体外筛选试验的制作方法

专利名称：体外筛选试验的制作方法
技术领域：
本发明属于筛选试验领域，用于鉴定治疗结缔组织在其中起作用的各种疾病，包括癌症和纤维化的分子。
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背景技术：
已有一些体外试验用于研究肿瘤发生和转移的诸多方面。也有一些体外模型系统用于研究化学诱导的纤维化。已证明胞外基质酶-赖氨酰氧化酶样蛋白_2(L0XL2)在这二种疾病过程中起着作用。参见，例如W02004/047720 (2004年6月10日)；US 2006/0127402(2006 年 6 月 15 日)；US 2009/0053224(2009 年 2 月 26 日)；US2009/0104201 (2009 年4 月 23 日);Kirschmann 等(2002) Cancer Research 62:4478-4483。因此，该赖氨酰氧化酶样-2酶代表了重要的治疗靶标。因此需要筛选L0XL2抑制剂的方法。发明简沭本文公开了用于各种体外试验以鉴定能有效阻断L0XL2促结缔织增生和纤维化活性的抑制剂的方法和组合物。因而，本发明提供以下及其他内容I. 一种鉴定L0XL2活性抑制剂的方法，所述方法包括a)提供在间质细胞存在下生长的内皮细胞共培养物；b)向该共培养物加入测试分子；和c)检测该共培养物的血管生成或血管发生；其中，与缺乏测试分子的共培养物相比，能减轻该共培养物中血管生成或血管发生程度的测试分子鉴定为L0XL2活性的抑制剂。2.如实施方式I所述的方法，其中所述内皮细胞是人内皮细胞。3.如实施方式2所述的方法，其中所述内皮细胞是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。4.如实施方式I所述的方法，其中所述间质细胞是人细胞。5.如实施方式I所述的方法，其中所述间质细胞是成纤维细胞。 6.如实施方式I所述的方法，其中所述测试分子是多肽。7.如实施方式6所述的方法，其中所述多肽是抗体。8.如实施方式7所述的方法，其中所述抗体是抗-L0XL2抗体。9.如实施方式I所述的方法，其中所述测试分子是核酸。
10.如实施方式9所述的方法，其中所述核酸是siRNA。11.如实施方式I所述的方法，其中所述测试分子是分子量低于1，000D的有机小分子。12.如实施方式I所述的方法，其中所述血管生成或血管发生程度降低由血管数目或密度减少证明。13.如实施方式I所述的方法，其中所述血管生成或血管发生程度降低由血管长度减少证明。14.如实施方式I所述的方法，其中所述血管生成 或血管发生程度降低由血管分支程度降低证明。15.如实施方式I所述的方法，其中所述血管生成或血管发生程度降低由⑶31水平降低证明。附图
简要说明图I是经50 u g/ml AB0023处理HUVEC的CD31表达染色代表图。图2是经20 ii M苏拉明处理HUVEC的⑶31表达染色代表图。图3是未处理HUVEC的⑶31表达染色代表图。图4是经2ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)处理HUVEC的⑶31表达染色代表图。发明详沭除非另有说明，本发明的实施采用本领域技能内的细胞生物学、毒理学、分子生物学、生物化学、细胞培养、免疫学、肿瘤学、重组DNA领域和相关领域的标准方法和常规技术。文献中有这类技术的描述可供本领域技术人员获得。例如，可参见Alberts，B等，“Molecular Biology of the cell (《细胞分子生物学》)”,第5版,加兰德科学出版社(Garland Science),纽约，2008 ;Voet, D 等，“Fundamentals of Biochemistry Life atthe molecular level (《生物化学原理分子水平生命》)”,第3版,新泽西州霍博肯的约翰威利父子出版社(John ffiley&Sons), 2008 ;Sambrook, J等,“分子克隆实验室手册”,第3版，冷泉港实验室出版社2001 ;AUSUbel，F等，“分子生物学现代方案”，纽约州的约翰威利父子出版社，1987 及其定期更新；Freshney, R. I. , “Culture of Animal Cells A manualof Basic Technique (《动物细胞的培养基础技术手册》)”，第4版，新泽西州萨默塞特的约翰威利父子出版社，2000和“Methods in Enzymology (《酶学方法》)”丛书,学术出版社(Academic Press),加利福尼亚州圣地亚哥。血管生成试验在某些实施方式中，L0XL2抑制剂的筛选依赖于其抑制L0XL2促血管生成的能力。参见，例如WO 02/11667。因此，在某些实施方式中，通过在体外血管生成试验中抑制血管生成的能力来鉴定某测试物质是否为L0XL2抑制剂。已有多种此类试验(参见，例如Ribatti和 Vacca (1999) Intl. J. Biol. Markers 14 :207-213)。现描述示例性试验。鸡尿囊绒膜鸡胚胎外尿囊绒膜可通过绒毛膜与尿囊膜的融合形成。它与蛋壳直接接触并含有厚的毛细血管网络。