专利名称：一种高效诱导人类体细胞重编程为多潜能干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种高效诱导体细胞重编程为多潜能干细胞 的方法。
背景技术：
干细胞向成体细胞的发育与分化在基因水平受精密调控，而逆转成体细胞的分 化状态至多潜能的干细胞状态即为重编程。2007年日本、美国的科学家(Takahashi et al. 2007 ；Yu et al. 2007 ；Park et al. 2008)相继报道，在人类体细胞中通过逆转录病 毒(或慢病毒)过表达四个转录因子基因(0ct4，Sox2, Klf4与c-Myc，或者0ct4，Sox2, Nanog与Lin28)，逆转人类成体细胞的分化状态，获得多能潜能干细胞(iPSC，induced pluripotent stem cell)。有报道证实，通过病毒载体导入0ct3/4和Sox2两种转录因子基 因，即可将体细胞重编程为多潜能干细胞(Danwei Huangfu，2008)。2009年3月5日，Cell 报道Rudolf Jaenisch研究组利用Cre-重组酶系统使诱导成功的帕金森病人iPSC无外源 因子，使iPSC临床应用又推进了一步。2009年3月26日，Science报道俞君英等通过一种非 整合质粒Episomal Vector成功诱导出无外源基因也无载体整合到基因组上的iPSC(俞君 英等人，无载体也无外源基因序列的人的诱导多能干细胞，科学，2009. 324:7797-801)。人 类体细胞重编程为多潜能干细胞(iPSC)是近两年来干细胞研究领域的重要里程碑事件。在 2007-2008年连续两年被science杂志评为十大科学进展(Kennedy 2007 ；Vogel 2008)。通过调控体细胞重编程，使成体细胞获得与胚胎干细胞(ESC)相似的多潜能性，具 有非常重要的研究和潜在的细胞替代治疗价值。人类iPSC和胚胎干细胞能够特异性的表 达SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60，Tra-1-81等表面抗原，以及Nanog、0ct4等核转录因子基因。 通过悬浮培养，iPSC和胚胎干细胞能形成胚状体(EB)后，能够分化形成人类胚胎的三个胚 层的细胞，表达三个胚层所特有的基因。这些特性是判断iPSC具有类似未分化的人类胚胎 干细胞的标准。由于多潜能干细胞(iPSC)具有多向分化潜能，越来越多的研究者正在探索 体外诱导iPSC分化，用于不可再生细胞的替代治疗。此外，由于患者来源的iPSC携带相应 的致病基因和特异的细胞病理过程，研究人员已经从I型糖尿病、帕金森病和另外至少十 几种疾病的患者身上诱导获得iPSC，这些疾病特异的iPSC可作为疾病的细胞模型，对于研 究人类疾病具有重要意义。尽管iPSC吸引各国研究者开展大量研究，然而目前现有的诱导人类或灵长类体 细胞为iPSC的技术体系面临如下问题①其效率极低，约1/10000左右，②诱导时间漫长， 约24天左右。③各个研究小组所获得的iPSC其细胞表型，基因表达及其功能均有差异。上 述技术问题在很大程度上限制了 iPSC的研究应用。因此，要使人类iPSC在再生医学和疾病发生研究中得到广泛应用，必须探索一种 高效诱导策略，缩短重编程所需时间，简化诱导过程。
发明内容
本发明的目的是提供能够高效诱导体细胞重编程为多潜能干细胞，同时缩短重编 程时间的手段，本发明的另一个目的是提供使用该手段的方法。本发明人以实现上述目的为目标进行了广泛的研究，并且发现在将核重编程因子 与体细胞接触之前，用含甲状腺激素T3或T4培养基培养体细胞，可以显著的增加iPSC形 成效率。一种诱导体细胞重编程为多潜能干细胞的方法包括以下步骤
A.用含甲状腺激素T3或T4的培养基培养体细胞2-4天；
B.将核重编程因子加入到体细胞培养液中与体细胞接触，继续培养，挑选形态类似胚 胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到多潜能干细胞。所述甲状腺激素T3或T4浓度优选ΙΟ,-Ι ΤπιοΙ/Ι。加入的甲状腺激素Τ3或Τ4 能够促进细胞增殖和细胞能量代谢，提高重编程效率和缩短诱导周期。所述核重编程因子为能够诱导体细胞重编程为多潜能干细胞的因子，该核重编程 因子以DNA、mRNA或蛋白质形式与体细胞接触。所述核重编程因子可来源于不同的物种，优选与所使用体细胞相同来源的生物， 如体细胞为人成纤维细胞时，所述核重编程因子优选为人的核重编程因子及其变体。优选的，所述核重编程因子以DNA形式与体细胞接触，所述DNA为分别带有相应核 重编程因子编码序列的载体。更优选的，所述载体为病毒载体或质粒。所述病毒载体和质粒均有成熟的商品供应，可以从市场上购得。