导入装有导电金属膜(例如金)的平面玻璃基材上以激发表面等离子体。所产生的渐消波与金层中的游离电子云相互作用并被吸收，从而产生电荷密度波(即，表面等离子体)并导致反射光强度减弱。产生该最低強度的共振角与传感器表面相对面上接近金层的溶液的折射率呈函数关系。通常经与泵和微通道相连的微流体引入化合物。128. RffG生物传感器和系统共振波导光栅(RWG)生物传感器可包括，例如基材(如玻璃)、含包埋光栅的波导薄膜和細胞层。RWG生物传感器借助衍射光栅，采用共振偶联将光引入波导，从而导致在溶液-表面界面产生全内反射，进而在界面产生电磁场。这ー电磁场本质是渐消的，表示它从传感器表面指数衰减；它衰减到初始值的Ι/e的距离称为贯穿深度，它与具体RWG生物传感器的设计呈函数关系，但通常在约200nm。该类生物传感器利用此类渐消波表征传感器表面或其附近的细胞层的配体诱导变化。RWG仪器可以根据角度漂移或波长漂移測量细分为不同系统。在波长漂移測量中， 采用具有恒定角度的覆盖入射波长范围的偏振光照射波导，特定波长的光偶联入波导并沿其放大。或者，在角度漂移仪器中，用単色光照射传感器并测量光的共振偶联角度。共振条件受与生物传感器表面直接接触的細胞层影响(例如細胞融合、附着和状态)。当配体或分析物与活细胞内的細胞靶标(例如，GPCR、激酶)相互作用吋，细胞层内局部折射率的任何变化可以检测为共振角(或波长)的漂移。C0rning EpiC 系统利用RWG生物传感器进行无标记生化或細胞试验(康宁公司，康宁，纽约州)。所述Epic 系统由RWG平板读数计和SBS (生物分子筛选学会)标准微量滴定板组成。平板读数计的检测器系统利用集成光纤测量入射光的波长漂移，该漂移是細胞内配体诱导变化所致。一系列照射-检测头以线形方式排列，从而能同时采集384孔微板的列中各孔的反射光谱。扫描整块板使得各传感器被多次访问，每列依次访问。收集入射光的波长用于分析。所述仪器可包括温控单元以尽可能减少温度波动导致的入射波长伪漂移。测得的应答代表細胞群的平均应答。通过自带(on-board)移液管或外部液体处理器引入化合物。129.电学生物传感器和系统电学生物传感器由基材(例如，塑料)、电极和細胞层组成。在该电检测方法中，在基材上排列的小金电极上培养細胞，并按时跟踪系统的电阻杭。阻抗是对細胞层电导率变化的量度。通常，在电极或电极阵列上施加定频或变频的小恒定电压，随时间监测流经电路的电流。配体诱导的电流变化提供了细胞应答的量度。1984年首次实现用于全细胞感测的阻抗测量。自此，阻抗测量应用于研究广泛的細胞事件，包括細胞附着和扩展、細胞微动、细胞形态变化和細胞死亡。经典阻抗系统因使用小检测电极和大參比电极而导致的试验变异性高。为克服该变异性，最新一代的系统，例如CellKey系统(MDS赛科斯(MDS Sciex)，加利福尼亚州南旧金山)和RT-CES(ACEA生物科学公司(ACEA Biosciences he.)，加利福尼亚州圣迭戈)利用具有微电极阵列的集成电路。通过自带移液管引入化合物。130.高空间分辨率生物传感器成像系统光学生物传感器成像系统，包括SI3R成像系统、椭圆计成像系统和RWG成像系统， 提供高空间分辨率，优选用于本发明方法中。例如，SPRimager II(GWC技术公司)采用棱镜偶联SPR，以固定入射角測量SPR，用CCD相机收集反射光。记录表面的变化作为反射率变化。因此，sra成像同时收集阵列中所有元件的測量值。最近，康宁公司还公开了依据RWG生物传感器的扫频波长光学查询系统以供成像应用。该系统中，利用快速可调谐激光源照射传感器或微孔板形式的RWG生物传感器阵列。 可以通过检测激光波长扫描时传感器反射的光能与时间的函数关系构建传感器光谱，用计算机化共振波长查询模型分析所测数据得到固定有受体或细胞层的生物传感器的空间解析图像。使用图像传感器自然生成基于成像的查询方案。无需移动部件即可获得ニ维无标记图像。或者，还可利用具有横向磁力或ρ-偏振光TMtl模式的Corning Epic 角度查询系统。该系统由发射系统和基于CCD相机的接收系统組成，发射系统产生光束阵列使其中各光束以约200 μ m χ 3000 μ m或200 μ m χ 2000 μ m的维度照射RWG传感器，接收系统用于记录从这些传感器反射光束的角度变化。借助分光器和衍射光学镜片的组合获得排列的光束。该系统每3秒最多能同时取样49个传感器(7x7孔传感器阵列)。或者，还可利用扫描波长查询系统。该系统中，利用覆盖恒定角度入射波长范围的偏振光照射并扫描波导光栅生物传感器，可同时记录各位置的反射光。通过扫描，也可以获得生物传感器的高分辨率图像。在所有备选方案中，通过自带移液管或外部液体处理器引入化合物。