该试验可在卵中进行，该情形中在蛋壳上切一窗口以允许观察此膜。或者，取出鸡胚及其连带的膜至培养容器中而得以进行体外试验。参见，例如Auerbach等(1974)Devel. Biol. 41 :391_394，其全文通过引用纳入本文。这两种情形中，都将测试物质施用于该膜并观察和/检测其对血管生成的影响。在某些实施方式中，将测试物质在生物学惰性聚合物中给予该膜，所述聚合物能让测试物质受控地和/或持续地释放。这种聚合物的例子包括但不限于乙烯醋酸乙烯酯共聚物(如Elvax 40)和聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯聚合物(如hydron)。也可采用浸溃了测试物质的胶原凝胶或明胶海棉。参见，例如Nguyen 等，(1994)Microvascular Res. 47 :31-40 ；Ribatti 等，(1997) J. Vascular Res. 34 455-463 ;其全文通过引用纳入本文。已描述了对这种试验的修饰和改进。参见例如Parsons-Wingerter 等(2000)Arteriosclerosis Thrombosis Vase. Biol. 20 :1250-1256 ；Gonzalez-Iriate 等(2003) Angiogenesis 6 :251-254 ;Miller 等,(2004) J. TranslationalMed. 2 4 ;其全文通过引用纳入本文。对于描述该鸡尿囊绒膜试验的目的，也可参见Ribatti等(1996) Intl. J. Devel.Biol.40 1189-1197 ；Ribatti 等(2000)Curr.Pharmacol.Biotechnol. I :72-73 ；Richardson 和 Singh(2003)Curr. Drug Targets Cardiovasc. Hematol. Disorders 3: 155-185 和 Ribatti (2004) Leukemia 18 :1350_1351，其全文通过引用纳入本文。角膜袋试验在此试验中，将含有测试物质的缓释团粒植入在无血管家兔眼睛角膜基质中。测得的任何血管形成都是由于新形成的血管。参见，例如Hartwell (1998)Microcirculation5 :173-178 ；Presta 等(1999) Cancer Res. 59 :2417-2424 ；Ribatti 和 Vacca(1999)，同上；Morbidelli 和 Ziche (2004) Cancer Treatment Res. 117 :147-15,为描述这些基于角膜试验目的，将他们全文通过引用纳入本文。也描述了采用大鼠眼睛的类似试验。共培养人血管牛成试验该试验采用原代内皮细胞和原代成纤维细胞。测定在存在一种或多种测试物质时血管结构的产生。参见例如Beilmann等(2004)Cytokine26 :178-185，为描述人细胞共培养的目的，将其内容通过引用全文纳入本文。主动脉圈试验在此系统中，将主动脉(例如大鼠的)切成小圆圈并在例如纤维蛋白基质中培养。内皮细胞和/或平滑肌细胞从切片边缘移行产生放射状向外生长的微血管。参见，例如 Nicosia 和 Ottinetti (1990) Laboratory Investig. 63 :115-122 ；Nissanov 等(1995)Laboratory Investig. 73 :734-739 ；Blacher 等(2001)Angiogenesis 4133-142 ；Zhu和 Nicosia(2002)Angiogenesis 5 :81-86 ;Go 和 Owen(2003)Meth. Molec. Medicine 85:59-64，为描述主动脉圈试验的目的,将他们全文通过引用纳入本文。该试验也经调整用于小鼠主动脉和猪颈动脉。参见，例如Masson V Ve等(2002)Biol. Proc. Online 4 :24-31 ;Berger 等(2004)Microvascular Res. 68 :179-187 ;Stiffey-Wilusz等(2001) Angiogenesis 4 :3_9，为描述前述改进的目的,将它们全文通过引用纳入本文。在此试验的另一种改动一微型圈支持的凝胶(MRSG)试验中，将小鼠主动脉区段置于组装的三维胞外基质组装物中。在一种实施方式中，采用边缘有支撑例如尼龙网圈支撑的胶原(如I型胶原)的小凸镜状水凝胶。参见，例如Reed等(2007)MicrovascularRes. 73 =248-252,为描述该MRSG试验的目的，将其全文通过引用纳入本文。嗤齿动物肠系膜窗口