更优选的，所述病毒载体为逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体。上述任一方案中更优选的，所述核重编程因子包含0ct3/4和S0X2、S0X1中的一种。更优选的，所述核重编程因子还包含Klf4，c-Myc，Nanog, Lin28中的至少一种。所述Klf4可替换为Klf5或Klf2。所述 c-Myc 可替换为 L-Myc 或 Ν-Myc。更优选的，所述核重编程因子为0ct3/4、Sox2、Klf4，c_Myc 或 0ct3/4、Sox2、Klf4， Nanog0上述各核重编程因子编码序列均可在NCBI上查找得到。上述任一方案中更优选的，所述体细胞可来源于不同的种属，包括但不限于人类、 大猩猩、猴子等。更优选的，所述体细胞为灵长类动物的皮肤成纤维细胞、粘膜上皮细胞、淋巴细 胞、毛囊细胞、脂肪间充质干细胞，脐带间充质干细胞，骨髓间充质干细胞，可以从灵长类物 种分离得到或者从相关的细胞库购买。更优选的，所述体细胞为人的皮肤成纤维细胞、粘膜上皮细胞、淋巴细胞、毛囊细 胞、脂肪间充质干细胞，脐带间充质干细胞，骨髓间充质干细胞。上述任一方案中更优选的，在将核重编程因子加入到体细胞培养液中与体细胞接 触后，需继续用含甲状腺激素T3或T4的培养基培养5-8天，所述甲状腺激素T3或T4浓度 为ΙΟ,-Ι ΓπιοΙ/Ι，通过上述处理能够进一步增加iPSC形成效率。上述任一方案中更优选的，将核重编程因子加入到体细胞培养液中与体细胞接触后，继续培养18-30小时，然后换含20%FBS-DMEM培养，3-5天后传代至饲养层细胞继续培养 3-5天，最后换ESC培养基培养3-5天即可得到多潜能干细胞。所述20%FBS-DMEM为含20%胎牛血清的高糖DMEM或者DMEM/F12培养基，添加终浓 度为 2mmol/L L-glutamine，终浓度为 0. lmmol/L b-巯基乙醇，终浓度为 5-100ng/mL bFGF, 终浓度为0. lmmol/L非必需氨基酸和抗生素。该抗生素优选终浓度为50 units/mL青霉素和50mg/mL链霉素。所述饲养层细胞可以是胚胎期13. 5天的小鼠成纤维细胞，胚胎期人皮肤细胞， 成人皮肤成纤维细胞，人脐带间充质干细胞等，优选为用丝裂霉素处理使其失去增殖能力 的胚胎期13. 5天的小鼠成纤维细胞。更优选的，将核重编程因子加入到体细胞培养液中与体细胞接触的同时补充加入 与新鲜培养液，维持细胞增殖所需能量，该新鲜培养液为DMEM/F12培养基中添加终浓度分 别为 0. lmmol/L 非必需氨基酸，2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b_ 巯基乙醇，10ng/mL 的 bFGF, 20% (vol/vol) FBS 和抗生素。该抗生素优选终浓度为50 units/mL青霉素和50mg/mL链霉素。更优选的，所述ESC培养基是由knockout DMEM或DMEM/F12、5_100ng/L碱性成纤 维细胞生长因子、2mmol/L L-glutamine,0. lmmol/L b_巯基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基 酸、20%血清替代物、5-25ug/mL抗支原体药物plasmocin以及抗生素组成的培养基。该抗生素优选终浓度为50 units/mL青霉素和50mg/mL链霉素。通过本发明方法得到的多潜能干细胞具有与胚胎干细胞(ES)相似的特性，这些特 性包括增殖能力、表达胚胎干细胞标记、形成包含内、中、外三个胚层的组织和细胞的畸胎 瘤。与现有技术相比，本发明的有益效果是本发明提供的高效诱导体细胞重编程为 多潜能干细胞的方法，能够提高诱导iPSC效率20-100倍，达到1. 2%左右，并且缩短诱导周 期至12-16天，同时诱导获得的iPSC不同克隆之间细胞形态、增殖能力、多潜能基因表达均 一，能够用于细胞替代治疗。
图1是3组细胞分别诱导13天后TRA-1-60的表达情况。图2是3组细胞分别诱导13天后TRA-1-60阳性表达率。图3是实施例5所得iPSC形态图片。图4是实施例5所得iPSC表达人类ESC多潜能相关细胞标记图。图5是实施例5所得iPSC形成的拟胚体及其分化图。
具体实施例方式下面结合
及具体实施方式
对本发明进一步说明。一.高效诱导体细胞重编程为多潜能干细胞。实施例1.含核重编程因子编码序列的逆转录病毒载体的扩增。按现有技术，从Addgene公司购买分别包含人0ct3/4、Sox2、Klf4、c_Myc的逆转 录病毒载体。在大肠杆菌中扩增后，纯化得到含有相应基因的逆转录病毒载体。
5