无标记生物传感器細胞试验表明活细胞中配体诱导的动态质量再分布(DMR)信号通过细胞靶标介导的細胞信号传导由下游信号传导网络的空间和时间动力学特性编码。信号传导活性的时间动力学特性与空间梯度偶联能在刺激后引导细胞应答。实时监测細胞信号传导的整合(如果实现的话)能提供用于理解細胞生物学和生理学的相关信息。光学生物传感器包括共振波导光栅(RWG)生物传感器，它们显示了与細胞物质动态再分布相关的生理学相关和整合细胞应答，从而为研究細胞信号传导提供非侵入性手段。所有光学生物传感器的共同点在于它们能測量传感器表面或其附近的局部折射率改变。原则上，几乎所有光学生物传感器都适用于細胞感测，因为它们能利用渐消波表征細胞内配体诱导的改变。渐消波是电磁场，由光在溶液-表面界面的全内反射产生，它通常延伸到溶液内很短的距离(约数百纳米)，其特征深度称为贯穿深度或感测容积。近来，开发出理论和数学模型描述活细胞中对配体刺激起反应测得的光学信号的參数和特性。这些模型基于3层波导系统与已知細胞生物物理特性的结合，其将配体诱导的光学信号与受体介导的数个细胞过程联系起来。由于生物传感器測量入射光照射区域細胞的平均应答，利用高汇合細胞层以获得最佳试验結果。由干与生物传感器的短贯穿深度相比細胞尺寸较大，传感器配置考虑非传统三层系统基材、具有光栅结构的波导膜和細胞层。因此，配体诱导的有效折射率(即，测得的信号)改变可以与细胞层底部的折射率该变直接成比例(ー级形式)ΔΝ = S(C) Anc(I)其中S (C)为对细胞层的灵敏度，Δη。为生物传感器感测的配体诱导细胞层局部折射率改变。由于细胞内给定体积的折射率主要由生物分子，如蛋白质的浓度決定，Δη。可以假定与配体诱导的局部細胞靶标浓度或感测体积内的分子组件浓度改变直接成比例。考虑到从传感器表面延伸的渐消波的指数衰减性质，配体诱导的光学信号受下式支配
“Zlj- "zHiAiV = S(C)^AC,严ご 一 e 叫
丨L 」(2)其中，AZc为进入細胞层的贯穿深度，α为特定折射増量(蛋白质为约0. 18/mL/ g)，Zi为质量再分布发生的距离，和d是细胞层内片层的假想厚度。在此，細胞层在竖直方向上分成等间距的片层。方程式2表明配体诱导的光学信号是离传感器表面不同距离的质量再分布的加合，各自对总应答的贡献不等。此外，就波长或角度漂移而言，测得的信号主要对发生在传感器表面垂直方向上的质量再分布敏感。因为其动态本质，也称为动态质量再分布(DMR)信号。細胞依靠多种細胞途径或机制加工、编码和整合接收的信息。与利用光学生物传感器特异性测量分析物与蛋白靶标结合的亲和カ分析不同，活细胞更复杂和动态。为研究細胞信号传导，可以将細胞与生物传感器的表面接触，这能通过细胞培养实现。这些培养的细胞可以通过三类接触附着在生物传感器表面焦点接触、贴近接触和胞外基质接触，其中每种具有离开表面的特征性间隔距离。根据细胞类型以及生物传感器表面的表面化学特性，細胞能采用这些接触类型中的ー种或多种来附着于生物传感器表面。 因此，基础細胞膜常位距离表面约lO-lOOnm。这些生物传感器能感测細胞的底部部分。，細胞表现出表面依赖性附着和増殖。为获得可靠的細胞试验，需要包被生物传感器表面以增强細胞粘着和増殖。另ー方面，表面特性能直接影响细胞生物学特性。例如，表面结合的配体能影响细胞的应答，而基材的机械顺应性同样影响，其决定了在細胞施加的作用力下基材如何变形。与培养条件(时间、血清浓度、汇合度等)综合来看， 不同表面和不同条件得到的細胞状态可能不同。因此，开发生物传感器細胞试验必需尤其当心控制細胞状态。細胞是相对尺寸较大(通常在数十微米范围内)的动态物体。在组织培养中通过在亚细胞分辨率的延时显微镜(time lapse microscopy)以及纳米水平的生物阻抗测量观察到，即使没有刺激，細胞也不断经历微动-细胞结构的动态移动和重塑。在未刺激条件下，用RWG生物传感器检测細胞一般得到几乎为净零的DMR应答。这部分是因为光学生物传感器的空间分辨率低，这是由激光点的尺寸大和偶联光的传播长度长决定的。激光点的尺寸决定所研究区域的尺寸-通常一次只能追踪ー个分析点。因此， 生物传感器通常測量位于光入射区域的細胞大群体的平均应答。虽然細胞在单细胞水平经历微动，检测的細胞的大群体产生平均为净零的DMR应答。此外，已知在哺乳动物細胞内， 胞内大分子高度有序且空间局限于适当位点。蛋白质的定位受严密控制以便細胞调节蛋白质与其适当伴侶相互作用的特异性和效率，在空间上隔开蛋白质激活和失活机制，因而决定了特异性蛋白质功能和应答。因此，在未刺激条件下，在感测体积内細胞的局部质量密度可以达到平衡状态，从而导致净零光学应答。值得注意的是，检测的細胞常在常规培养条件下培养了一段时间，使得大多数细胞刚好完成ー个分裂周期。活细胞具有感测和应答外源信号的精确能力。以前认为細胞信号传导通过线性途径起作用，环境信号触发线性反应链，从而产生单个明确的应答。然而，累积的研究显示对细胞外界刺激的应答远要复杂。显然，細胞接收的信息加工并编码成信号传导蛋白的磷酸化和拓扑移位的复杂时间和空间模式。蛋白质空间和时间靶向到适当位点对于调节蛋白-蛋白相互作用的特异性和效率至关重要，因此决定了細胞信号传导和应答的时机和强度。关键的细胞决策，例如細胞骨架重组、細胞周期检测点和凋亡，取决于激活的信号转导蛋白的精确时间控制和相对空间分布。因此，通过细胞靶标例如G蛋白偶联受体(GPCR)介导的細胞信号传导常以有序且受调节的方式进行，并由ー系列空间和时间事件組成，其中很多导致細胞的局部质量密度该变或局部細胞物质再分布。当这些该变或再分布在感测体积内发生吋，可以利用光学生物传感器直接实时跟踪。因此，得到的DMR信号是活細胞的新型生理学应答，含有活细胞中配体-受体配对的体系細胞生物学信息，DMR信号含有作用于活细胞的配体的体系细胞药理学信息。VI.实施例a)材料与方法(1)材料多巴胺、A68930、PD128907,GABA, ADO、肥大细胞脱粒肽(mastoparan)、乙酰胆碱、SKF83566购自密苏里州圣路易斯的托克カ斯公司(Tocris, St. Louis, M0)。神经肽 B (NPB-23)、食欲素Α、强啡肽Α、神经肽Y、SFLLR-酰胺和内皮素-I购自宾夕法尼亚州金戈夫普鲁西亚的BC公司(BaChem，King of Prussia, PA)。Epic 384生物传感器微孔板购自纽约州康宁市的康宁公司。