在此试验中，观察并检测噬齿动物(如大鼠)肠系膜生成新血管的活力，肠系膜是实际上无血管的器官。参见，例如 Norrby (1992) EXS61 =282-286 Jakobsson 等(1994) Intl.J. Exp. Pathology 75 :214-219,为描述肠系膜窗口试验的目的，将他们全文通过引用纳入本文。胎盘片段试验可利用包埋在纤维蛋白凝胶中的人胎盘血管片段来研究血管生成。参见。例如Brown 等(1996) Laboratory Investigation 75 :539-555,为描述胎盘片段试验的目的，将其全文通过引用纳入本文。基质胶栓试验将测试物质引入冷的人造基底膜-基质胶(Matrigel，加利福尼亚州圣何赛的BD生物科学公司(BD Biosciences))中，该胶在4°C时以液体形式存在。将其皮下注射入宿主动物(如小鼠、大鼠)导致该基质材料在体温下固化。可观察和检测宿主细胞渗透入该基质 栓及所导致的血管生成和血管发生。参见，例如Akhtar等(2002) ；Angiogenesis 5:75-80;Kragh 等(2003)Intl. J. Oncology 22 :305-311 ；Kragh 等(2004)Oncology Reportsll 303-307，为描述基质胶栓子试验的目的，将他们全文通过引用纳入本文。微型包裏细朐可采用移植入实验动物中的微型包裹细胞来研究血管生成过程。包裹采用的材料包括，例如藻酸盐珠、琼脂糖珠和明胶包裹微载体。参见，例如Nehls和Drenckhahn(1995)Microvascular Res. 50 :311-3322 ；Okada 等(1995) Japan. J. Cancer Res. 86 :1182-1188,为描述微型包裹细胞模型系统的目的，将他们全文通过引用纳入本文。定向体内血管牛成试验这些试验采用植入裸小鼠(即无胸腺小鼠)皮下的小硅酮圆柱体，植入后该圆柱体可将物质释放入周围组织。参见，例如Guedez等(2003)Am. J. Pathol. 162 =1431-1439,为描述此直接体外血管生成试验，将其全文通过引用纳入本文。皮下气囊樽型系统在此系统中，将空气注射入实验动物背部皮下形成气囊，产生呈半透明外观的无血管膜。可在植入细胞或测试物质后观察新血管的生成。参见，例如Lichtenberg等(1999)Am. J. Pharmacol. Toxicology 84 :34-40,为描述此皮下气囊模型系统的目的，将其全文通过引用纳入本文。水蛭系统医用水蛭已用作研究血管生成的模型系统。参见，例如de Eguileor等(2004)Current Pharmaceutical Design 10 :1979-1998,为描述水輕模型系统的目的,将其全文通过引用纳入本文。三维人肿瘤血管牛成试验在此试验中，将人肿瘤组织片段包埋在纤维蛋白凝胶中。血管从肿瘤组织长入该纤维蛋白凝胶中。参见，例如 Gulec 和 Woltering(2004)Ann. Surgical Oncology 11:99-104，为描述三维人肿瘤血管生成试验，将其全文通过引用纳入本文。可在Auerbach等(2003)Clinicalchemistry 49 :32_40和Norrby (2006) J. Cell.Mo I. Med. 10 :588-612中找到关于血管生成试验的其他信息，为描述血管生成试验，将其全文通过引用纳入本文。血管生成的标志本领域已知的新血管生成的形态学、分子和组化标志包括但不限于血管形成，⑶31表达(内皮细胞的标志)和血管假性血友病(von ffillebrand)因子(内皮细胞的标志)的表达。可利用这些标志任何一种或任何其它新血管生成标志的试验来测定血管发生的程度。侵入试验也可采用侵入/迁移试验来筛选L0XL2抑制剂，因为侵入和迁移能力的增强与上皮向间充质转变(EMT)相关。参见，例如Bedogni等(2004)Cancer Res. 64 :2552_2560。示范性侵入试验还包括，如博伊登室(Boyden chamber)。参见,例如Che n(2005)Methods Mol.Biol. 294 :15-22。在这些试验中，能降低细胞侵入性的测试分子可鉴定为L0XL2抑制剂。以内皮细胞为基础的试验血管生成是从已有的脉管系统产生新血管的多步过程。血管发生是由内皮细胞和相关的间质细胞如平滑肌细胞和毛细管外膜细胞(pericyte)迁移凝聚从头形成新血管的过程。血管生成或血管发生导致的血管形成是复杂过程，有许多事件起着作用，如胞外基质蛋白质水解、内皮细胞定向迁移、内皮细胞增殖、新胞外基质的沉积、管道形成和新形成血管的融合连接。体外血管生成试验采用在特定基质中与其他人细胞(如成纤维细胞)共培养的人内皮细胞(如人脐带静脉内皮细胞，HUVEC)。所述内皮细胞起初在培养基质中形成小岛，随后开始增殖进入移动期，此期间他们通过基质移行形成丝状细管结构。一些时间(如9-11天)后他们连接形成吻合细管的网络。因此，该试验概括了血管发生和血管生成体内过程的大多数方面。间质细胞在建立的本发明方法中，内皮细胞与间质细胞共培养。本领域已知有不同类型的基质细胞，即与结缔组织相关的或存在于其中的细胞，包括，例如成纤维细胞、毛细管外膜细胞、平滑肌细胞、间充质干细胞和周细胞。赖氨酰氧化酶型酶本文所用术语“赖氨酰氧化酶型酶”指能催化赖氨酸和羟基赖氨酸残基的e_氨基氧化脱氨基反应、导致肽基赖氨酸转变为肽基a-氨基己二酸-6-半醛(e -醛基赖氨酸)和释放化学计量的氨与过氧化氢的蛋白质家族成员。
II
00C=O
1I
Ch-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 +H2OCH-CH2-CH2-CH2-CH=O +NH3
I+€>2I+H2O7
NHNH
