重编程t细胞和造血细胞的方法

专利名称：重编程t细胞和造血细胞的方法
重编程T细胞和造血细胞的方法
背景技术：
本申请涉及2009年6月5日提交的美国申请号61/184，546和2009年9月4日提交的美国申请号61/240，116，它们的全部公开内容无所放弃地通过引用方式特别全文并入本文。
1.发明领域本发明大体上涉及分子生物学和干细胞领域。更具体而言，本发明涉及体细胞、尤其是τ细胞和造血细胞的重编程(!^programming)。2.相关技术描述一般而言，干细胞是未分化的细胞，其能够产生成熟的功能性细胞的演替。例如， 造血干细胞可以产生任意的不同类型的末端分化的血液细胞。胚胎干(ES)细胞源自胚胎， 其是多能的，因此具有发育成任意器官或组织类型，或至少潜在地发育成完整胚胎的能力。诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem cell)，通常简称为iPS细胞或 iPSC，是一类人工地从非多能细胞(通常为成年体细胞)衍生而来的多能干细胞。人们相信，在很多方面，诱导的多能干细胞与天然多能干细胞例如胚胎干细胞是相同的，例如在以下方面某些干细胞基因和蛋白的表达、染色质甲基化的式样、加倍时间、类胚体(embryoid body)的形成、畸胎瘤的形成、活嵌合体的形成以及潜能和分化能力，但是其与天然多能干细胞的相关性的完整程度仍待确定。IPS细胞首先于2006年从小鼠细胞中产生(Takahashi等人，2006)，于2007年从人类细胞中产生(Takahashi等人，2007a ;Yu等人，2007)。这在干细胞研究中被认为是重要的进展，因为这可以允许研究人员获得多能干细胞而不必争议性地使用胚胎，多能干细胞在研究中具有重要意义并且具有潜在的治疗性应用。在人类中，iPS细胞通常是从皮肤成纤维细胞产生。然而，对于皮肤生物活组织的需求和在体外扩增成纤维细胞数个传代的需要使其成为用于产生患者特异性干细胞的麻烦的来源。此外，以前的用于重编程人的体细胞的方法是不方便的，因为它们需要从人类受试者直接获得体细胞，或将细胞维持于费力的细胞培养系统中。因此，需要开发用于从替代性来源诱导多能干细胞的简单、方便和易达的方法。在开发本发明时，本发明人考虑到血液样品可以作为来源，因为血液可以从患者或健康个体中收集，储存并转移，例如，从中心单位分配至一个或多个远的地区。然而，据本发明人所知，在本申请之前，没有关于从来自这样的临床可达来源的T细胞产生多能干细胞的报道，这说明对于开发此类技术的显著需求。发明概述本发明克服了本领域中的主要缺点提供了通过重编程而衍生自T细胞和/或造血祖细胞的诱导的多能干细胞。本方法能够从临床可达的τ细胞来源、例如3ml全血样品产生iPS细胞，避免了动员造血细胞的需要。在其它实施方式中，可以从血液样品获得造血细胞，例如人类或哺乳动物⑶34+CD45+CD43+造血前体细胞，并转化为iPS细胞。可以从外周血的血液样品获得造血前体细胞，例如通过富集⑶34+细胞或消除非⑶34+细胞谱系。在一些实施方式中，可以从血液样品、例如冷冻或冷冻保存的血液样品获得⑶34+造血细胞 在获得血液样品之前不动员受试者中的CD34+造血祖细胞而获得。通过这种方式，可以从多种血液样品、包括存在于血库中的外周血样品产生iPS细胞。因此，提供了用于从T细胞和/或造血祖细胞产生诱导的多能干细胞的方法，包括下列步骤(a)获得包含T细胞和/或造血祖细胞的细胞群体；和(b)从所述细胞群体的T 细胞和/或造血祖细胞产生iPS细胞以提供iPS细胞群体。细胞群体的示例性来源可以包括但不限于血液样品、血液成分、骨髓、淋巴结、胎儿肝脏或脐带。细胞群体的来源可以包括血液样品或源自血液样品的细胞，其中所述血液样品获自在获得血液样品之前不外部动员受试者中的造血祖细胞(例如，通过向受试者外部施用造血生长因子)的受试者。细胞群体可以获自冷冻保存的血液样品，或者细胞群体的来源或细胞群体可以经过冷冻保存。在实施例中证明了冷冻保存的血液样品可以用作T细胞的来源以成功地重编程为iPS细胞。本发明的一些方面的具体特点是通过使用小体积的血液样品而实施本发明的一些方面的能力。血液样品的适当的体积可以是大约1至大约5ml，大约1至10ml，大约1至 15ml，或更具体为大约3ml。可以通过外部施用的G-CSF诱导造血干细胞/祖细胞、例如⑶34+细胞，以诱动进入外周血，以在外周血来源中富集。在本发明的一些方面中发现来自未动员的供体的外周血细胞能够实现成功的重编程，因此，无需通过外部施用的生长因子动员骨髓细胞。因此，在具体的方面，细胞群体的来源可以是这样的受试者其细胞未经过一种或多种外部施用的造血生长因子、例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员。如在本文中可相互替换使用的术语“外部的(extrinsic)”或“外部的(external) ”是指从生物体外施用动员剂 (mobilizing agent)，而不是使用已经通过源自生物体内的内在因子在一定程度上被动员了的⑶34+细胞。为了提供适合于重编程的T细胞群体，可以在激活T细胞的条件下在体外制备包含τ细胞的细胞群体，例如在存在抗-CD3抗体的情况下进行，或在体内进行(并因此具有针对特定抗原的特定TCR，例如黑素瘤的癌症抗原，例如GP-100)。这也可以包括使用本领域已知的四聚体、疫苗和/或体外肽刺激。也可以在体外以一种或多种细胞因子(例如 IL-2)培养细胞群体以扩增其中的T细胞群体。T细胞可以是人类T细胞。在具体的方面， T细胞可以是⑶4+，⑶8+T细胞，或其组合。T细胞的非限制性实例包括T辅助I(THl)细胞、 T辅助2 (TH2)细胞、TH17细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞、天然杀伤T细胞、幼稚T细胞、记忆T细胞、γ δ T细胞和任意T细胞。在一些方面，细胞群体包含大约80%至大约99%、大约90%至大约99%、大约 97%至大约99%或任何中间范围的T细胞，这可以对应于至少、大约或至多1χ103，2χ103， 3χ103，4Χ103，5Χ103，6Χ103，7Χ103，8Χ103，9Χ103，ΙΧΙΟ4，2Χ104，3Χ104，4Χ103，5Χ104，6Χ104， 7χ104，8χ104，9χ104，ΙχΙΟ5，2χ105，3χ105，4χ105，5χ105，6χ105，7χ105，8χ105，9χ105，IxlO6, 2χ106Τ细胞或其中任意范围。例如，本发明人证明了在96孔板中以少至大约1-5χ103Τ细胞/孔重编程(图6Α-6Β)。为了提供造血前体细胞的群体，可以在引起CD34+细胞的富集或扩增的条件下制备包含造血细胞的细胞群体。具体地，本发明发现无需动员骨髓细胞以获得足够的用于重编程的CD34+细胞。例如，可以使用磁激活的细胞分选(MACS)或荧光激活的细胞分选 (FACS)来富集CD34+造血细胞；在一些实施方式中，可以使用Indirect CD34MicroBead Kit ^Direct CD34 MicroBead Kit ( ^nJ ^tg Miltenyi Biotec， Bergisch Gladbach, Germany)与MACS从样品、例如外周血样品富集⑶34+造血细胞。本领域已知还有另外的方法用于从外周血获得经动员的⑶34+造血祖细胞，包括Gratwohl等人(2002)描述的方法。但是，在一些优选实施方式中，可以从未暴露于一种或多种造血生长因子的受试者获得 ⑶34+造血前体细胞；因此，⑶34+造血前体细胞可有利地获自未经一种或多种外部施用的生长因子动员的供体的血液样品，包括通常存在于血库中的血液样品。在其它实施方式中， 可以通过消除成熟的造血细胞、例如T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞和/或红细胞而富集样品中的CD34+细胞。对于谱系消除，可以以抗体混合物(例如CD2、 CD3、CDllb、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123、CD235a 中的一项或多项)温育细胞悬浮液，然后其可用于除掉上述谱系阳性细胞(例如Karanu等人，2003)。