(2)灭菌和包被EPIC 384孔板各EPIC板经UV照射6分钟，然后作70%乙醇洗涤，維持在组织培养罩中。第二天，用磷酸缓冲盐水(PBQ洗涤平板两次，将DMEM/F 12配制的20 μ 1 20 μ g/ml层粘连蛋白(Sigma L2020，lmg/ml，圣路易斯，密苏里州)加入各孔，37°C在CO2孵育箱中温育5小吋。 除去层粘连蛋白溶液后，用PBS洗涤包被孔1次，将含有3000个细胞的50 μ 1維持培养基加入各孔以进行細胞试验。(3)細胞培养在层粘连蛋白包被的Τ75组织培养烧瓶中(康宁，纽约)，用含有20ng/mL FGF-2 和20ng/mL EGF(加利福尼亚州特姆库拉的密理博公司(Millipore, Temecula, CA))的 ReNcell NSC維持培养基(加利福尼亚州特姆库拉的密理博公司)常规培养加利福尼亚州特姆库拉的密理博公司的ReNcell VM人神经祖細胞(ReN細胞)。对于未分化細胞的維持和生长，每天更换培养基。37°C，在95%空气/5% CO2的加湿气氛下維持培养的細胞。利用加利福尼亚州特姆库拉的密理博公司的Accutase 每周传代細胞一次。对于利用Epic进行的細胞试验，通常采用约3x IO3个细胞/孔，在50微升对应培养基中将未分化細胞接种在层粘连蛋白新鮮包被的生物传感器微孔板中，37°C，空气/5% CO2的气氛下温育。第二天，除去各孔的培养基，替换成不含FGF-2和EGF的新鮮ReNcell NSC維持培养基来启动分化。每2-3天更换新鮮的ReNcell NSC維持培养基，共10天。试验时所有細胞的汇合度为约95%到100%。(4)免疫細胞化学在层粘连蛋白包被的384-孔Epic微孔板上生长和/或分化后，除去培养基，用冷的4%低聚甲醛/PBS固定细胞15分钟，然后作两次PBS洗涤。室温下，透化处理細胞，用PBS 配制的5%普通山羊血清(NGS，载体实验室(Vector labs) ),0. 3% TritonX-IOO封闭2小吋。对于表面的染色，利用少突胶质细胞标志物，01，ー种不可滲透的封闭溶液(PBS配制的普通山羊血清(NGS，载体实验室))。利用1 1000的小鼠单克隆抗体检测β III-微管蛋白(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma)，抗-GFAP家兔多克隆抗体以1 5000 (DAKO) 使用，抗-01以1 500使用，杭-酪氨酸羟化酶(TH)以1 250(加利福尼亚州特姆库拉的密理博公司)使用。4°C，温育ー抗过夜。用PBS洗涤两次后，室温下，用溶解于含 NGS的PBS的过滤Alexa染料偶联山羊抗-小鼠488(1 250 ；分子探针公司(Molecular ftObes))或Alexa染料偶联山羊杭-家兔568(1 2500 ；分子探针公司)处理1. 5小时。 用PBS洗涤細胞，用IOmM Hoechst 33342(西格玛公司)复染4分钟，然后再作PBS洗涤。(5)細胞附着试验对于細胞附着试验，将未分化的ReNcell VM細胞重悬在HBSS (lx Hanks平衡盐溶液，加上20mM Hepes,pH 7. 1)或維持培养基中，终浓度为6x IO5个細胞/毫升，转移入384 孔聚丙烯化合物储存板。另外制备化合物来源板以供该试验的第二步骤。与此同时，用层粘连蛋白新鮮包被生物传感器微孔板或不作包被，用D-PBS洗涤。除去D-PBS后向各孔中加入25 μ 1 HBSS或維持培养基。然后在读数计系统中温育生物传感器微孔板、細胞来源板和化合物来源板2小吋。細胞在试验前手工重悬在化合物板中。记录生物传感器微孔板中所有生物传感器的基线波长，校正为零。随后，连续记录2-10分钟以建立基线，利用自带液体处理器将25微升細胞溶液转移入生物传感器板。进行細胞附着并记录3小吋。对于第ニ步骤，温育后，记录细胞试验微孔板中所有生物传感器的基线波长并校正为0。然后，连续记录2-10分钟以建立基线，并确保细胞达到稳态。随后，利用自带液体处理器将10μ 1化合物溶液移入細胞试验板来触发细胞应答。(6)光学生物传感器系统和细胞试验利用Epic 波长查询系统(纽约州康宁的康宁公司)进行全細胞感测。该系统由温度控制单元、光学检测单元和用机器人的自带液体操作单元组成。所述检测单元以集成光纤为核心，能以约15秒的时间间隔对细胞应答进行动力学測量。利用自带液体操作单元引入化合物溶液(即，移液)。RffG生物传感器能检测传感器表面附近的局部折射率的微小变化。由于细胞内局部折射率与生物质(例如，蛋白质，分子复合物)的密度及其分布呈函数关系，生物传感器利用其渐消波非侵入性地检测天然細胞内配体诱导的动态质量再分布。渐消波延伸入細胞井随距离呈指数衰减，从而产生约150纳米的特征感测容积，提示通过受体激活介导的任何光应答仅代表渐消波取样的細胞部分的平均值。受体激活下游的许多細胞事件的集合决定配体诱导DMR的动力学特性和幅度。对于生物传感器细胞试验，用HBSS (lx Hanks平衡盐溶液，加上20mM Hepes, pH 7. 1)稀释保存的浓缩溶液制得化合物溶液，转移到384孔聚丙烯化合物储存板以制备化合物源板。当进行两步试验吋，分別制备两个化合物源板。与此同时，细胞用HBSS洗涤两次并维持在40 μ 1 HBSS中以制备細胞试验板。然后将細胞试验板和化合物源板在读数计系统中温育。温育后，记录细胞试验微孔板中所有生物传感器的基线波长并校正为0。然后， 连续记录2-10分钟以建立基线，并确保细胞达到稳态。