II
肽基赖氨酸肽基e-醛基赖氨酸
此反应大多数胞外发生在胶原蛋白和弹性蛋白中的赖氨酸残基上。e -醛基赖氨酸的醛残基有反应活性，能自发与其它e -醛基赖氨酸和赖氨酸残基缩合，导致胶原蛋白分子交联形成胶原纤维。已从鸡、大鼠、小鼠、牛和人提纯出赖氨酰氧化酶型酶。所有的赖氨酰氧化酶型酶含有共同的催化结构域，长约205个氨基酸，位于该蛋白质的羧基末端，并含有该酶的活性位点。该活性位点包含铜结合位点，其中包括含4个组氨酸残基的保守性氨基酸序列，这4个残基与铜(Cu(II)原子配位。该活性位点还包含赖氨酰酪氨酰醌(LTQ)辅因子，通过赖氨酸与酪氨酸残基(对应于大鼠赖氨酰氧化酶中的赖氨酸314和酪氨酸349，人赖氨酰氧化酶中的赖氨酸320与酪氨酸355)之间的分子内共价连接而形成。在赖氨酰氧化酶型酶中，形成LTQ辅因子周围的酪氨酸残基的序列也是保守的。该催化性结构域还包含10个保守性半胱氨酸残基，它们参与形成5个二硫键。该催化结构域也包含纤连蛋白结合域。最后，该催化性结构域中存在含4个半胱氨酸残基的类似于生长因子和细胞因子受体结构域的氨基酸序列。尽管存在这些保守性区域，仍可凭借其催化结构域内部和外部区域的核苷酸和氨基酸序列差异，区分不同的赖氨酰氧化酶型酶。
此酶家族中分离并特征鉴定的第一个成员是赖氨酰氧化酶(EC1. 4. 3. 13)，也称为蛋白-赖氨酸6氧化酶，蛋白-L-赖氨酸氧6-氧化还原酶(脱氨基)，或L0X。参见,例如 Harris 等，Biochim. Biophys. Acta341 :332-344 (1974) ；Rayton 等，J. Biol. Chem. 254 621-626(1979) ；Stassen, Biophys. Acta 438:49-60(1976)。随后发现了其它赖氨酰氧化酶型酶。将这些蛋白质称为“L0X-样”或“L0XL”。它们都含有上述的共同催化结构域和具有类似催化活性。目前已知人和小鼠中存在5种不同的赖氨酰氧化酶型酶L0X和4种LOX相关的或LOX-样蛋白=LOXLl (也称为“赖氨酰氧化酶样”、“L0XL”或“L0L”)，L0XL2 (也称为“L0R-1 ”)，L0XL3 (也称为“L0R-2”)和 L0XL4。编码这5种不同赖氨酰氧化酶型酶的基因各位于不同的染色体上。参见,例如Molnar等,BiochimBiophys Acta. 1647 :220-24(2003) ；Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70 1-32(2001) ；2001年11月8日公布的WO 01/83702和美国专利号6，300，092，所有上述文献纳入本文作参考。已分离得到了小鼠EC细胞系的称为LOXC的LOX-样蛋白质，其与L0XL4有某些相似但表达模式不同。Ito等(2001) J. Biol. Chem. 276 :24023-24029。已从果蝇分离得到2种赖氨酰氧化酶型酶DmL0XL-l和DmL0XL-2。虽然所有的赖氨酰氧化酶型酶都有共同的催化结构域，但它们也彼此不相同，特别是它们的氨基末端区域。与LOX相比，4种LOXL蛋白具有氨基末端延伸。因此，人的前原LOX(即切去信号序列前的初级翻译产物，见下文)含有417个氨基酸残基；而LOXLl含574个，L0XL2含638个，L0XL3含753个以及L0XL4含756个氨基酸残基。在氨基末端区，L0XL2、L0XL3和L0XL4包含4个富含半胱氨酸(SRCR)区的清道夫受体重复序列。这些区域在LOX和LOXLl中没有。SRCR区见于分泌性、跨膜或胞外基质蛋白中，已知其介导了一些分泌性蛋白和受体蛋白的配体结合。Hoheneste等(1999)Nat. Struct. Biol. 6 :228-232 ;Sasaki 等(1998)EMBO 1.17:1606-1613。除此种 SRCR 区夕卜，L0XL3的氨基末端区含核定位信号(肽)。富含脯氨酸的结构域看来是LOXLl独有的。Molnar等(2003) Biochim. Biophys. Acta 1647 :220_224。不同赖氨酸氧化酶型酶的糖基化模式也不同。
赖氨酰氧化酶型酶的组织分布也不同。人LOX mRNA在心脏、胎盘、睾丸、肺、肾脏和子宫中高表达，但在脑和肝脏中边缘表达。人LOXLl的mRNA在胎盘、肾脏、肌肉、心脏、肺和胰腺中表达，并与LOX类似在脑和肝脏中其表达水平低得多。Kim等(1995) J. Biol.Chem. 270 :7176_7182。在子宫、胎盘和其他器官中L0XL2mRNA表达水平高，但如同LOX和LOXLl那样在脑和肝脏中表达水平低。Jourdan Le-Saux等(1999) J. Biol. Chem. 74 12939 :12944。L0XL3mRNA在睾丸、脾脏和前列腺中高表达，胎盘中等表达，肝脏不表达，而肝脏中观察到有高水平的 L0XL4mRNA。Huang 等(2001)Matrix Biol. 20 :153-157 ；Maki和 Kivirikko (2001) Biochem. J. 355 :381-387 ; Jourdan Le-Saux 等(2001) Genomics 74:211-218 !Asuncion 等(2001)Matrix Biol. 20 :487-491 疾病时不同赖氨酰氧化酶型酶的表达和/或参与也不同。