实施例2.包装逆转录病毒。按现有技术，将分别含有0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的逆转录病毒载体转染 293T细胞，包装逆转录病毒。并用通过30-100KD超滤管，5000 X g，4°C，离心30分钟，收 集病毒液，使其分别浓缩10倍左右，终浓度约为5X 106-5X 107 transducing units/mL/ 单个核重编程因子。将浓缩后的分别含有0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的逆转录病毒 等体积混合，取0.6-1.0 ml病毒溶液感染体细胞，此时的病毒滴度MOI (multiplicity of infection)约为5-50/单个核重编程因子。实施例3.含核重编程因子编码序列的慢病毒载体的扩增。按现有技术，从Addgene公司购买人0ct3/4、Sox2、Nanog和Lin28的慢病毒质粒。 在大肠杆菌中扩增后，纯化得到含有相应基因的慢病毒质粒。实施例4.包装慢病毒。按现有技术，将分别含有0ct3/4、SOX2、NanOg、Lin28基因的慢病毒载体转染293T 细胞，包装慢病毒。并用通过30-100KD超滤管，5000 X g，4°C，离心30分钟，收集病毒液，使 其分别浓缩10倍左右。终浓度约为5X 106-5X 107 transducing units/mL/单个核重编程 因子。包装细胞的质量对感染效率非常关键，将浓缩后的慢病毒混合，取0.6-1.0 ml病毒 溶液感染体细胞，此时的病毒滴度MOI (multiplicity of infection)约为5-50/单个核重 编程因子。实施例5.多潜能干细胞的制备。将人类皮肤成纤维细胞传代至12孔板，每孔约2. 5-3 X IO4个。在培养基(DMEM/ F12培养基中添加终浓度为0. lmmol/L非必需氨基酸，终浓度为2mmol/L L-glutamine,终 浓度为 0. lmmol/L b-巯基乙醇，终浓度为 10ng/mL 的 bFGF，20%(vol/vol) KSR(knockout serum replacement)，终浓度为50 units/mL青霉素和终浓度为50mg/mL链霉素)中加 入甲状腺激素T3，使其终浓度为5X 10_9mOl/L，培养3天后，加入实施例2所得逆转录 病毒液0. 6-1. OmL感染，并加入0. 5mL新鲜培养液(DMEM/F12培养基中添加终浓度分别 为 0. lmmol/L 非必需氨基酸，2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b_ 巯基乙醇，10ng/mL 的 bFGF，20%(vol/vol)FBS，50 units/mL青霉素和50mg/mL链霉素)，维持细胞增殖所需能 量。24h后换20%FBS-DMEM (高糖DMEM或DMEM/F12培养基中添加终浓度分别为20%FBS， 2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b_ 巯基乙醇，0. lmmol/L 非必需氨基酸，30ng/mL bFGF, 50 imits/mL青霉素和50mg/mL链霉素)培养，病毒感染后的细胞增殖减慢，感染后的第3天 左右出现向上皮细胞转变的形态改变。换20%FBS-DMEM培养后第5天将细胞以4-10X IO2/ cm2的密度传代至饲养层细胞培养。传代至饲养层细胞后第3天开始换用人ESC培养基培 养，重编程的iPSC克隆在换用人ESC培养基后第4天左右出现，表达多潜能基因SSEA4， TRA-1-60, TRA-1-81, E-cadherin，NANOG 以及内源性 0ct3/4，Sox2 等。上述 ESC 培养基是 由knockout DMEM培养基中添加终浓度分别为30ng/L碱性成纤维细胞生长因子、2mmol/L L-glutamine,0. lmmol/L b-巯基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸、20%血清替代物、5_25ug/ mL抗支原体药物plasmocin以及50 units/mL青霉素和50mg/mL链霉素组成的培养基。经 过进一步的筛选，得到符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，即多潜能干细胞。在加入逆转录病 毒感染人类皮肤成纤维细胞后的6天内，需在培养基中添加甲状腺激素T3，使其终浓度为 5Xl(T9mol/L。