随后，利用自带液体处理器将10μ 1 化合物溶液移入細胞试验板来触发细胞应答。所有研究在受控温度(观で)下进行。进行至少两组独立实验，各组至少重复进行三次。(7)光学生物传感器系统和细胞试验b)实施例1 在生物传感器表面形成衍生自干細胞的神经元細胞体系干細胞和干細胞衍生细胞不仅可用于再生医学，还在药物发现中起重要作用。目前药物的高消耗率是健康护理体系的严重负担。许多人相信，这种无效而昂贵的药物开发问题可通过更加精确地展示实际人类疾病的疾病模型来改正，从而能更好地理解潜在的机理及获得和验证有效而安全的药物。原则上，人胚胎干(ES)或iPS細胞可用于该目的。ES 細胞可得自患有特定疾病的患者，可建立方案指导疾病特异性ES细胞变成在该疾病中受影响的各类細胞。此类疾病相关细胞应能促进更具预测性的药物发现和毒性研究。此外， 依据细胞体系的方法还对提高药物发现和开发方法的效率有显著益处，从而能降低成本。干細胞或干細胞样细胞可分化成由多类细胞构成的細胞体系。因此，此类细胞体系可通过干細胞重编程获得，从而提供优秀的药物检验和发现結果。密理博公司的可商品化购得的祖干細胞系ReNcell VM細胞用于在生物传感器表面上将此类細胞原位重编程为神经元細胞体系。ReNcell VM細胞系是源自发育人脑的腹侧中脑区域(ventral mesencephalic region)的人神经干細胞系，通过myc原癌基因的逆转录病毒转导使之永生化。除了能分化成几类神经元細胞，该细胞系还提供稳定的表型和基因型。ReNcell VM 系因其自我更新能力和在功能分化后的多种潜能而表征为NSC。由于其myc永生化转导，可在无血清培养基中在层粘连蛋白上将ReNcell VM系培养成单层培养物，而不丧失生物学能力或产生核型异常。Myc能驱动和維持干細胞的自我更新和増殖，因而阻止分化和分化相关的蛋白质组学改变直至需要吋。因此，ReNcell VM是药物发现和研究应用的理想、标准化、 体外、基于人的平台。如图4所示，用层粘连蛋白新鮮包被康宁384孔Epic生物传感器微孔板，所述层粘连蛋白是能使得干細胞分化成神经元的胞外基质蛋白。利用自动移液管将ReNcell VM细胞加入层粘连蛋白包被的生物传感器表面。培养一天后，去除生长因子启动細胞分化；即， 除去各孔的培养基并换以不含FGF-2和EGF的新鮮ReNcell NSC維持培养基。每2_3天更换新鲜的ReNcell NSC維持培养基，持续10天。培养结束时，采用多种标志物免疫染色来表征得到的細胞。如图5所示，細胞培养和分化过程中ReNcell经历形态改变；随着細胞分化，越来越多的細胞变长。形态改变中的这些进展表明Epic 层粘连蛋白包被微孔板上的 ReNcell原位分化经历数个阶段。再如图6所示，ReNcell VM細胞分化成至少由三类细胞构成的神经元細胞体系 多巴胺能神经元、星形細胞和少突胶质細胞。少突胶质细胞的存在通过表面少突胶质细胞标志物01染色证明。通过GFAP染色证明有星形細胞存在，通过β III-微管蛋白和酪氨酸羟化酶双重染色证明有多巴胺能神经元存在。c)实施例2 利用Epic 系统表征通过ReNcell神经干细胞祖细胞重编程得到的神经元細胞体系生长因子(EGF和reF-幻除去后，ReNcell易在标准组织培养条件下分化成神经元。根据特异性多巴胺能标志物的免疫染色研究(图7所示例的)以及蛋白质组和基因组研究(參见密理博的产品相关信息)，得到的神经元具有功能性多巴胺能特征。然而，对于重编程神经元細胞体系中内源性受体的功能没有直接报道。因此，利用Epic 系统表征所得細胞体系中内源性多巴胺受体的DMR概況。如图7所示，用以下三种多巴胺受体激动剂刺激后，分化的ReNcell细胞产生少量但可重现的DMR信号强效D3/D2受体激动剂 PDU8907、强效选择性Dl受体激动剂A68930和非选择性多巴胺受体激动剂多巴胺。然而， 这三种激动剂诱导的DMR信号在细节特征上不同，更有趣的是，多巴胺应答接近PD128907 和A68930DMR信号之和。这些结果表明A68390触发分化細胞中内源性Dl受体特异性的DMR 信号，而PD 128907激活另一内源性多巴胺受体(可能是D2受体)，该剂量的多巴胺能激活 D 1和D2受体。实际上，Dl和D2特异性拮抗剂的追踪药理学研究均证实此类情况(数据未显示)。分化細胞的多巴胺剂量依赖性应答产生了其它证据。如图7D所示，多巴胺导致双相依赖性DMR信号，将刺激后50分钟的幅度对多巴胺浓度制图。低剂量下(く 4000nM)， 多巴胺导致类似于A68930诱导的DMR信号。然而，高剂量下，多巴胺诱导的DMR信号接近 A68390和PD129807信号的简单之和。这表示神经元細胞或干細胞或干細胞祖细胞重编程衍生的細胞体系中功能性和内源性多巴胺受体的第一无标记概況。d)实施例3 利用Epic 系统表征干細胞分化的神经元谱系的方法对于干細胞的许多关注涉及它们在细胞替代治疗中的应用；然而，干細胞还能改变发现和验证治疗剂的方式。可制备在各种疾病中受影响的人ES細胞的分化細胞，可在培养皿中进行预测性毒性检验和治疗剂研究。第一歩需要采用体細胞核转移(SCNT)，通过重编程(去分化)成人体細胞来分离患者的疾病-特异性的ES細胞系，或利用转录因子的混合物产生iPS細胞。还感兴趣的是鉴定驱动成人体細胞重编程的其它蛋白质或小分子。在 SMA和亨廷顿病的情况中，可从用于胚胎植入前遗传学诊断(PGD)的人胚胎获得疾病特异性ES細胞。然后，人ES細胞培养分化成在感兴趣疾病中受影响(例如，帕金森病中的黑质 DA神经元或亨廷顿病中的中棘神经元)或与毒性检验相关(心脏细胞和肝細胞)的细胞类型。