谱系细胞消除试剂盒 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)也是商业上可获得的，并且可用于此目的。在一些实施方式中，可以使用SCF、Flt3L和/或IL-3细胞因子的组合，使用例如Akkina 等人(1996)描述的方法或 StemPro -34 培养基(可获自 Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)， 扩增并增殖CD34+细胞，然后转化为iPS细胞。本发明人预想到通过本发明描述的方法实质上可以将任意造血祖细胞或⑶34+ 造血细胞重编程为iPS细胞。在一些实施方式中，可以通过本文提供的方法将获自或衍生自外周血样品的造血前体细胞转化为iPS细胞。造血前体细胞可以表达⑶34和⑶45，或 ⑶34，⑶45，和⑶43。在一些情况下，可能需要从干细胞、例如人类胚胎干细胞(hESC)产生造血前体细胞；在这些实施方式中，可以产生在髓样祖细胞中高度富集的⑶34+⑶43+⑶45+ 造血细胞，例如，按照Choi等人(2009)的描述，通过共培养hESC与0P9饲养细胞来进行。 在一些情况下，造血前体细胞对于⑶34可以是阴性的(例如Guo等人，2003)；但预想到这些造血前体细胞可以分化为iPS细胞。为了从细胞群体的T细胞和/或造血祖细胞产生iPS细胞，方法可以包括将一种或多种重编程因子导入T细胞和/或造血祖细胞。在一些方面，重编程因子可以是重编程蛋白，包括Sox家族蛋白和Oct家族蛋白，其中一种或多种或每一种可以可操作地连接于用于细胞进入的蛋白转导结构域。在本发明的另一个实施方式中，重编程因子可以由一个或多个表达盒编码，并且可以包括例如，Sox家族蛋白和Oct家族蛋白。Sox和Oct被认为对于确定ES细胞性质的转录调节层级具有重要意义。例如，Sox可以是Soxl、Sox2、Sox3、Soxl5或 Soxl8，特别是Sox2 ；Oct可以是0ct4。另外的因素可以增强重编程效率，例如Nanog、Lin28、 Klf4.c-Myc.SV40大T抗原或Esrrb ；重编程因子的特定组合可以是包含Sox2、0ct4、Nanog 和任选包含Lin-28的组合；或包含Sox2、0ct4、Klf和任选包含c_Myc的组合。在具体的实施方式中，一个或多个表达盒可以包含一个或多个多顺反子转录单位。多顺反子单元可以包含可操作地连接的编码区的不同组合，例如(i)至少两种重编程基因，例如Sox-0ct、c-Myc-Klf或Nanog-Lin28 ；备选地，(ii)连接于可选择或可筛选标记物的重编程基因。方面(i)可以是优选的，因为本发明人发现使用具有2种重编程因子/ 载体(Sox2和0ct4、cMyc和Klf4、或Nanog和Lin28)而没有任何荧光标志物的双顺反子载体(载体图谱显示于图11A-11C)，而不是使用具有1个重编程因子和1个荧光标志物的 4个单独的双顺反子载体(此类载体的图谱显示于图10)，使用前一种载体的重编程效率显著改善，并且iPS集落较早出现( 第10-14天而非第20-24天)。为了在同一多顺反子转录单位中共表达多个基因，多顺反子转录单位可以包含内部核糖体进入位点(IRES)或编码至少一种蛋白酶切割位点和/或自我切割肽的序列以进行多顺反子转录。例如，自我切割肽是病毒2A肽。在另一个实施方式中，一个或多个表达盒包含于选自下列的重编程载体中病毒载体，游离载体或转位子。更具体而言，载体可以是逆转录病毒载体，例如鼠白血病病毒 (MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、Akv-MLV、SL-3-3-MLV或其它密切相关的病毒。病毒载体还可以是慢病毒载体。在一些方面，转录调节元件可以包含长末端重复区(LTR)以介导病毒基因的整合。在备选方面，载体可以是游离载体，例如基于EBV的载体，或基于转位子的载体。在其它实施方式中，可以通过脂质体转染、核转染、电穿孔、颗粒轰击、磷酸钙、多聚阳离子或多聚阴离子或适合用于将外源元件导入细胞的任何方法导入重编程因子。在另外一些方面，可以基于一个或多个胚胎干细胞特性来选择iPS细胞，例如未分化的形态、胚胎干细胞特异性标志物、粘附性质、多能性、多谱系分化潜力或本领域已知的任何特征。例如，基于未分化的形态来选择子代细胞是特别方便的。胚胎干细胞特异性标志物可以是选自 SSEA-3，SSEA-4, Tra-1-60 或 Tra_l_81，Tra_2_49/6E，GDF3, REXl, FGF4, ESGl, DPPA2，DPPA4和hTERT的一种或多种特异性标志物。可以在重编程之后的多个时间点执行该选择步骤以确保细胞处于多能状态并且不返回至分化状态。就与表面的粘附性质而言，iPS细胞也不同于T细胞和造血祖细胞，该性质也可用于方便的分离方法中。在具体的方面，可以基于基本上不表达导入的外源元件、例如包含于表达盒中的载体遗传元件或报告基因来选择iPS细胞，因为随着细胞变成多能性的，重编程的细胞能够使外源导入的物质沉默。因此，除了形态特征之外，基本上丧失整合性载体遗传元件或报告分子表达例如荧光，是细胞被重编程的指示。例如，可以基于导入的报告分子基因，通过荧光激活的细胞分选(FACS)、CAT测定或发光测定来选择报告分子表达的沉默。外源元件的“基本上丧失”或“基本上不含外源元件”意思是iPS细胞群体的少于1 %，0. 5%，0. 1 %， 0. 05%或任意中间百分率的细胞包含外源元件。iPS细胞群体可以基本上不含整合的、外源的病毒元件。为了 iPS细胞的临床施用，方法还可以包括使iPS细胞分化为分化的细胞，例如， 心肌细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、成纤维细胞、胰腺细胞、肝细胞或上皮细胞。在另一个方面，可以公开从如上文所述的iPS细胞群体分化而来的分化的细胞、组织或器官。组织可以包括神经、骨、肠、上皮、肌肉、软骨或心脏组织；器官可以包括脑、脊髓、心脏、肝、肾、胃、 肠或胰腺。在一些方面，分化的细胞、组织或器官可用于组织移植、药物筛选或发育研究以替代胚胎干细胞。在另一个方面，也可以公开根据如上所述的方法产生的诱导的多能干细胞。还可以提供诱导的多能干细胞，其包含含有τ细胞受体基因的V、D和J区段的不完整组的基因组(相对于胚胎干细胞，其可以是人类细胞)。在具体的方面，诱导的多能干细胞可以基本上不含整合的、外源病毒元件。
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本发明的方法和/或组合物的上下文中所讨论的实施方式可以就本文描述的任何其它方法或组合物来应用。因此，涉及一种方法或组合物的实施方式也可以应用于本发明的其它方法和组合物。提及核酸时，如本文使用的术语“编码(encode)”或“编码(encoding) ”用于使本发明易于被技术人员所理解，但是这些术语可以分别与“包含(comprise)”或“包含 (comprising)，，相互替换地使用。如本文说明书中使用的“一种(a)”或“一种(an)”可以指一个或多个。如本文权利要求中所使用，当与词语“包含”一起使用时，词语“一种(a)”或“一种(an)”可以指一个或多个。除非明确指明仅指替代物或者替代物是相互排斥的，否则权利要求中使用的术语 “或”可用于指“和/或”，虽然本公开内容支持仅指替代物和“和/或”的定义。如本文使用的“另一个”可以指至少第二个或更多个。在本申请全文中，术语“大约”用于表示某数值包括用于测定该数值的设备、方法的误差的内在差异，或者存在于研究受试者之间的差异。本发明的其它内容、特征和优势将通过以下详细描述变得明显。但是应该理解，虽然详细描述和具体实施例指明了本发明的优选实施方式，但是仅是为了解释目的而提供， 因为本发明精神和范围内的多种改变和修饰对于阅读了该详细描述的本领域技术人员将是明显的。


以下附图构成本说明书的一部分，包括这些附图是为了进一步说明本发明的某些方面。通过参考一个或多个这些附图并联合本文提供的具体实施方式