实施例6.多潜能干细胞的制备。将人类粘膜上皮细胞传代至12孔板，每孔约2. 5-3X IO4个。在培养基中(含 DMEM/F12、0. lmmol/L 非必需氨基酸，2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b-巯基乙醇，10 ng/mL 的 bFGF，20%KSR (knockout serum replacement)，50 units/mL 青霉素禾口 50mg/mL 链霉素)加入甲状腺激素T3，使其终浓度为5 X 10_8mOl/L，培养2天后，加入实施例4所得 的慢病毒液0. 6-1. OmL感染，并加入0. 5mL新鲜培养液(DMEM/F12培养基中添加终浓度分 别为 0. lmmol/L 非必需氨基酸，2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L β -巯基乙醇，10ng/mL 的bFGF，20%FBS，50 units/mL青霉素和50mg/mL链霉素)，维持细胞增殖所需能量。18h 后换用20%FBS-DMEM(高糖DMEM或DMEM/F12培养基中添加终浓度分别为20%FBS，2mmol/ L L-glutamine, 0. lmmol/L b_ 巯基乙醇，0. lmmol/L 非必需氨基酸，5-100ng/mL bFGF, 50 units/mL青霉素和50mg/mL链霉素)培养。病毒感染后的细胞增殖减慢，感染后的第3天 左右出现向上皮细胞转变的形态改变。换20%FBS-DMEM培养后第4天将细胞以4-10X IO2/ cm2的密度传代至饲养层细胞培养。代至饲养层细胞后第4天开始换用人ESC培养基(DMEM/ F12培养基中添加终浓度为2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b-巯基乙醇，0. lmmol/L非 必需氨基酸，60ng/mL bFGF, 50 units/mL青霉素和50mg/mL链霉素)培养，重编程的iPSC 克隆在换用人ESC培养基后第4天左右出现，表达多潜能基因SSEA4，TRA-1-60, TRA-1-81, E-cadherin,NANOG以及内源性0ct3/4，SoX2等。经过进一步的筛选，得到符合胚胎干细胞 特性的细胞克隆，即多潜能干细胞。在加入逆转录病毒感染人类皮肤成纤维细胞后的7天 内，需在培养基中添加甲状腺激素T3，使其终浓度为5 X 10_8mOl/L。实施例7.多潜能干细胞的制备。将人脐带间充质干细胞传代至12孔板，每孔约2. 5-3 X IO4个。在培养基(DMEM/ F12培养基中添加终浓度为0. lmmol/L非必需氨基酸，终浓度为2mmol/L L-glutamine,终 浓度为 0. lmmol/L b_ 巯基乙醇，终浓度为 60ng/mL 的 bFGF，20%(vol/vol) KSR(knockout serum replacement)，终浓度为50 units/mL青霉素和终浓度为50mg/mL链霉素)中加 入甲状腺激素T4，使其终浓度为liTmol/L，培养3天后，加入实施例2所得逆转录病毒 液0. 6-1. OmL感染，并加入0. 5mL新鲜培养液(DMEM/F12培养基中添加终浓度分别为 0. lmmol/L 非必需氨基酸,2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b_ 巯基乙醇，10ng/mL 的 bFGF，20%(vol/vol)FBS，50 units/mL青霉素和50mg/mL链霉素)，维持细胞增殖所需能 量。30h后换20%FBS-DMEM (高糖DMEM或DMEM/F12培养基中添加终浓度分别为20%FBS， 2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b_ 巯基乙醇，0. lmmol/L 非必需氨基酸，40ng/mL bFGF, 50 units/mL青霉素和50mg/mL链霉素)培养，病毒感染后的细胞增殖减慢，感染后的第3天 左右出现向上皮细胞转变的形态改变。换20%FBS-DMEM培养后第3天将细胞以4-10X IO2/ cm2的密度传代至饲养层细胞培养。传代至饲养层细胞后第5天开始换用人ESC培养基培 养，重编程的iPSC克隆在换用人ESC培养基后第5天左右出现，表达多潜能基因SSEA4， TRA-1-60, TRA-1-81, E-cadherin, NANOG 以及内源性 0ct3/4，Sox2 等。上述 ESC 培养基是由 knockout DMEM培养基中添加终浓度分别为5-lOOng/L碱性成纤维细胞生长因子、2mmol/L L-glutamine,0. lmmol/L b-巯基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸、20%血清替代物、5_25ug/ mL抗支原体药物plasmocin以及50 units/mL青霉素和50mg/mL链霉素组成的培养基。