参见，例如Kagen (1994)Pathol.Res. Pract. 190 :910-919 ；Murawaki 等(1991)Hepatologyl41167-173 ；Siegel等(1978)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 :2945-2949 ;Jourdan Le-Saux 等(1994)Biochem.Biophys. Res. Comm. 199 :587-592 ；和 Kim 等(1999)J. Cell Biochem. 72 :181_188。赖氨酰氧化酶型酶也涉及一些癌症，包括头颈癌、膀胱癌、结肠癌、食管癌和乳房癌。参见，例如 Wu 等(2007)Cancer Res. 67 :4123-4129 ；Gorough 等(2007)J. Pathol. 212 :74-82 ；、Csiszar(2001)Prog. Nucl. Acid Res. 70 :1-32 和 Kirschmann 等(2002)Cancer Res. 62 4478-4483。因此，虽然赖氨酰氧化酶型酶在结构和功能上显示一些重叠，但也具有各自独特的结构和功能。例如就结构而言，某些抗LOX催化域的抗体不能结合L0XL2。就功能而言，据报导靶向删除LOX对分娩小鼠看来是致命的，而L0XL1缺陷不会引起严重的发育表型。Hornstra 等(2003) J. Biol. Chem. 278 :14387-4393 ;Bronson 等(2005)Neurosci.Lett. 390 :118-122。虽然赖氨酰氧化酶型酶最为广泛报道的活性是氧化细胞外胶原蛋白和弹性蛋白中的特定赖氨酸残基，但有证据表明赖氨酰氧化酶型酶也参与许多胞内过程。例如，报导说一些赖氨酰氧化酶型酶能调节基因表达。Li等(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12817-12822 ；Giampuzzi 等(2000) J. Biol. Chem. 275 :36341-36349。此外，报导 LOX 能氧化组蛋白Hl中的赖氨酸残基。LOX的其他胞外活性包括诱导单核细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞的趋化。Lazarus 等(1995)Matrix Biol. 14 :727-731 ;Nelson 等(1988)Proc. Soc.Exp. Biol. Med. 188 :346_352。LOX自身的表达由一些生长因子和类固醇，如TGF-P ,TNF-a和干扰素的诱导。Csiszar(2001)Prog. Nucl. Acid Res. 70:1-32。近年研究认为LOX在多种生物学功能，如调节发育、抑制肿瘤、细胞移动和细胞衰老中有其他作用。各种来源的赖氨酰氧化酶(LOX)蛋白的例子包括所含氨基酸序列与以下序列之一 EMBL/GenBank 登录号M94054 ；AAA59525. I-mRNA ；S45875 ；AAB23549. I-mRNA ；S78694 ；AAB21243. I-mRNA ；AF039291 ；AAD02130. I-mRNA ;BC074820 ；AAH74820. I-mRNA ;BC074872 ；AAH74872. I-mRNA ；M84150 ；AA59541. 1_基因组DNA所表达或翻译的多肽氨基酸序列基本上相同的酶。LOX的一种实施方式是人赖氨酰氧化酶(hLOX)前原蛋白。示例性公开的编码赖氨酰氧化酶型酶的序列如下以GenBank/EMBLBC015090 ；AAHl5090. I编号存放的mRNA所编码的L0XL1 ;以GenBank/EMBL U89942编号存放的mRNA所编码的 L0XL2 ;以 GenBank/EMBL AF282619 ；AAK51671. I 编号存放的 mRNA 所编码的 L0XL3 ；和以 GenBank/EMBL AF338441 ；AAK71934. I 编号存放的 mRNA 报编码的 L0XL4。LOX的初级翻译产物称为前原肽，其含有延伸的1-21氨基酸信号肽序列。在小鼠和人中，该信号序列都通过在Cys21与Ala22之间切割而胞内释放产生46_48kDa的LOX前肽形式，本文中也称为其全长形式。该前肽在通过高尔基体时被N-糖基化产生50kDa蛋白，然后分泌入胞外环境。在此阶段该蛋白无催化活性。进一步切割发生在小鼠LOX的Gly 168与Aspl69之间和人LOX的Glyl74与Aspl75之间，产生成熟的有催化活性的30_32kDa酶，并释放ISkDa前肽。由金属内切蛋白酶-前胶原蛋白C-蛋白酶，也称为骨形态发生蛋白-I(BMP-I)催化此最终切割。令人感兴趣的是，此酶也在LOX的底物一胶原蛋白的加工中起作用。随后基本去除N-糖基化单元。预计L0XL1、L0XL2、L0XL3和L0XL4潜在的信号肽切割位点在氨基末端。该预计的信号肽切割位点在LOXLl的Gly25与Gln26之间；L0XL2的Ala25与Gln26之间；L0XL3的Gly25 与 Ser26 之间；L0XL4 的 Arg23 与 Pro24 之间。