的详细描述将更好地理解本发明。图1 :T-细胞重编程过程的概览，开始于激活的T细胞，并产生具有hESC样形态的 iPSC集落。在Olympus 1X71显微镜下分别以10倍和20倍物镜获得T细胞和iPSC集落图像。图2A-2C 来自人T细胞的诱导的多能干细胞的衍生和表征。图2A 输入细胞的 CD3表面表达的流式细胞术分析。(i)来自代表性供体的PBMC群体的第-3天非激活的PBMC 和第0天激活的T细胞上的CD3表面表达。(ii)对代表性供体中的转导后72小时的转导细胞群体(GFP+)设门的⑶3表达，以显示⑶3+细胞的优先转导。(iii) 10个供体真空采血管产生的样品的平均的上述度量(i-ii)的直方图。图2B:代表性的白细胞去除术(“TiPS L-2”)和Vacutainer ( "Tips ν-ι”)衍生的 TiPS 系中的 hESC 多能性标记物 0CT4、 Tra-l-81、SSEA-3和SSEA-4的流式细胞术分析。图2C:使用靶向TCR^基因座的V-J区内的保守区的多重PCR引物，分析T细胞受体(TCR) β链重排。多克隆的起始T细胞群体由电泳图谱上的正确片段大小范围内的扩增子峰的钟形曲线表示。成纤维细胞(非T细胞) iPS细胞("Fib-iPS")在TCRi3基因座上缺少种系重排，并作为阴性对照。克隆衍生的 TiPS系(来自2个白细胞去除术系和ι个Vacutainer 系的代表性数据，分别是"TiPS L-l，，，“TiPS L-2，，;和“TiPS ν-2，，)显示出确定大小的一个特征峰。DNA片段分析是在ABI 3730DNA分析仪上进行的。
图3A-3D 来自人T细胞的诱导的多能干细胞的表征。图3A 就hES细胞标志物基因 DNMT38，LEFTB, NODAL, REXl，ESGl，TERT, GDF3 和 UTFl 的表达，通过 RT-PCR 分析来自白细胞去除术(“Tips L-I 和 L-2”)和Vacutainer ( "Tips v-2”)的代表性的 TiPS 细胞系。GAPDH用作每个样品的阳性上样对照。图3B 通过PCR分析基因组DNA确认转基因的整合。使用针对目标重编程基因(“RG”)的正向引物和针对IRES的反向引物。0CT4正向和反向引物用作PCR反应阳性对照，如载体图谱所示。图3C:TiPS细胞系的RT-PCR分析显示了外源转基因的沉默，GAPDH作为每个样品的阳性对照。hESC系Hl和成纤维细胞衍生的iPSC系(Fib-iPS)作为阳性细胞对照，激活的供体的T细胞作为阴性细胞对照。图3D TiPS克隆表达人胚胎干细胞特异性多能标志物，如流式细胞术分析所示。图4A-4E :TiPS细胞系的体内和体外分化潜力。图4A 畸胎瘤的形成显示了体内分化潜力。注射进入SCID/beige小鼠的TiPS细胞在5-12周时形成畸胎瘤。苏木精和伊红染色显示了与从三个原始胚层的衍生一致的组织，包括具有杯状细胞的简单上皮，其表示胃肠或呼吸组织(内胚层)、软骨(中胚层)和视网膜色素上皮(外胚层)。使用Olympus 1X71显微镜，使用40倍物镜获得来自TiPS L-2细胞系的代表性图像。图4B 体外分化为神经元。将TiPS L-2细胞诱导为神经元分化，作为聚集体，然后使用Alexa Fluor 594 二抗就神经元标志物β III-微管蛋白进行染色；以Hoechst对比染色细胞核。使用20倍物镜获得图像。调节对比度，使用Image J软件合并图像。图4C 通过细胞聚集方法进行TiPS 细胞的心脏诱导。细胞聚集体在第14-15天含有跳动的心脏肌钙蛋白T(cTNT)阳性的心肌细胞。显示了来自代表性样品的流式细胞术数据。使用10倍物镜获得图像。图4D 体外分化为造血祖细胞。通过无血清类胚体(EB)分化程序，在两个TiPS系中分化12天而产生的造血祖细胞(HPC)，与hESC系(Hl)和成纤维细胞衍生的iPSC系(Fib-iPS)进行对比。通过流失细胞术，通过将EB分离为单个细胞并以荧光团缀合的针对⑶34，⑶45，⑶43，⑶31， ⑶41和⑶235a的单克隆抗体进行染色来定量HPC。图4E 通过将EB分化和个体化的细胞置于无血清的MethoCult培养基而进行造血克隆形成性(CFU)检验，所述培养基中含有细胞因子SCF，G-CSF, GM-CSF, IL_3，IL-6和EP0。温育14天之后，根据形态学标准将集落测评为红细胞(CFU-E/BFU-E)、巨噬细胞(CFU-M，数据未显示)、粒细胞(CFU-G，数据未显示)、 粒细胞_巨噬细胞(CFU-GM)和粒细胞-红细胞-巨噬细胞_巨核细胞(CFU-GE^)。也标示出了总CFU计数(CFU)。使用Olympus CKX41显微镜以2倍物镜获取图像。图5 :iPSC克隆追踪。从畸胎瘤样品分离基因组DNA并与它们的亲代细胞系就 TCR^链的重排进行比较。显示了来自细胞系TiPSV-I的代表性数据。衍生的畸胎瘤具有亲代细胞系的克隆性重排。使用靶向TCRP基因座的V-J区内的保守区的多重引物进行 PCR分析。在ABI 3730DNA分析仪上进行DNA片段分析。背景彡1000RFU。图6A-6B 以96-细胞形式重编程T细胞。图6A 以双顺反子载体S0(Sox2和0ct4) 和CK(c-Myc和Klf4)感染供体A的T细胞并铺板于MEF。进行活细胞抗-Tral_60标记以检测iPS细胞集落。图6B 以双顺反子载体S0(Sox2和0ct4)和NL (Nanog和Lin28)感染供体A的T细胞并铺板于MEF。进行活细胞抗-Tral-60标记以检测iPS细胞集落。输入细胞数显示为“输入数目(Input#)，，以表示起始材料中的T细胞数。图7 =DNA指纹分析。在所分析的8个STR基因座上检测的所有15个等位基因多态性而言，短串联重复(STR)分析显示TiPS细胞系与亲代的激活的T细胞是相同的。显示了来自2个TiPS系(TiPS L-I和TiPS L-2)的代表性数据。图8 碱性磷酸酶(AP)染色。TiPS系TiPS L-I和TiPS L-2是AP阳性的。在HP Scanjet G3110计算机扫描仪上获取图像。图9 :TiPS细胞系显示出正常核型。TiPS细胞系“TiPS L-1”和“TiPS L-2”在MEF 上生长6个传代，系“TiPS V-1”和“TiPS V-2”分别在Matrigel上生长总共18个传代中的8个传代，总共34个传代中的30个传代。使细胞进行G显带分析，没用检测到克隆性异
堂
巾ο图10.用于重编程实验的MMLV逆转录病毒构建体的载体图谱。“RG”表示重编程基因。图11A-11C 用于重编程实验(具有改善的重编程)的双顺反子MMLV逆转录病毒构建体的载体图谱。图1IA :MMLV-0ct4-IRES-Sox2的载体图谱(简写为 “0ct4-Sox2”)。图 IlB 匪LV-cMyc-IRES-Klf4 的载体图谱(简写为 “cMyc_Klf4”)。图 IlC :MMLV-Nanog-IRES-Lin28 的载体图谱(简写为 “Nanog_Lin28，，)。
具体实施例方式1.绪论通过病毒转移确定的因子例如S0X2，0CT4，NANOG和LIN28或S0X2，0CT4，c-Myc和 KLF4，在体外重编程体细胞为未分化的多能状态(Yu等人，2007 ；Takahashi等人，2007b)， 已经开启了使用多种细胞类型产生患者特异性人iPSC的方式(Loh等人，2009 ；Aasen等人，2008)。通过短暂表达基因或通过使用适当转录因子的蛋白质转导，通过衍生iPSC，进一步发展了该想法。到目前为止，人类中的主要的iPSC研究着眼于以成纤维细胞作为细胞来源。虽然成纤维细胞由于其商业可获得性和基因递送的容易性而提供了作为起始材料的数种优点，但它们对于大规模临床衍生iPSC系是亚最佳的，这是因为需要侵入性皮肤活组织检查，并且难以从原代组织建立稳定的系。未动员的外周血可能是用于重编程的理想细胞来源，因为容易获得患者样品(Maherali and Hochedlinger，2008)。另外，在世界范围内的生物贮库中储存了来自活的和死亡的供体的大量的冷冻的血液样品(Kleeberger等人， 1999)。本发明通过从T细胞和/或造血前体细胞产生诱导的多能干细胞而克服了与目前的重编程技术相关的数个主要问题。如本发明所发现可以从Iml全血的等量物获得更丰富的和易处理的血液细胞来源以从T淋巴细胞衍生iPSC。