经 过进一步的筛选，得到符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，即多潜能干细胞。在加入逆转录病毒感染人类皮肤成纤维细胞后的8天内，需在培养基中添加甲状腺激素T4，使其终浓度为 l(T7mol/L。实施例8.多潜能干细胞的制备。将人骨髓间充质干细胞传代至12孔板，每孔约2. 5-3 X IO4个。在培养基(DMEM/ F12培养基中添加终浓度为0. lmmol/L非必需氨基酸，终浓度为2mmol/L L-glutamine,终 浓度为 0. lmmol/L b_ 巯基乙醇，终浓度为 40ng/mL 的 bFGF，20%(vol/vol) KSR(knockout serum replacement)，终浓度为50 units/mL青霉素和终浓度为50mg/mL链霉素)中加 入甲状腺激素T4，使其终浓度为5X 10_8mOl/L，培养4天后，加入实施例2所得逆转录 病毒液0. 6-1. OmL感染，并加入0. 5mL新鲜培养液(DMEM/F12培养基中添加终浓度分别 为 0. lmmol/L 非必需氨基酸，2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b_ 巯基乙醇，10ng/mL 的 bFGF，20% (vol/vol) FBS, 50 units/mL青霉素和50mg/mL链霉素)，维持细胞增殖所需能 量。24h后换20%FBS-DMEM (高糖DMEM或DMEM/F12培养基中添加终浓度分别为20%FBS， 2mmol/L L-glutamine, 0. lmmol/L b_ 巯基乙醇，0. lmmol/L 非必需氨基酸，20ng/mL bFGF, 50 units/mL青霉素和50mg/mL链霉素)培养，病毒感染后的细胞增殖减慢，感染后的第3天 左右出现向上皮细胞转变的形态改变。换20%FBS-DMEM培养后第4天将细胞以4-10X IO2/ cm2的密度传代至饲养层细胞培养。传代至饲养层细胞后第4天开始换用人ESC培养基培 养，重编程的iPSC克隆在换用人ESC培养基后第4天左右出现，表达多潜能基因SSEA4， TRA-l-60,TRA-l-81,E-cadherin, NANOG 以及内源性 0ct3/4，Sox2 等。上述 ESC 培养基是由 knockout DMEM培养基中添加终浓度分别为5-lOOng/L碱性成纤维细胞生长因子、2mmol/L L-glutamine,0. lmmol/L b-巯基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸、20%血清替代物、5_25ug/ mL抗支原体药物plasmocin以及50 units/mL青霉素和50mg/mL链霉素组成的培养基。经 过进一步的筛选，得到符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，即多潜能干细胞。在加入逆转录病 毒感染人类皮肤成纤维细胞后的5天内，需在培养基中添加甲状腺激素T4，使其终浓度为 5Xl(T8mol/L。除特别陈述外，上述实施例中所使用试剂均可从Invitrogen公司购买，细胞株均 为标准株。利用含核重编程因子编码序列的腺病毒载体或质粒诱导iPSC的方法可参考上述 实施例，在此不再赘述。本发明中各培养基中的bFGF在其相应的含量范围内均能很好的促 进细胞的生长。本发明所使用的核重编程因子组合可根据现有技术做出相应的调整，在此不再赘 述。二.获得的多潜能干细胞的鉴定。分别以人皮肤成纤维细胞(HDF)、人脐带间充质干细胞(UCMSC)为原料，按实施 例5方法制备iPSC，同时设一无甲状腺激素T3诱导对照组(HDF)，诱导13天后，如图1所 示，添加T3组的人皮肤成纤维细胞(HDF)与人脐带间充质干细胞(UCMSC)出现iPSC克隆， TRA-1-60表达阳性而对照组多数克隆表现为TRA-1-60阴性或假阳性；如图2所示，在人皮 肤成纤维细胞(HDF)与人脐带间充质干细胞(UCMSC)中，添加T3使TRA-I-60阳性克隆的 阳性率均比未添加的对照组提高20-100倍左右，其中OSKM为0CT3/4，S0X2，Klf4与c_Myc 的缩写。另外，如图3所示，通过本实施例5获得的iPSC在形态上与人类ESC (H9)相似，且获得的不同iPSC克隆之间形态均一)在悬浮培养条件下能形成拟胚体(EB)，在N2培养 基中能向神经细胞分化，表达神经胶质酸性蛋白(GFAP)。