需要驱动ES細胞分化以产生能治疗性用于细胞替代治疗的細胞(例如，治疗I型糖尿病的胰腺β細胞)。分化筛选本身也能产生调节參与疾病的途径(Hedgehog、Wnt、BMP，等等)的候选治疗剂或调节细胞増殖的化合物。自从1981年建立了小鼠ES细胞以及1998年建立了人ES細胞，ES細胞増殖和分化技术中取得了许多进展。在过去10年，报道了数种方法来控制ES細胞分化成神经細胞。 依据所需的神经细胞类型，各方法有其自身的优缺点，并可诱导CNS内不同区域身份的神经组织的分化。ES細胞可分化成称为胚状体的漂浮凝聚物，其在有血清存在下培养并包括衍生自所有三个胚层的細胞。相反，采用无血清、无饲养細胞的悬浮培养，ES細胞可选择性分化成外胚层。分化干細胞的最成功方案依赖于对控制胚胎发育中細胞正常分化的胞外信号和基因调节因子的了解。诱导分化的信号通常由涉及酶活性，例如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化的酶活性或此类活性的逆转的胞内途径介导。这些酶功能导致调节(转录)因子的表达或活性改变，进而控制細胞的分化状态。由于信号转导途径常由胞外蛋白质配体(生长因子)激活，利用基于此类蛋白质的材料的区域开始引发干細胞分化。神经干細胞(NSC)是设计和发现神经变性疾病(例如，帕金森病、亨廷顿病和阿尔茨海默病)的新方法的有力研究工具。NSC的自我更新能力和多能性使得它们极具吸引力作为治疗神经学疾病的疗法和科研实验室的有力工具。该项研究中利用ReNcell VM細胞。 该细胞系是永生化的干細胞系。生长因子的存在阻止了細胞的分化，这种细胞缺乏神经元表型。相反，除去生长因子后，如预计那样发生分化(图5和图6)。可利用形态学标志物检测神经元，但随着电压门控通道的产生伴有电生理学成熟作用，从而产生动作电位。分化后，免疫細胞化学标志物鉴定到中脑衍生的細胞系分化成多巴胺能神经元。在未分化状态中，ReNcell VM是巢蛋白阳性，静息膜电位约为_60mV，但不显示任何电压激活的电导。分化后，根据免疫组织学特征ReNcell VM形成神经元、星形細胞和少突胶质細胞。这些分化的細胞是电生理学功能性神经元，显示是多巴胺能神经元。功能检验很重要，因为神经元标志物的免疫学表征显示其不一定反映功能性。Piper等.(Piper，D. R等.，免疫細胞化学和生理学表征培养的人神经前体群 (Immunocytochemical and physiological characterization οι a population οι cultured human neural precursors). J. Neurophysiol. 2000，84，534-548) i正阴月台 JLttj 生NSC分化成具有各种配体和电压门控通道的神经元。然而，它们不是完全功能性的，因为电压依赖性钠通道的密度不足以产生动作电位。另ー项研究利用人胎儿脑组织培养物发现类似的結果。在不含血清的条件下，胚胎干細胞分化成含酪氨酸羟化酶(TH)的細胞， 它们显示释放多巴胺并具有一定的神经元电学特性，但仍未记录到动作电位。这些細胞显示在6-羟基多巴胺损伤的大鼠脑中体内存活。谷氨酸能(Glutamaterigic)和GABA 能(GABAergic)神经元还可以在确定的条件下从人胎儿前脑分化。这些研究明确证明配体门控应答，但未讨论激发动作电位的能力。相反，Perrier等(Perrier，A, L等.，从人胚胎干细胞衍生中脑多巴胺神经元(Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells). Proc Natl Acad Sci U S A 2004，101，12543—12548)利用饲养层共培养介导胚胎干细胞变成能激发动作电位的多巴胺能神经元。另ー成功的方法由mi等.(Wu，P等.，从植入成年大鼠的胎儿人神经干細胞区域特异性产生胆碱能神经元 (Region specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat) · Nat Neurosci 2002，5，1271—1278)开发，其中用成纤维细胞生长因子、肝素和层粘连蛋白的混合物预处理胎儿hNSC，然后进行数天分化产生可靠激发动作电位的胆碱能神经元。因此，关于从人胚胎干細胞或胎儿衍生干细胞获得完全功能性神经元的报道甚少。此外，利用许多胎儿衍生hNSC的进ー步限制是它们在培养时的死亡卓。由于细胞分化对于诸如培养基、生长因子和表面涂层等培养条件敏感，得到的重编程細胞可极为不同，例如阶段不同、谱系不同。因此，开发非侵入性細胞概况分析方法以表征干細胞和干細胞样细胞的重编程阶段和谱系。如图8所示，本发明包括用生物传感器在細胞重编程期间的多个检测点，包括成熟阶段进行細胞概况分析。结果显示，ReNcell细胞在组织培养处理或层粘连蛋白包被的生物传感器表面产生不同附着行为。在层粘连蛋白包被的表面上，細胞倾向于停滞在扩散期(即，在初始沉积和扩散相之间有等待期(约15 分钟))，而在组织培养处理表面，等待期非常短(<2分钟)(图8A)。不同成熟細胞(例如，衍生自干細胞的心脏细胞、血細胞、脑细胞、胰腺細胞或皮肤細胞)的此类表面依赖性精细特征可能更明显。多巴胺是存在于哺乳动物脑中的主要邻苯ニ酚胺神经递质，其在脑中负责各种功能，包括运动、神经内分泌分泌、认知和情緒。