这些T细胞衍生的iPSC(“TiPS”) 与hESC以及成纤维细胞衍生的iPSC系具有共同的基本特征。另外，它们保留它们的特征性T细胞受体(TCR)基因重排，该性质可用于例如，作为遗传追踪标志物或用于再分化实验以研究人类T细胞发育。在本发明之前，本发明人对于重编程T细胞或造血祖细胞的成功的可能性是非常不确定的，有数个原因首先，不确定血液样品中的T细胞和/或造血前体细胞是否以足以进行重编程的量存在。第二，尚未研究过由τ细胞受体基因的V(D) J重组造成基因丧失在重编程中的可能的效应。第三，目前已经被重编程的多数细胞类型是粘附性细胞。T细胞是非粘附性的，并且以悬浮方式培养。直至本发明，尚不清楚进行重编程的T细胞可以转变为适合于粘附性iPS细胞的粘附培养条件。因此，本发明的方法是首次从T细胞或造血前体细胞产生iPS细胞。T细胞可以容易地从多种来源获得，例如小体积的血液样品。类似的， 造血前体细胞例如“⑶34+/⑶43+/⑶45+/⑶38-，，或“⑶34—，⑶133+/⑶38—，，造血前体细胞可以从外周血样品富集。本发明的特别的优点在于T细胞受体的重排的和减少的V、D、J基因区段，其可以在重编程的子代细胞中保留。这作为T细胞衍生的iPS细胞的不同克隆群体的特定特征或 “条形码”，也可以辅助那些未经历V(D)J重组的来自多能干细胞的iPS细胞的分化。另外， T细胞与iPS细胞之间的粘附性质的差异带来了自动化分离上的优势。类似的，造血前体细胞与iPS细胞之间的粘附性质的差异可用于分离。通过将重编程的T细胞或造血祖细胞转移到适合于粘附的培养条件，例如将经辐射的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)置于T细胞的培养容器的底部，衍生自T细胞或造血祖细胞的iPS细胞可以粘附至底部，而T细胞和/或造血祖细胞保留在悬浮液中。以下描述了本发明的进一步的实施方式和优点。II.定义“重编程”是这样的方法相对于没有进行重编程的相同条件，其赋予细胞可测的增加的形成至少一种新细胞类型的能力的子代(无论是在培养物中还是在体内)的能力。 更具体而言，重编程是赋予体细胞多能潜力的方法。意思是，在足够的增殖之后，可测比例的子代具有新细胞类型的表型特征(如果在重编程之前基本上没有此类子代能够形成)； 或者，具有新细胞类型的特征的比例比重编程之前是可测的增加。在某些条件下，具有新细胞类型的特征的子代比例可以是至少大约1%、5%、25%或更高，按次序以渐增为优选。T细胞的“激活剂”或激活T细胞的条件是指激活T细胞的刺激物，并且包括抗原，其可以呈递于抗原呈递细胞上或其它的表面；多克隆激活剂，其结合很多T细胞受体 (TCR)复合物而与特异性无关，并包括凝集素，例如伴刀豆球蛋白-A(Con-A)和植物凝集素 (PHA)以及试剂，例如特异性结合TCR或CD3蛋白上的不变的框架表位的抗体；和超抗原 (superantigen)，其刺激大量的T细胞，并且包括例如，肠毒素，例如葡萄球菌肠毒素。术语“T淋巴细胞”和“T细胞”相互替换地使用，是指表达T细胞抗原受体(TCR) 的细胞，所述受体当与一种或多种MHC分子或一种或多种非经典的MHC分子一起显示于抗原呈递细胞表面或基质上时，能够识别抗原。“⑶4+T细胞”是指在其表面表达⑶4并且与细胞介导的免疫应答相关的T细胞子集。它们的特征在于刺激之后的分泌谱，其可以包括分泌细胞因子，例如IFN-γ、TNF-α、 IL-2、IL-4和IL-10。“⑶4”是55kD的糖蛋白，其最初定义为T淋巴细胞上的分化抗原，但也存在于其它细胞上，包括单核细胞/巨噬细胞。CD4抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，并且被指是II类MHC(主要组织相容性复合体)限制性免疫应答中的联合识别元件。在 T淋巴细胞上，它们定义了辅助/诱导子集。“⑶8+T细胞”是指在其表面表达⑶8的T细胞子集，是I类MHC限制性的，并作为细胞毒性T细胞发挥作用。“CD8”分子是存在于胸腺细胞和细胞毒性和抑制性T淋巴细胞上的分化抗原。CD8抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，并且是I类主要组织相容性复合体限制性相互作用中的联合识别元件。“造血祖细胞”或“造血前体细胞”是指定向于造血谱系但能够进一步造血分化的细胞，其包括造血干细胞、多潜能造血干细胞(成血细胞)、髓样祖细胞、巨核细胞祖细胞、 红细胞祖细胞和淋巴样祖细胞。造血干细胞(HSC)是多潜能干细胞，其产生所有的血液细胞类型，包括髓样(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性细胞、嗜曙红细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴样谱系(T细胞、B细胞、NK细胞)。造血祖细胞可以表达⑶34。造血祖细胞可以共表达⑶133并且对于⑶38之表达是阴性的。在一些实施方式中，某些人类造血细胞可以不表达⑶34，但这些细胞也可以通过本文公开的方法转化为iPS细胞。造血前体细胞包括⑶34+/⑶45+造血前体细胞和⑶34+/⑶45+/⑶43+造血前体细胞。⑶347⑶43+/⑶45+造血前体细胞可以就髓样前体细胞高度富集。造血细胞的多个谱系，例如⑶347⑶43+/⑶45+造血前体细胞，可以通过本文公开的方法转化为iPS细胞。 造血细胞可以包括原始造血细胞的多个子集，包括⑶347⑶133+/⑶38_(原始造血前体细胞)、CD43 (+) CD235a (+) CD4Ia (+/-)(红细胞-巨核细胞生成性的)、1 in (-) CD34 (+) CD43 (+) CD45 (_)(多潜能)，以及 Iin (-) CD34 (+) CD43 (+) CD45 (+)(偏髓样的)细胞、CD133+/ ALDH+(醛脱氢酶)(例如Hess等人2004 ；Christ等人，2007)。预想到可以按照本文的描述将任意这些原始造血细胞类型或造血前体细胞转化为iPS细胞。“载体”或“构建体”(有时称作基因递送或基因转移“介质”)是指大分子或分子复合物，其包含要被递送(体外或体内)进入宿主细胞的多核苷酸。载体可以是线性或环形分子。“质粒”是通常类型的载体，是分离自染色体DNA的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA而复制。在一些情况下，其是环形的和双链的。“表达构建体”或“表达盒”意思是能够指导转录的核酸分子。表达构建体至少包括启动子或功能上等同于启动子的结构。还可以包括另外的元件，例如增强子和/或转录终止信号。当用于与细胞或生物体中的蛋白、基因、核酸或多核苷酸相关时，术语“外源的”是指通过人工或天然方法被导入该细胞或生物体中的蛋白、基因、核酸或多核苷酸；或者，当用于与细胞相关时，是指通过人工或天然方法被分离然后被导入其它细胞或导入生物体的细胞。外源核酸可以来自不同的生物体或细胞，或者其可以是天然存在于生物体或细胞中的核酸的一个或多个另外的拷贝。外源细胞可以来自不同的生物体，或者其可以来自相同的生物体。通过非限制性举例来讲，外源核酸位于与天然细胞中的染色体位置不同的染色体位置上，或者其两侧是不同于天然状态下的核酸序列。术语“对应于”在本文中用于意指多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的全部或一部分是同源的(即相同的，非严格进化相关)；或，多肽序列与参考多肽序列是相同的。与此对比，术语“互补于”在本文中用于意指互补性序列与参考多核苷酸序列的全部或一部分是同源的。举例解释核苷酸序列"TATAC"对应于参考序列"TATAC"并且互补于参考序列"GTATA ”。“编码”特定蛋白的“基因”、“多核苷酸”、“编码区”、“序列”、“区段”、“片段”或“转
基因”是指在体外或体内时，当被置于合适的调节序列控制下时，转录并任选也被翻译成基因产物例如多肽的核酸分子。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA 形式存在时，核酸分子可以是单链的(即正义链)或双链的。编码区的边界由5’(氨基) 末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子来确定。基因可以包括但不限于， 来自原核或真核mRNA的cDNA，来自原核或真核DNA的基因组DNA序列，以及合成的DNA序列。转录终止序列通常位于基因序列的3’端。