已鉴定到LOXLl蛋白的一个BMP-I切割位点在Ser354与Asp355之间。Borel等(2001) J. Biol. Chem. 276 :48944_48949。根据前胶原蛋白和前LOX蛋白的BMP-1切割共有序列为Ala/Gly-Asp序列，已预测其他赖氨酰氧化酶型酶的潜在BMP-I切割位点常常后随有酸性或带电荷残基。预测L0XL3的BMP-I切割位点位于Gly447与Asp448之间；在此位点加工可产生大小类似于成熟LOX的成熟肽。还在L0XL4中鉴定出潜在BMP-I切割位点在残基 Ala569 与 Asp570 之间。Kim 等(2003) J. Biol. Chem. 278 :52071_52074。L0XL2 也可能类似于LOXL家族其他成员被蛋白水解切割和分泌。Akiri等..(2003) Cancer Res. 63 1657-1666。该前酶蛋白中活性位点所在的C-末端30kDa区域的序列高度(大约95% )保守。观察到该前肽结构域为适度保守(大约60-70% )。对于本文公开的目的，术语“赖氨酰氧化酶型酶”包括上述所有5种赖氨酰氧化酶型酶(L0X、L0XL1、L0XL2、L0XL3和L0XL4)，还包括基本上保留酶活性，如保留了催化赖氨酸残基脱氨基能力的LOX、LOXLl、L0XL2、L0XL3和L0XL4的功能片段和/或衍生物。通常，功能片段或衍生物保留至少50%的赖氨酸氧化活性。在某些实施方式中，功能片段或衍生物保留至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %，至少95 %，至少99 %或100 %的赖氨酸氧化活性。赖氨酰氧化酶型酶的功能性片段还意在包含不会实质性改变其催化活性的保守性氨基酸置换(就该天然多肽序列而言)。术语“保守性氨基酸置换”指依据某些共同结构和/或性质的氨基酸分组。就共同结构而言，氨基酸可分成无极性侧链组(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)；含不带电极性侧链组(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸和半胱氨酸)和含带电极性侧链组(赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸)。含芳族侧链的一组氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。脯氨酸、色氨酸和组氨酸中存在杂环侧链。在含无极性侧链的氨基酸组中，可区分为含短烃基侧链的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)与含较长非烃基 侧链的氨基酸(甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)。在含带电极性侧链的氨基酸组中，可区分为酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)与带碱性侧链的氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)。
明确各氨基酸有无共同性质的功能性方法是分析同源生物体的相应蛋白质之间氨基酸改变的标准化频率(Schulz, G. E.和 R. H. Schirmer, “Principles of ProteinStructure (《蛋白质结构原理》)”，Springer-Verlag, 1979)。按照此种分析定义各组氨基酸，在同源蛋白质中优选组内氨基酸彼此置换，因此对整个蛋白质结构具有相似作用(Schulz,G. E.和 R. H. Schirmer, “蛋白质结构原理”,施普林格出版社(Springer-Verlag),1979)。按照这种分析，经鉴定可保守性彼此置换的氨基酸有以下各组(i)含带电荷基团的氨基酸,包括Glu、Asp、Lys、Arg和His ;(ii)含正电荷基因的氨基酸，包括Lys、Arg和His ；(iii)含负电荷基团的氨基酸，包括Glu和Asp ；(iv)含芳族基团的氨基酸，包括Phe、Try和Trp ； (v)含氮环基团的氨基酸，包括His和Trp ；(vi)含大的脂肪族非极性基团的氨基酸，包括Val、Leu和Ile ；(vii)含轻微极性基团的氨基酸，包括Met和Cys ；(viii)含小残基基团的氨基酸,包括 Ser、Thr> Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln 和Pro ；(ix)含脂肪族基团的氨基酸，包括￥&1、1^11、116^的和078，以及(X)含羟基氨基酸，包括Ser和Thr。因此，如以上示例，本领域技术人员知道氨基酸的保守性置换并能常规进行这种置换而不改变所得分子的生物学活性。本领域技术人员也知晓，多肽的非关键区域中单个氨基酸置换通常不会实质性改变其生物学活性。