多巴胺还在外周系统中起作用，其在外周系统中调节血管张力、肾脏功能、心血管功能、激素分泌、邻苯ニ酚胺释放和胃肠蠕动。根据预测的跨膜拓扑学特性和功能及药理学特性，多巴胺受体分成5个多巴胺受体亚型，还可分成两类Dl-样(Dl和D5)和D2-样(D1、D3和D4)受体。多巴胺传递失调导致各种病症，例如帕金森病、图雷特综合征、精神分裂症和高催乳素血症。因此，多巴胺用作探査干細胞分化中多巴胺能神经元谱系的标志物。多巴胺DMR信号是细胞阶段依赖性的(图8B到D)。对于ReNcell細胞，附着于生物传感器表面后3小吋，多巴胺触发小但重现的DMR信号，表明 ReNcell祖细胞中存在内源性多巴胺受体(可能是D2受体)(图8B)。细胞维持在富含生长因子的培养基中4天吋，多巴胺触发不同的DMR信号(图8C)，经证实是内源性D2受体激活所致(数据未显示)。然而，分化和成熟后10天，分化的细胞对多巴胺起反应的DMR信号不同，内源性Dl受体有额外贡献(图8D和7)。这些结果表明功能Dl受体及其光学生物传感器应答可用作干細胞分化的神经元谱系的标志物。然而，由于多巴胺受体还在许多不同类型的細胞中表达，包括非神经元細胞，单用多巴胺或其它选择性Dl受体激动剂不足以作为干細胞分化的神经元谱系的确认标志物。 因此，可利用标志物组作此类測定。结果总结在图9-12中。这些标志物包括内源性G蛋白-偶联受体、酶、激酶的激动剂，等等。图9总结的结果显示了分化ReN細胞的特异性的标志物組，包括毒蕈碱受体激动剂乙酰胆碱、腺苷受体激动剂腺苷、P2Y受体激动剂ATP、亲代谢性谷氨酸盐受体激动剂精胺、阿片类物质受体激动剂强啡肽A、内皮縮血管肽受体激动剂内皮縮血管肽1、GPR7和8激动剂神经肽B-23 (NPB-23)、食欲素受体激动剂食欲素A、蛋SFLLR-酰胺、P2Y激动剂UDP、NPY受体激动剂神经肽Y和VIP受体激动剂血管活性肠肽。可利用这些标志物或它们相当的激动剂的任何组合测定重编程神经元細胞的阶段和质量。图10显示了未分化和分化ReN細胞的非特异性的标志物組，包括P2Y激动剂ADP、 多巴胺受体激动剂多巴胺、GABA受体激动剂GABA、阿皮林受体激动剂阿皮林、MCH受体激动剂α-黑素細胞-刺激激素和PAF受体激动剂血小板生长因子。这些激动剂可用作标志物组来产生分子DMR指数，这些指数进而可用于显示細胞及其重编程细胞之间的差异。图11显示了未分化細胞的特异性的标志物組，包括ATII受体血管紧张素II、GLP 受体激动剂高血糖素样肽、LPA受体激动剂溶血磷脂酸、NTS受体激动剂神经牵张素、NKA受体激动剂P物质、痕量胺受体激动剂酪胺、P2Y激动剂UTP和UTII受体激动剂硬骨鱼紧张肽II。这些标志物还可用于测定重编程神经元细胞的阶段和质量。图12显示的标志物组可用于测定通常是任何細胞重编程的ReN細胞的神经元分化期间改变的可能途径。这些标志物包括EPAC激活剂8-CPT-2-Me-cAMP、腺苷酸环化酶激活剂毛喉素、Galpha蛋白激活剂MAS-7、Pi;3K激活剂740Y-P、胰岛素受体激活剂L783281和非选择性PKC激活剂佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)。參考文献1. Trantham-Davinson H ^ . The Journal of Neuroscience,2004-24 (47) 10652-106592. Donato R 等· BMC Neuroscience, 2007,8 :363. Rashid AJ 等· PNAS，2OO7, Vol :104, N2 :654-6594. US2008887809A Fang, Y. ,Ferrie,A. Μ. ,Fontaine, N. Μ. ,Yuen, P. K.禾ロ Lahiri， J. “光学生物传感器和细胞(Optical biosensors and cells)”5. Takahashi 等.，(2007)，Cell，131 :861_872，或6. Yu 等，(2007)，Science，318 1917-1920。
权利要求
1.一种方法，包括a.获得未分化的细胞，b.将所述未分化的细胞附着于无标记生物传感器系统的生物传感器表面上，c.培养所述附着的细胞直至第一检测点，d.获得某标志物的第一检测点一级概况。
2.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，还包括a.培养所述附着的细胞直至第二检测点，b.获得所述标志物的第二检测点一级概况。
3.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，还包括a.培养所述附着的细胞直至第三检测点，b.获得所述细胞的第三检测点一级概况。
4.一种方法，包括a.获得分化的细胞，b.将所述分化的细胞附着于生物传感器表面上，c.培养所述附着的细胞直至第一检测点，d.获得某标志物的第一检测点一级概况，e.获得相应细胞，f.将所述相应细胞附着于生物传感器表面上，g.培养所述相应细胞直至第一检测点，h.获得所述标志物的第一检测点一级概况。
5.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，还包括获得所述生物传感器表面的细胞附着一级概况。
6.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述附着概况在附着后不到10 小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、0. 5小时、0. 2小时或0. 1小时获得。