术语“细胞”在本文中以其在本领域中最宽的含义使用，是指作为多细胞生物体的组织的结构单元的活体，其由膜结构环绕，所述膜结构将其与外界隔离，其具有自我复制的能力，并且具有遗传信息和用于表达它的机制。如本文使用的“细胞”可以是天然存在的细胞或人工修饰的细胞(例如，融合细胞、遗传修饰的细胞等)。如本文使用的术语“干细胞”是指能够自我复制和具有多能性的细胞。通常而言， 干细胞能够使受损的组织再生。本文的干细胞可以是但不限于，胚胎干(ES)细胞或组织干细胞(也称作组织特异性干细胞，或成体干细胞)。任何具有上述能力的人工产生的细胞 (例如本文使用的融合细胞、重编程细胞等)都可以是干细胞。“胚胎干(ES)细胞”是源自早期胚胎的多能干细胞。ES细胞首先于1981年建立， 从1989年开始，其也被用于产生敲除小鼠。在1998年建立了人ES细胞，目前正开始应用于再生医学。与ES细胞不同，组织干细胞具有有限的分化潜力。组织干细胞存在于组织中的特定位置，并且具有未分化的细胞内结构。因此，组织干细胞的多能性通常较低。组织干细胞具有较高的核质比并且具有极少的细胞内细胞器。多数组织干细胞具有低的多能性、长的细胞周期和超出个体寿命的增殖能力。基于细胞所来源的位点例如皮肤系统、消化系统、骨髓系统、神经系统等，组织干细胞被分成多个类别。皮肤系统中的组织干细胞包括表皮干细胞、毛囊干细胞等。消化系统中的组织干细胞包括胰腺(普通)干细胞、肝脏干细胞等。骨髓系统中的组织干细胞包括造血干细胞、间质干细胞等。神经系统中的组织干细胞包括神经干细胞、视网膜干细胞等。“诱导的多能干细胞”通常简写为iPS细胞或iPSC，是指通过导入被称作重编程因子的某些因子以人工方式从非多能细胞制备的一类多能干细胞，所述非多能细胞通常是成年体细胞或末端分化的细胞，例如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等。“多能性”是指干细胞具有分化成构成一种或多种组织或器官或特别是三个胚层中的任一个的所有细胞的潜力内胚层(胃内层、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、 泌尿生殖器)或外胚层(表皮组织和神经系统)。如本文使用的“多能干细胞”是指能够分化成源自三个胚层中的任一个的细胞的细胞，例如，全能细胞或诱导的多能细胞的直接后代。就核酸分子而言的“可操作地连接”意指按照允许核酸分子转录的方式连接的两个或更多个核酸分子(例如待转录的核酸分子、启动子和增强子元件)。就肽和/或多肽分子而言，“可操作地连接”意指按照产生单一多肽链、即融合多肽(其具有融合物的每个肽和/或多肽成分的至少一个性质)的方式连接的两个或更多个肽和/或多肽分子。特别地，融合多肽是嵌合的，即，由异源分子组成。“同源性”是指两个多核苷酸或两个多肽之间的同一性百分率。一个序列与另一个之间的对应性可以通过本领域已知的技术来确定。例如，同源性可以这样确定通过比对序列信息并使用容易获得的计算机程序而直接比较两个多肽分子之间的序列信息。备选地， 同源性可以这样确定在同源区形成稳定双链体的条件下使多核苷酸杂交，然后以单链特异性核酸酶消化，并测定消化片段的大小。当使用如上所述的方法测定，至少大约80%、特别是至少大约90%、最特别是至少大约95%的核苷酸或氨基酸各自在确定长度的分子上匹配时，两个DNA或两个多肽序列彼此是“实质上同源的”。
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III.干细胞的一般背景在本发明的一些实施方式中，公开了通过将重编程因子导入体细胞中而重编程体细胞、尤其是T细胞的方法。这些细胞的子代可以在如下所述的多个方面与胚胎干细胞相同，但基本上不含外源遗传元件。理解胚胎干细胞的特征可以辅助选择诱导的多能干细胞。 从干细胞重编程研究中获知的重编程因子可用于这些新方法。还考虑到这些诱导的多能干细胞可以潜在地用于替换胚胎干细胞以用于治疗性和研究性应用，因为使用后者具有伦理方面的阻碍。A.干细胞多数情况下(如果不是全部)干细胞是发现于多细胞生物体中的细胞。其特征在于通过有丝细胞分裂进行自我更新的能力以及分化为多种特化细胞类型的能力。两种主要类型的哺乳动物干细胞是发现于胚泡的胚胎干细胞，和发现于成体组织中的成年干细胞。 在发育中的胚胎中，干细胞能够分化成所有的特化胚胎组织。在成年生物体中，干细胞和祖细胞作为身体的修复系统，补充特化细胞，但也维持再生器官例如血液、皮肤或肠组织的正常周转。由于干细胞可以通过细胞培养而生长并转化为具有与多种组织例如肌肉或神经的细胞一致的特征性特化细胞，所以已经建议其用于医学治疗。尤其是，通过治疗性克隆产生的胚胎细胞系、自体同源胚胎干细胞，以及来自脐带血或骨髓的高度可塑性的成年干细胞被认为是有前景的候选物。最近，成年细胞重编程为诱导的多能干细胞已经具有替代胚胎干细胞的巨大潜力。B.胚胎干细胞胚胎干细胞系(ES细胞系)是源自胚泡或更早的桑葚胚时期的胚胎的内细胞群 (ICM)的外胚层组织的细胞培养物。胚泡是早期胚胎——在人类中是大约4至5天，由 50-150个细胞组成。ES细胞是多能的，在发育过程中产生三个主要胚层外胚层、内胚层和中胚层的所有衍生物。换言之，当给予特定细胞类型的足够和必需的刺激时，它们可以发育为成体的200种以上的细胞类型中的每一种。它们对胚胎外的膜或胎盘没有贡献。到目前为止，几乎所有的研究都是使用小鼠胚胎干细胞(mES)或人类胚胎干细胞 (hES)进行的。二者都具有实质性的干细胞特征，但是它们需要差异极大的环境以维持未分化状态。小鼠ES细胞可以生长于明胶层上，并且需要白血病抑制因子(LIF)的存在。人 ES细胞可以生长于小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上，通常需要碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)的存在。如果没有最佳培养条件或遗传操作(Chambers等人，2003)，胚胎干细胞将迅速分化。人类胚胎干细胞还可以根据数种转录因子和细胞表面蛋白的存在来确定。转录因子0ct4、Nanog和Sox2构成核心调节网络，其确保引起分化的基因的阻抑和多能性的维持 (Boyer等人，2005)。最常使用的鉴定hES细胞的细胞表面抗原包括糖脂SSEA3和SSEA4以及硫酸角质素抗原Tra-1-60和Tra-l_81。经过20年的研究之后，没有经批准的使用胚胎干细胞的治疗或人类试验。ES细胞是多能细胞，其需要特定的信号以进行正确的分化——如果直接注入体内，ES细胞将分化成很多不同类型的细胞，引起畸胎瘤。使ES细胞分化为可用的细胞并避免移植排斥仅仅是胚胎干细胞研究仍然面临的障碍中的一小部分。很多国家目前禁止ES细胞的研究或新的ES细胞系的产生。由于胚胎干细胞具有无限扩增和多能性的组合能力，胚胎干细胞仍然是损伤或疾病之后的再生医学和组织替换的理论潜在来源。比较而言，解决这些问题的一种方案是通过直接重编程在体细胞中诱导多能状态。IV.重编程因子用于诱导的重编程因子对于iPS细胞的产生具有关键意义。以下因子或其组合可用于本发明公开的方法中。在一些方面，重编程载体中将包括编码Sox和Oct (特别是 0ct3/4)的核酸。例如，一个或多个重编程载体可以包含编码Sox2、0ct4、Nanog和任选 Lin28的表达盒，或编码Sox2、0ct4、Klf4和任选c_Myc的表达盒，或编码Sox2、0ct4和任选 Esrrb 的表达盒，或编码 Sox2、0ct4、Nanog、Lin_28、Klf4、c-Myc 和任选 SV40 大的 T 抗原的表达盒。编码这些重编程因子的核酸可以包含在同一表达盒中、不同表达盒中、同一重编程载体中，或不同重编程载体中。0ct4和Sox基因家族的一些成员(Soxl、Sox2、Sox3和Soxl5)已经被鉴定为参与诱导过程的关键性转录调节子，其缺失会使诱导不能进行。