参见，例如Watson等，“Molecular Biologyof the Gene (《基因的分子生物学》)”，第4版，1987，加利福尼亚州门洛帕克的本杰明/卡明斯出版公司(The Benjamin/Cummings Pub. Co.), 224 页。关于赖氨酰氧化酶型酶的其他信息可参见，例如Rucker等(1998)Am. J. Clin.Nutr. 67 996S-1002S 和 Kagan 等(2003) J. Cell. Biochem 88 :660_672。也可参见共有的美国专利申请公开号2009/0053224(2009年2月26日)和2009/0104201 (2009年4月23日)，其全文通过引用纳入本文。赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂包括激活剂(激动剂)和抑制剂(拮抗剂)，可用各种筛选试验来选择。本文提供的一些体外试验可用于鉴定一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的活性调节剂。在其他实施方式中，可通过测定某测试化合物是否结合赖氨酰氧化酶型酶来鉴定调节剂；其中，如果发生结合，该化合物是候选调节剂。任选可对这种候选调节剂进行其它试验。或者，可使候选化合物接触赖氨酰氧化酶型酶，并检测赖氨酰氧化酶型酶的生物学活性；能改变赖氨酰氧化酶型酶生物学活性的化合物就是赖氨酰氧化酶型酶的调节剂。通常能降低赖氨酰氧化酶型酶生物学活性的化合物是该酶的抑制剂。鉴定赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂的其它方法包括将候选化合物在含有一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的细胞培养物中孵育，并检测所述细胞的一种或多种生物学活性或特征，能改变所述细胞在培养物中的生物学活性或特征的化合物就是赖氨酰氧化酶型酶活性的潜在调节剂。可检测的生物学活性包括，例如氧化赖氨酸、生成过氧化物、生成氨、改变赖氨酰氧化酶型酶的水平、改变编码赖氨酰氧化酶型酶的mRNA水平、和/或改变赖氨酰氧化酶型酶的一种或多种特异性功能。在上述试验的其他实施方式中，不接触候选化合物时一种或多种生物学活性或细胞特征与一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的水平或活性相关联。例如，所述生物学活性可以是细胞功能，例如迁移、趋化、表皮向间充质转换或间充质向表皮转换，可通过与一种或多种对照样品或参比样品作比较检测这种改变。例如，阴性对照样品可包括加入候选化合物的具有降低水平赖氨酰氧化酶型酶的培养物；或者，与测试培养物具有相同量赖氨酰氧化酶型酶但不加入候选化合物的培养物。在一些实施方式中，使含有不同水平赖氨酰氧化酶型酶的各培养物与候选化合物接触。如果观察到生物学活性改变，并且如果这种改变在含有较高水平赖氨酰氧化酶型酶的培养物中更大，可将该化合物鉴定为赖氨酰氧化酶型酶活性的调节剂。确定某化合物是否是赖氨酰氧化酶型酶的激活剂或抑制剂可以从该化合物所诱导的表型看出，或可能需要进一步的试验，如检测该化合物对一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的酶活性影响的试验。本领域已知获得赖氨酰氧化酶型酶的生物化学或重组方法，以及如上所述细胞培养和酶试验以鉴定赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂的方法。也可参见与本申请同日提交的题名“赖氨酰氧化酶和L0XL2的催化结构域”的共有美国专利申请，其代理人案卷号为ARBS-O10。 有许多不同的方法可检测赖氨酰氧化酶型酶的酶活性。例如，可通过检测和/或定量测定产生的过氧化氢、氨离子和/或醛，检测赖氨酸氧化和/或胶原蛋白交联，或检测细胞侵入能力、细胞粘附、细胞生长或转移性生长，来检测赖氨酰氧化酶的酶活性。参见，例如 Trackman 等(1981) Anal. Biochem. 113 :336-342 ；Kagan 等(1982)Meth. Enzymol. 82A 637-649 ；PaIamakumbura 等(2002)Anal. Biochem. 300 :245-251 ；Albini 等(1987)CancerRes. 47 :3239-3245 ；Kamath 等(2001)Cancer Res. 61 :5933-5940 ;美国专利号 4，997，854和美国专利申请公布号2004/0248871。测试化合物包括但不限于，例如，有机小化合物(如分子量约50-2，500Da之间的有机分子)、核酸或蛋白质。这种化合物或这些化合物可化学合成或用微生物学方法产生和/或包含在例如样品，如植物、动物或微生物的细胞提取物中。还有，这种化合物或这些化合物可以是本领域已知但迄今不知能否调节赖氨酰氧化酶型酶活性的化合物。检测赖氨酰氧化酶型酶调节剂试验的反应混合物可以是无细胞提取物或可包含细胞培养物或组织培养物。可将多种化合物加到反应混合物中，再加到培养基中，注射入细胞或给予转基因动物。试验所用的细胞或组织可以是，例如细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、灵长动物细胞、人细胞，或可以包含或获自非人转基因动物的细胞。