7.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，还包括对一组生物传感器表面重复步骤a和b和获得该组生物传感器表面中各生物传感器表面的细胞附着概况。
8.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，包括对一组检测点η重复步骤 c和d，产生一组检测点η —级概况。
9.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，还包括温育分子、未知分子、候选药物分子或候选重编程分子与细胞，然后获得某标志物的一级概况。
10.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，还包括在多于一个时间点温育所述分子、所述未知分子、所述候选药物分子或所述候选重编程分子与所述细胞，和获得各时间点的某标志物的一级概况。
11.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，还包括利用一组标志物表征所述细胞和产生各标志物的一组一级概况。
12.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，还包括在多于一个时间点或所述细胞的一组条件下产生各标志物的一级概况。
13.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，还包括产生温育分子、未知分子、候选药物分子或候选重编程分子对于一组标志物中各标志物的二级概况。
14.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，在各检测点产生各标志物的一级概况。
15.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物传感器表面包括层粘连蛋白、组织培养处理的生物传感器表面、纤连蛋白、天然束枪、细胞粘附肽、组织培养处理的。
16.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一检测点在附着后的3 小时或不到、3天或不到、7天或不到、10天或不到，开始分化时，分化期间，或分化成熟后。
17.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二检测点在附着后的3 小时或不到、3天或不到、7天或不到、10天或不到。
18.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述第三检测点在附着后的3 小时或不到、3天或不到、7天或不到、10天或不到。
19.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，细胞信号传导表征包括利用标志物。
20.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述标志物组包括选自以下的一组标志物G蛋白-偶联受体激动剂、受体酪氨酸激酶激动剂、激酶激活剂、酶激活剂、 酶抑制剂和受体激动剂，它们的一级概况用作未分化细胞的重编程细胞的性质和质量的指示剂。
21.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述标志物组包括选自以下的一组标志物G蛋白-偶联受体激动剂、受体酪氨酸激酶激动剂、激酶激活剂、酶激活剂、 酶抑制剂和受体激动剂，它们的一级概况用作未分化细胞、其重编程细胞及其相应细胞中差异的指示剂。
22.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述标志物组包含已知调节剂，其DMR指数用作未分化细胞的重编程细胞的性质和质量的指示剂。
23.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，标志物组包含一组已知调节剂，其DMR指数用作未分化细胞、其重编程细胞和其相应细胞中差异的指示剂。
24.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述标志物组选自乙酰胆碱、腺苷、ATP、精胺、强啡肽A、内皮肽1、神经肽B-23、食欲素A、SFLLR-酰胺、UDP、神经肽、 血管活性肠肽、ADP、多巴胺、GABA、阿皮林、α -黑素细胞_刺激激素、血小板生长因子、血管紧张素II、高血糖素样肽、溶血磷脂酸、神经牵张素、P物质、酪胺、UTP、硬骨鱼紧张肽II、 8-CPT-2-Me-cAMP、毛喉素、MAS-7、740Y-P、L783281 和 PMA。
25.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，对于干细胞或祖干细胞的神经元细胞分化谱系，所述标志物组选自乙酰胆碱、腺苷、ATP、精胺、强啡肽A、内皮肽1、神经肽B-23、食欲素A、SFLLR-酰胺、UDP、神经肽、血管活性肠肽、ADP、多巴胺、GABA、阿皮林、 α -黑素细胞-刺激激素、血小板生长因子、血管紧张素II、高血糖素样肽、溶血磷脂酸、神经牵张素、P物质、酪胺、UTP、硬骨鱼紧张肽II、8-CPT-2-Me-cAMP、毛喉素、MAS_7、740Y_P、 L783281 和 PMA。