另一方面，另外的基因，包括Klf 家族的一些成员(Klfl、Klf2、Klf4*Klf5)、Myc 家族的一些成员(c_Myc、L-Myc 和 N-Myc)、 Nanog和Lin28已经被鉴定为增强诱导效率。0ct4(Pou5fl)是八聚合体(octamer，‘‘ Oct")家族转录因子之一，在维持多能性方面具有关键作用。0ct4+细胞例如卵裂球和胚胎干细胞中0ct4的缺失会导致自发的滋养层分化，因此0ct4的存在产生胚胎干细胞的多能性和分化潜力。“Oct"家族中的多个其它基因，包括0ct4的近亲Octl和0ct6，不能引发诱导，因此证明了 Oct-4在诱导过程中的专有性。与0ct4类似，Sox基因家族与维持多能性相关，虽然其与多潜能(multipotent)和单能干细胞相关，而0ct4与此相反，0ct4专有性地在多能干细胞中表达。虽然Sox2是用于重编程诱导的最初基因，但是发现Sox家族中的其它基因也在诱导过程中同样起作用。 Soxl以类似于Sox2的效率产生iPS细胞，基因Sox3、Soxl5和Soxl8也产生iPS细胞，虽然效率较低。在胚胎干细胞中，Nanog以及0ct4和Sox2是促进多能性所需的。因此，当 Yamanaka等人报道“Nanog对于诱导不是必需的、但Thomson等人报道可以使用Nanog作为因子之一来产生iPS细胞时，是令人惊奇的。Lin28是一种mRNA结合蛋白，其在胚胎干细胞和胚胎癌细胞中表达，与分化和增殖相关。Thomson等人证明其是产生iPS的一个因子，虽然其不是必需的。Klf基因家族的Klf4最初由Yamanaka等人鉴定，并由Jaenisch等人确认为用于产生小鼠iPS细胞的因子，并由Yamanaka等人证明是用于产生人类iPS细胞的因子。然而，Thompson等人报道Klf4对于人类iPS细胞的产生不是必需的，事实上其不能产生人类iPS细胞。发现Klf2和Klf4是能够产生iPS细胞的因子，相关的基因Klfl和Klf5同样也是，虽然效率较低。Myc基因家族是牵涉于癌症的原癌基因。Yamanaka等人和Jaenisch等人证明 c-Myc是牵涉于小鼠iPS细胞之产生中的因子，Yamanaka等人证明其是牵涉于人类iPS细胞之产生中因子。然而，Thomson等人和Yamanaka等人报道c_Myc对于产生人类iPS细胞不是必需的。将"Myc"基因家族用于诱导iPS细胞对于iPS细胞最终作为临床治疗具有麻烦，因为25%的移植了 c-Myc诱导的iPS细胞的小鼠产生致命性畸胎瘤。N-Myc和L-Myc 已经被鉴定为以类似的效率进行诱导(替代c-myc)。SV40大抗原可用于减少或防止当表达c-Myc时可能发生的细胞毒性。本发明中使用的重编程蛋白可以被具有大约相同的重编程功能的蛋白同源物替代。编码这些同源物的核酸也可用于重编程。保守性氨基酸置换是优选的，即，例如，作为极性酸性氨基酸的天冬氨酸/谷氨酸；作为极性碱性氨基酸的赖氨酸/精氨酸/组氨酸；作为非极性或疏水性氨基酸的亮氨酸/异亮氨酸/甲硫氨酸/缬氨酸/丙氨酸/甘氨酸/脯氨酸；作为极性或不带电的亲水性氨基酸的丝氨酸/苏氨酸。保守性氨基酸置换还包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族_羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸； 具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理预期将亮氨酸替换为异亮氨酸或缬氨酸、将天冬氨酸替换为谷氨酸、将苏氨酸替换为丝氨酸、或类似地将氨基酸替换为结构上相关的氨基酸将不会对得到的多肽的性质产生大的影响。可以通过测定多肽的比活性容易地确定氨基酸替换是否产生功能性多肽。V. T细胞和/或造血前体细胞的重编程为了从目前本领域通常使用的皮肤成纤维细胞之外的备选来源提供iPS细胞，提供了用于重编程包含T细胞的细胞群体的方法。在一些实施方式中，激活并扩增T细胞以提供显著数目的T细胞用于重编程。A.T 细胞术语“T细胞”是指如本领域中定义的T淋巴细胞并意在包括胸腺细胞、未成熟T 淋巴细胞、成熟的T淋巴细胞、静止的T淋巴细胞或激活的T淋巴细胞。T细胞可以是⑶4+T 细胞、CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞或⑶4_CD8_细胞。T细胞也可以是T辅助细胞，例如T辅助1 (THl)或T辅助2 (TH2)细胞或TH17细胞，以及细胞毒性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞、记忆T细胞或γ δ T细胞(Wilson等人，2009 ；Wynn, 2005 ；Ladi等人，2006)。彼此差别在于至少一种标志物例如CD4的T细胞，在本文中被称作T细胞的“子
皇”朱。辅助T细胞(效应T细胞或Th细胞)是适应性免疫系统的“中间者”。一旦被激活，它们迅速分裂并分泌被称作细胞因子的小的蛋白，所述细胞因子调节或辅助免疫应答。 取决于大小、接收到的细胞因子信号，这些细胞分化为TH1、TH2、TH3、TH17、THF或其它子集中的一种，它们分泌不同的细胞因子。⑶4+细胞与II类MHC相关。细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏被病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也被指参与移植排斥。这些细胞也被称作CD8+T细胞(与I类MHC相关)，因为它们在其表面表达 ⑶8糖蛋白。通过SLOB与T调节性⑶4+⑶25+FoxP3+细胞的相互作用，这些细胞可以被灭活为无变应性状态，这预防了自身免疫疾病，例如实验性自身免疫性脑脊髓炎。记忆T细胞是感染消退之后长期持续的抗原特异性T细胞的子集。在重新暴露于它们的同种抗原(cognate antigen)之后，它们迅速扩增为大量的效应T细胞，从而为免疫系统提供针对过往感染的“记忆”。记忆T细胞包括两个子集中心记忆T细胞(TCM细胞)和效应记忆T细胞(TEM细胞)。记忆细胞可以是⑶4+或⑶8+。调节性T细胞(Treg细胞)，以前被称作抑制性T细胞，对于维持免疫耐受是关键性的。它们类似于表达常规α β TCR的⑶4+细胞。它们可以进一步表征为⑶25和Foxp3 蛋白的共表达。它们的主要作用是在将近免疫反应的末期关闭T细胞介导的免疫力，并且抑制那些逃脱了胸腺中的阴性选择过程的自身反应性T细胞。已经描述了 CD4+调节性T细胞的两个主要类别，包括自然产生的Treg细胞和适应性Treg细胞。自然产生的Treg细胞 (也称作⑶4+⑶25+FoxP3+Treg细胞)产生于胸腺中，而适应性Treg细胞(也称作Trl细胞或Th3细胞)可以在正常免疫应答过程中起源。通过被称作FoxP3的细胞内分子的存在可以将自然产生的Treg细胞与其它T细胞区别开。F0XP3基因的突变可以阻止调节性T细胞发育，引起胎儿自身免疫疾病IPEX。自然杀伤T细胞(NK T细胞)是异质的T细胞群体，其特征在于共表达α β或 Y 3!~0 和多种^(受体，包括0016，0056，00161，0094，001583和0015813。NK T 细胞具有在激活后迅速分泌大量细胞因子的能力。NK T细胞克隆分泌1型、2型或这两种类型的细胞因子，其可以影响ThO细胞向Thl或Th2细胞的分化。NK T细胞被描述为在小鼠中是表达不变的TCR Va 14的细胞，在人类中是表达不变的TCR V a 24的细胞。最近，也已经认识到了表达多种TCR的NK T细胞。⑶3+CD56+细胞代表NK T细胞群体的一种。NK T细胞可以是 CD4+CD8+，CD4XD8、CD4TD8.或 CD4+CD8-。γ δ T细胞(伽玛德尔塔T细胞)代表在它们的表面具有独特的T细胞受体(TCR) 的T细胞的小的子集。大多数T细胞具有由被称作α-和β-TCR链的两个糖蛋白链构成的 TCR0然而，在Y δ T细胞中，TCR由1个Y-链和1个δ-链组成。该组T细胞相对于α βΤ 细胞较不常见(全部T细胞的5% )，但是在肠道粘膜中其丰度最高，在被称作上皮内淋巴细胞(IEL)的淋巴细胞群体内。