对所得iPSC进行分子生物学方面鉴定，结果表明形成的iPSC细胞表达多潜能基 因 SSEA-3，SSEA-4 (而不表达小鼠 ES 特异标记 SSEA-l)，TRA-l-60，TRA-l-81，E_cadherin， NAN0G(见附图4)以及内源性0CT3/4，S0X2等。通过RT-PCR对内源性0CT3/4和NANOG基 因表达分析显示获得的人iPSC细胞中内源性0CT3/4和NANOG基因启动表达。对DNA甲基 化分析结果显示0CT3/4和NANOG基因启动子区相应位点完成去甲基化。所得iPSC通过悬 浮培养能形成拟胚体(EB)，在分化条件下能向内中外三胚层分化(见附图5)。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
权利要求
1.一种诱导体细胞重编程为多潜能干细胞的方法包括以下步骤A.用含甲状腺激素T3或T4的培养基培养体细胞2-4天；B.将核重编程因子加入到体细胞培养液中与体细胞接触，继续培养，挑选形态类似胚 胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到多潜能干细胞; 所述核重编程因子以DNA、mRNA或蛋白质形式与体细胞接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤A所述甲状腺激素T3或T4浓度为 lO.-KTmol/L;步骤A所述体细胞为灵长类动物的皮肤成纤维细胞、粘膜上皮细胞、淋巴 细胞、毛囊细胞、脂肪间充质干细胞，脐带间充质干细胞，骨髓间充质干细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤B所述将核重编程因子加入到体细 胞培养液中与体细胞接触后，需继续用终浓度为ΙΟ,-ΚΓπιοΙ/Ι的甲状腺激素T3或T4的 培养基培养5-8天。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤B所述核重编程因子包含0ct3/4和 Sox2、Soxl 中的一种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述核重编程因子还包含Klf4，c-Myc, Nanog, Lin28中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤B所述核重编程因子以DNA形式与 体细胞接触；所述DNA为带有相应核重编程因子编码序列的载体；所述载体为病毒载体或 质粒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述病毒载体为逆转录病毒载体、慢病毒 载体或腺病毒载体。
8.根据权利要求1至7任一所述的方法，其特征在于步骤B具体为将核重编程因子 加入到体细胞培养液中与体细胞接触后，继续培养18-30小时，然后换20%FBS-DMEM培养， 3-5天后传代至饲养层细胞继续培养3-5天，最后换ESC培养基培养3-5天即可得到多潜能 干细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于将核重编程因子加入到体细胞培养液中 与体细胞接触的同时补充加入新鲜培养液；所述饲养层细胞为用丝裂霉素处理使其失去增 殖能力的胚胎期13. 5天的小鼠成纤维细胞。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述ESC培养基是由knockoutDMEM或 DMEM/F12、5-100ng/L碱性成纤维细胞生长因子、2mmol/L L_glutamine、0. lmmol/L b-巯基 乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸、20%血清替代物、5_25ug/mL抗支原体药物plasmocin以及 抗生素组成的培养基。
全文摘要
本发明提供了一种高效诱导体细胞重编程为多潜能干细胞的方法，属于领域生物医学。本发明提供的高效诱导体细胞重编程为多潜能干细胞的方法，包括在体细胞进行核重编程步骤前用含甲状腺激素T3的培养基培养体细胞2-4天，通过本发明方法能够提高诱导iPSC效率20-100倍，达到1.2%左右，并且缩短诱导周期至12-16天，同时诱导获得的iPSC不同克隆之间细胞形态、增殖能力、多潜能基因表达均一，能够用于人类疾病研究。
文档编号C12N5/10GK102093981SQ20101059384
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者何毅欣, 吴捷, 周向军, 周欣, 姜舒, 安钟姚, 徐亮, 李陶, 胡祥, 许笛, 陈梦飞 申请人:深圳市北科生物科技有限公司