26.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，EPAC-PII途径的下调或改变是干细胞或祖干细胞的神经元细胞分化谱系的指示剂。
27.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，PKC途径的下调或改变是干细胞或祖干细胞的神经元细胞分化谱系的指示剂。
28.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，选自Dl受体、NPY受体、食欲素A受体、阿片类物质受体、毒蕈碱受体和P2Y受体的神经元细胞-相关GPCR的功能信号传导是干细胞或祖干细胞的神经元细胞分化谱系的指示剂。
29.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，进行多检测点概况分析。
30.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述多检测点概况分析以不连续方式进行。
31.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述无标记生物传感器是表面等离振子共振系统(SPR)、RWG生物传感器系统、阻抗系统、高分辨率光学生物传感器成像系统、共振镜成像系统、椭圆计成像系统、高频获取生物传感器系统。
32.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述相应细胞包括原代细胞、 永生化细胞系或转化细胞系。
33.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，还包括比较未分化细胞、其重编程细胞及其相应细胞的细胞应答概况。
34.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，还包括依据细胞应答概况鉴定细胞。
35.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，还包括细胞体系，所述细胞体系由衍生自干细胞或祖干细胞的多于一类细胞构成。
36.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，还包括通过生物传感器表面上干细胞或祖干细胞的原位分化获得的细胞体系。
37.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞体系包含多巴胺能神经元、星形细胞和少突胶质细胞。
38.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞体系通过全能或多能干细胞重编程产生。
39.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，产生重编程细胞。
40.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述重编程细胞包括神经细胞。
41.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，还包括温育所述细胞与抗多巴胺抗体。
42.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，还包括温育所述细胞与多巴胺神经元保护剂。
43.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述多巴胺保护剂包括类固
44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述类固醇包括17β-雌
45.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述类固醇雌二醇在增殖阶段引入。
46.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述类固醇雌二醇在分化相引入。
47.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述类固醇雌二醇在分化细胞成熟后引入。
48.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，对细胞重编程为全能干细胞进行监测。
49.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，将分子施加于所述细胞以测定所述分子是否介导所述细胞重编程。
50.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物传感器表面包括多孔板。
51.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述多孔板包括96或384或 1536个孔。
全文摘要
公开了无标记生物传感器和利用这些传感器观察干细胞和分析干细胞及相关细胞的方法。
文档编号G01N33/50GK102549430SQ201080043012
公开日2012年7月4日 申请日期2010年7月27日 优先权日2009年7月31日
发明者F·韦里耶, S·K·派, 方晔 申请人:康宁股份有限公司