激活Y δ T细胞的抗原性分子仍然是未知的。但是，γ δ T 细胞不是MHC限制性的，并且似乎能够识别整个蛋白，而不需要抗原呈递细胞上的MHC分子呈递肽。一些识别IB类MHC分子。人VY9/VS2T细胞构成外周血中的主要Y δ T细胞群体，它们是独特的，因为它们特异性且迅速对小的非肽微生物代谢物HMB-PP(异戊烯焦磷酸前体)作出应答。存在于来自健康供体的外周血中的T细胞的百分率估计如下CD3+ =70. 78% 士4. 71 ；CD3+CD4 = 38. 97% 士5. 66 ；CD3+CD8 = 28. 955% 士7. 43 ；CD3+CD56+ = 5. 22% 士 1. 74 ；CD3XD56+ = 10. 305% 士 4. 7 ；CD3+CD45RA = 45. 00% 士 7. 19 ；CD3+CD45R0+ =27. 21% 士 7. 34。T细胞可以是T细胞的纯化的群体，或者备选地，T细胞可以在与不同类型的细胞、 例如B细胞和/或其它外周血细胞的群体中。T细胞可以是T细胞的子集、例如CD4+T细胞的纯化的群体，或者，它们可以是包含T细胞的不同子集的T细胞的群体。在本发明的另一个实施方式中，T细胞是已经在培养物中维持了延长的时间段的T细胞克隆。T细胞克隆可以转化至不同程度。在具体的实施方式中，T细胞是在培养物中无限增殖的T细胞克隆。在本发明的优选实施方式中，T细胞是原代T细胞。术语“原代T细胞”意指包括获自个体的T细胞，与在培养物中维持了延长的时间段的T细胞不同。因此，原代T细胞特别是获自受试者的外周血T细胞。原代T细胞的群体可以主要由T细胞的一个子集组成。 备选地，原代T细胞的群体可以由T细胞的不同子集组成。T细胞可以来自之前储存的血液样品，来自健康个体，或备选地，来自被某病况影响的个体。所述病况可以是感染性疾病，例如由病毒感染、细菌感染或任何其它微生物感染引起的病况，或过度增生性疾病，例如癌症，例如黑素瘤。在具体的实施方式中，T细胞来自感染了人免疫缺陷病毒(HIV)的个体。在本发明的另一个实施方式中，T细胞来自患有自身免疫疾病或T细胞病症或对其易感的受试者。T细胞可以来源于人、鼠或任何其它哺乳动物物种。B.造血祖细胞由于造血干细胞和造血祖细胞的显著的医学潜在意义，已经进行了实质性工作以试图改善从胚胎干细胞分化造血祖细胞的方法。在成人中，主要存在于骨髓中的造血干细胞产生活跃分裂的造血(CD34+)祖细胞的异质群体，所述祖细胞分化为血液系统的所有细胞。虽然预期到CD34+内皮细胞可以被转化为iPS细胞，但是在一些实施方式中，使用非内皮细胞的造血细胞可能是理想的；例如，在一些情况下，使用不表达CD31或VE-钙粘蛋白的造血祖细胞或造血前体细胞可能是理想的。其它标志物，例如⑶43和/或⑶45标志物，也可用于辅助鉴定造血祖细胞(例如，Kadaja-Saarepuu等人，2008 ；Vodyanik等人，2006)。 造血细胞包括原始造血细胞的多个子集，包括⑶43 (+)⑶235a (+)⑶41a (+/-)(红细胞-巨核细胞生成性的)，1 in (_) CD34 (+) CD43 (+) CD45 (_)(多潜能)，和 1 in (-) CD34 (+) CD43 (+) CD45(+)(偏髓样的)细胞。在成人中，造血祖细胞增殖并分化，引起每日产生数千亿成熟的血液细胞。造血祖细胞也存在于脐带血中。在体外，人胚胎干细胞可以分化为造血祖细胞。 也可以从外周血样品扩增或富集造血祖细胞。造血细胞可以来源于人、鼠或任何其它哺乳动物物种。C.细胞群体的来源造血干细胞(HSC)通常产生于骨髓中，但可被迫使进入血液，该过程被称作动员 (mobilization)，在临床上用于收获外周血中大量数目的HSC。所选的一种动员剂是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。可以通过血液成分去除法，在无扰状态，或在外部施用造血生长因子例如G-CSF 动员之后，收集在外周血中循环的CD34+造血干细胞或祖细胞。在动员之后收集的干或祖细胞的数目大于在无扰状态下在血液成分去除法之后获得的数目。在本发明的具体方面， 细胞群体的来源是这样的受试者其细胞未经外部施用的因子动员，因为无需富集造血干细胞或造血祖细胞。用于本文描述的方法中的细胞的群体可以是哺乳动物细胞，例如人类细胞，非人灵长类细胞，啮齿类细胞(例如小鼠或大鼠)，牛细胞，羊细胞，猪细胞，马细胞，绵羊细胞， 犬细胞，猫细胞，或其混合物。非人灵长类细胞包括猕猴细胞。细胞可以获自动物，例如人类患者，或者它们可以来自细胞系。如果细胞是获自动物，则它们可以用作，例如，未分离的细胞(即，混合的群体)；它们可以已经在培养物中建立，例如，通过转化；或者它们可以已经经历初步纯化方法。例如，可以基于细胞表面标志物的表达通过阳性或阴性选择操作细胞群体；在体外或在体内以一种或多种抗原刺激；在体外或在体内以一种或多种生物修饰剂处理；或这些中的任意或全部项的组合。在示例性实施方式中，细胞群体经历阴性选择以消除非T细胞和/或特定T细胞子集。阴性选择可以基于多种分子的细胞表面表达来进行，包括B细胞标志物，例如⑶19和⑶20 ；单细胞标志物⑶14 ；NK细胞标志物⑶56。 备选地，细胞群体可以经历阴性选择以消除非CD34+造血细胞和/或特定的造血细胞子集。阴性选择可以基于多种分子的细胞表面表达来进行，例如，抗体的混合物(例如，CD2，CD3， CDllb, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123和CD235a)，其可用于分离其它细胞类型，例如通过MACS或柱分离。细胞的群体包括外周血单核细胞(PBMC)、含有混合群体的全血或其级份，脾细胞， 骨髓细胞，肿瘤浸润性淋巴细胞，通过白细胞去除术获得的细胞，生物活组织检查样品，淋巴结，例如从肿瘤引流的淋巴结。合适的供体包括经免疫的供体、非免疫的(原态)供体、 经处理的或未经处理的供体。“经处理的”供体是已经暴露于一种或多种生物修饰剂的供体。“未经处理的”供体是未暴露于一种或多种生物修饰剂的供体。获得包含T细胞的细胞群体的方法是本领域熟知的。例如，可以根据本领域已知的方法获得外周血单核细胞(PBMC)。此类方法的实例见实施例部分并由Kim等人(1992)； Biswas 等人(1990) ；Biswas 等人(1991)讨论。从细胞群体获得造血前体细胞的方法也是本领域熟知的。可以使用多种细胞因子扩增造血前体细胞，例如hSCF、hFLT3和/或IL-3 (Akkina等人，1996)，或者可以使用MACS 或FACS富集⑶34+细胞。如上所述，也可使用阴性选择技术来富集⑶34+细胞。也可以从受试者获得细胞样品，然后就所需的细胞类型富集之。例如，可以根据本文的描述从血液分离PBMC和/或CD34+造血细胞。可以使用逆流离心法(淘析)从PBMC 中富集T细胞。也可以使用多种技术从其它细胞分离细胞，例如，使用结合于所需的细胞类型的细胞表面上的表位的抗体来分离和/或激活，例如，一些T细胞分离试剂盒使用缀合于珠子的抗体激活细胞，然后使用相同的珠子进行柱分离。可以使用的另一种方法包括使用针对细胞表面标志物的抗体进行阴性选择，以选择性富集特定细胞类型而不通过受体的介入激活细胞。骨髓细胞可以获自髂嵴、股骨、胫骨、脊骨、肋骨或其它骨髓腔。可以从患者取出骨髓并通过多种分离和洗涤程序分离。用于分离骨髓细胞的已知程序包括以下步骤a) 将骨髓悬浮液离心分离为3个级份，并收集中间级份，或棕黄层；b)在单独的液体、通常为 Ficoll (Pharmacia Fine Chemicals AB的商标)中再离心来自步骤a)的棕黄层级份1次， 收集含有骨髓细胞的中间级份；和c)洗涤来自步骤b)的收集的级份以回收可输送的骨髓细胞。如果希望使用富含T细胞的细胞群体，则可以通过白细胞去除术和机械血液成分去除法，使用连续流动细胞分离器，从混合的细胞群体获得此类细胞群体。例如，可以通过任意已知的方法从棕黄层分离T细胞，包括在Ficoll-Hypaque 梯度上分离，在Percoll梯度上分离，或通过淘析。D. T细胞激活在一些方面，T细胞被试剂激活，所述试剂结合T细胞受体以激发用于T细胞激活的信号级联。例如，可以使用CD3抗体。为了使T细胞扩增为大量的数目和增殖性状态以用于重编程，也可以使用细胞因子，例如IL-2。幼稚T细胞可以生存很多年而不分裂。这些小的静止细胞具有致密的染色质和贫乏的细胞质并合成极少的RNA或蛋白质。在激活后，它们必须重新进入细胞周期并迅速分裂以产生大量的子代，所述子代将分化为武装的效应T细胞。它们的增殖和分化由被称作白介素-2(IL-2)的细胞因子介导，该细胞因子是由激活的T细胞本身产生的。
在存在所需的共刺激信号的情况下，与特定抗原的最初相遇会激发T细胞进入细胞周期的Gl期；同时，其还诱导IL-2以及IL-2受体的α链的合成。IL-2受体具有3条链α、β和Y。静止T细胞表达由β和γ链组成的该受体，其以中等亲和性结合IL-2， 允许静止T细胞对非常高浓度的IL-2作出应答。α链与β和γ链的结合会产生具有针对IL-2的高得多的亲和性的受体，允许细胞对非常低浓度的IL-2作出应答。然后，IL-2与高亲和性受体的结合激发越过细胞周期的静止期的进程。通过这种方式激活的T细胞能够在1天内分裂2-3次，持续数天，允许1个细胞产生由数千个子代组成的克隆，所述子代都携带相同的针对抗原的受体。IL-2还促进这些细胞分化为武装的效应T细胞。虽然不同类别的T细胞的具体激活机理稍有差别，但对于多数而言，CD4+T细胞采用“双信号模式”。⑶4+Τ细胞的激活通过T细胞受体与T细胞上的⑶28的啮合进行，分别通过APC上的主要组织相容性复合物肽和Β7家族成员进行。二者对于产生有效免疫应答都是必需的；在不存在CD28共刺激的情况下，单独的T细胞受体信号传导导致无反应性。 CD28和T细胞受体下游的信号传导途径涉及很多蛋白。第一信号是通过T细胞受体与另一细胞上的主要组织相容性复合物(MHC)呈递的短肽的结合而提供的。这确保了只有那些具有特异于该肽的TCR的T细胞被激活。伴侣细胞通常是专职的抗原呈递细胞(APC)，在原始应答的情况下，通常是树突细胞，虽然B细胞和巨噬细胞也可以是重要的APC。由I类MHC分子呈递至⑶8+Τ细胞的肽的长度是8-9个氨基酸；由II类MHC分子呈递至⑶4+Τ细胞的肽更长，因为II类MHC分子的结合裂口的末端是开放的。第二信号来自共刺激，其中APC上的表面受体是由数量相对少的刺激物诱导的， 通常是病原体的产物，但有时是细胞的分解产物，例如坏死体或热激蛋白。幼稚T细胞组成型表达的仅有的共刺激受体是⑶28，所以这些细胞的共刺激来自APC上的⑶80和⑶86蛋白。在T细胞激活后也表达其它受体，例如0X40和IC0S，但它们的表达很大程度上依赖于 CD28。第二信号许可T细胞对抗原作出应答。如果没有它，T细胞变得无反应性，并且其将来的激活也变得更难。该机制防止对自身的不适当应答，因为自身肽通常不与适宜的共刺激呈递。在一些方面，当涉及共刺激时，抗-⑶3和抗-⑶28 二者可用于T细胞激活。在备选方面，可以应用抗-CD3的交联，例如结合于平板的抗-CD3。如果可溶性抗-CD3用于激活 PBMC中的T细胞，该可溶性抗-CD3抗体可以与PBMC中的APC结合，然后其将抗体呈递至T 细胞。如果在纯化的T细胞的群体中仅使用可溶性抗-CD3抗体，因为上述原因，将导致无反应性。本发明的一些实施方式包括在存在抗_CD3(0KT3)和IL2的情况下培养T细胞，这是有利的和方便的，因为无需使用昂贵和麻烦的珠子或结合于平板的抗体；在加入0KT3和 IL2之后，PBMC的细胞环境将辅助激活T细胞。然后，T细胞由于优先扩增而相对于PBMC 培养物中的其它细胞类型变得过密。T细胞受体以数个蛋白的复合物存在。实际的T细胞受体由两个单独的肽链组成， 其是由独立的T细胞受体α和β (TCRa和TCRi^)基因产生的。复合物中的其它蛋白是 ⑶3蛋白⑶3 ε γ和⑶3 ε δ异二聚体，以及，最重要的，⑶3 ζ同二聚体，其具有总共6个 ITAM基序。CD3 ζ上的ITAM基序可以被Lck磷酸化，继而募集ZAP-70。Lck和/或ΖΑΡ-70 也可以将很多其它分子(同样重要的CD28、LAT和SLP-76)上的酪氨酸磷酸化，这允许信号
20传导复合物在这些蛋白周围聚集。磷酸化的1^11募集51^-76至膜，在那里其可以引来？11^、￥4￥1、Itk和潜在地， PI3K。PLCy和PI3K 二者都作用于膜的内小叶上的PI (4，5)P2，以产生活性中间体二酰基甘油(DAG)、肌醇-1，4，5-三磷酸(IP3)和磷脂酰肌醇_3，4，5-三磷酸(PIP3)。DAG结合并激活T细胞上的一些PKC，例如PKC θ，该过程对于激活转录因子NF- κ B和AP-I具有重要意义。ΙΡ3由PLCy从膜释放，并迅速扩散以激活ER上的受体，这诱导钙的释放。然后，释放的钙激活钙神经素，钙神经素激活NFAT，然后其转位至细胞核。NFAT是转录因子，其激活多向性的一组基因的转录，最特别是IL-2，其是促进激活的T细胞的长期增殖的细胞因子。根据本发明的方法，将核酸分子导入活跃增殖(即扩增)的T细胞。可以通过将 T细胞与多种试剂(例如提供原始刺激信号的试剂与针对T细胞的共刺激信号的组合)接触来刺激T细胞以使其扩增。可用于刺激T细胞以使其扩增的试剂是本领域熟知的，并且在下文中描述。被刺激而增殖的T细胞的特征在于细胞扩大、簇集和培养基的酸化。因此， T细胞增殖可以通过例如检查T细胞的尺寸或测定其体积(例如使用库耳特计数器)来证明。静止τ细胞具有大约6. 8微米的平均直径。在最初激活和刺激之后，T细胞的平均直径将在第4天时增加至超过12微米，并在约第6天时开始降低。此外，可以通过本领域已知的标准技术测定T细胞增殖，例如通过氚标记的胸苷摄取。本发明的方法涉及，在将核酸分子导入增殖中的T细胞之前将增殖中的T细胞与至少一种刺激剂接触。术语“刺激剂”意在包括向T细胞提供信号的试剂，从而，相对于导入核酸分子之前不将T细胞与刺激剂接触的情况，当在将核酸分子导入T细胞之前将T细胞与刺激剂接触时，被转染进入T细胞的核酸分子中包含的基因的表达水平较高。在本发明的具体实施方式
中，刺激剂是向T细胞提供原始激活信号的试剂。表述 “原始激活信号”意在包括通常通过TCR/CD3复合物激活的信号，其诱导T细胞的激活。T细胞的激活意在包括T细胞的修饰，从而T细胞在接收到第二信号、例如共刺激信号之后被诱导以增殖并分化。在具体的实施方式中，原始激活信号由接触T细胞受体或与T细胞受体相关的CD3复合物的试剂提供。在优选实施方式中，试剂是针对CD3的反应性抗体，例如单克隆抗体0ΚΤ3(可获自美国典型培养物保藏中心，Rockville，Md. ；No. CRL 8001)。在本发明的另一个实施方式中，刺激剂是刺激T细胞上的CD2复合物的试剂，例如抗体的组合，例如 Til. 3+T11. 1，或 Til. 3+T11. 2(见，例如 Meuer 等人，1984)。在方法的另一个实施方式中，刺激剂是淋巴因子，例如IL-2。淋巴因子特别与另一试剂组合使用，例如向T细胞提供原始激活信号的试剂，用于刺激T细胞。因此，在本发明的优选实施方式中，在以核酸分子转染T细胞之前，将T细胞与向T细胞提供原始激活信号的试剂(例如，抗-CD3抗体)和有效量的IL-2的组合接触，从而核酸分子在T细胞中表达。在本发明的优选实施方式中，T细胞被刺激T细胞中的原始激活信号和共刺激信号的试剂组合所激活。术语“共刺激试剂”意在包括向T细胞提供共刺激信号的试剂，从而已经接收到原始激活信号的T细胞(例如激活的T细胞)被刺激而增殖或分泌细胞因子， 例如IL-2、IL-4或干扰素-Y。在具体的实施方式中，共刺激试剂与T细胞表面上的⑶28 或CTLA4分子相互作用。在更具体的实施方式中，共刺激信号是CD28或CTLA4的配体，例如B-淋巴细胞抗原B7-1或B7-2。词语“刺激形式的⑶28的天然配体”意在包括B7-1和B7-2分子，其片段或其修饰，它们能够向T细胞提供共刺激信号。刺激形式的CD28的天然配体可以这样鉴定例如，将激活的外周血淋巴细胞与一定形式的CD28的天然配体接触， 并进行标准的T细胞增殖检验。因此，刺激形式的CD28的天然配体能够刺激T细胞的增殖。 刺激形式的CD28/CTLA4的天然配体描述于例如PCT
发明者A·麦克, D·拉杰什, E·R·多明格斯, E·努韦瑟, M·布朗, R·莱亚里什 申请人:细胞动力国际有限公司