本领域技术人员知道有一些方法可用于产生和筛选大文库以鉴定对靶标，如赖氨酰氧化酶型酶具有特异性亲和力的化合物。这些方法包括噬菌体展示方法，其中，噬菌体展示随机化的肽并用固定化受体进行亲和层析筛选。参见，例如WO 91/17271、WO 92/01047和美国专利5，223，409。在另一方法中，用光刻技术合成固定在固体支持物(例如“芯片”)上的聚合物组合文库。参见。例如美国专利5，143,854 ;W0 90/15070和W092/10092。使固定后的聚合物接触带标记受体(如赖氨酰氧化酶型酶)并扫描所述支持物以确定标记的位置，从而鉴定能结合该受体的聚合物。已描述在连续的纤维素膜支持物上合成并筛选肽文库可用来来鉴定感兴趣多肽(如赖氨酰氧化酶型酶)的结合配体，例如见Kramer (1998)Methods Mol. Biol. 87 :25_39。这种试验所鉴定的配体是感兴趣蛋白质的候选调节剂，可挑选出作进一步测试。例如，也可用此法测定感兴趣蛋白质中的结合位点和识别基序。参见，例如Rudiger (1997)EMBO J. 16 1501-1507 和 Weiergraber(1996)FEBS Lett. 379 :122_126。WO 98/25146描述了筛选复合体文库中具有所需性能，如能激动、结合、或拮抗多肽或其细胞受体的化合物的其他方法。此种文库中的复合体包含测试化合物、记录这种化合物合成中至少一步的标签和对易被受体分子修饰的系留部分(tether)。利用该系留部分的修饰来显现复合体包含有具有所需性能的化合物。可解码所述标签以揭示这种化合物合成中的至少一步。鉴定能与赖氨酰氧化酶型酶相互作用的化合物的其他方法，例如有噬菌体展示系统的体外筛选法、滤膜结合试验和利用如BIAcore装置(法玛西亚公司(Pharmacia))对相互作用作“实时”检测。
所有这些方法可按本发明用来鉴定赖氨酰氧化酶型酶或相关多肽的激活剂/激动剂及抑制剂/拮抗剂。合成赖氨酰氧化酶型酶调节剂的另一种方法是采用肽的模拟类似物。可通过，例如用立体异构体即D-氨基酸取代天然氨基酸来产生肽的模拟类似物；参见，例如Tsukida(1997) J. Med. Chem. 40 =3534-3541 此外，可将这种前-模拟化合物掺入到肽中以重建因原先多肽的一部分被去除而丧失的构象性能。参见，例如Nachman(1995)Regul.Pept. 57 :359_370。构建肽模拟物的另一种方法是在肽中掺入无手性的0-氨基酸残基，导致酰胺键被脂肪族链的聚甲烯单元取代。Banerjee (1996) Biopolymers39 :769-777。已描述了其他系统中小肽激素的超活性肽基模拟类似物。Zhang(1996)Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 327-331。也可通过连续的酰胺烷基化合成模拟肽组合文库，随后检测所得化合物，例如其结合性能和免疫学性质，来鉴定赖氨酰氧化酶型酶调节剂的肽模拟物。产生和利用肽基模拟物组合文库的方法已有描述，参见，例如Ostresh, (1996)Methods in Enzymology 267 220-234 和 Dorner (1996) Bioorg. Med. Chem. 4 :709_715。另外，可利用一种或多种赖氨酰氧化酶型酶的三维结构和/或晶体结构来设计一种或多种赖氨酰氧化酶型酶活性的模拟肽抑制剂。Rose (1996) Biochemistry 35 :12933-12944 ； Rutenber (1996) Bioorg. Med.Chem. 4 :1545-1558。对基于结构设计和合成模拟天然生物学多肽活性的低分子量合成分子有进一步描述，例如 Dowd(1998)Nature Biotechnol. 16 190-195 ；Kieber-Emmons(1997)CurrentOpinion Biotechnol8 :435-441 ；Moore(1997)Proc. West Pharmacol. Soc. 40 115-119 ；Mathews (1997)Proc. West Pharmacol.Soc. 40 :121-125 和 Mukhija(1998) EuropeanJ. Biochem. 254 :433_438。本领域技术人员还熟知，能设计、合成和评价有机小化合物，例如可作为赖氨酰氧化酶型酶的底物或配体的模拟物。例如，已描述了海帕洛素(hapalosin)的D-葡萄糖模拟物，它与海帕洛素在拮抗细胞毒性中多药耐药性辅助相关蛋白上具有相似效力。Dinh (1998) J. Med. Chem. 41 :981_987。可通过研究赖氨酰氧化酶型酶的结构来指导选择调节剂，例如小分子、肽、肽模拟物和抗体。赖氨酰氧化酶型酶的结构性质可能有助于鉴定能结合赖氨酰氧化酶型酶，或作为其配体、底物、结合伴侣或受体起作用的天然或合成分子。参见，例如Engleman (1997)J.Clin. Invest. 99 :2284_2292。例如，可采用合适的计算机程序进行赖氨酰氧化酶型酶结构基序的折叠模拟和计算机重新设计。Olszewski (1996)Proteins 25 :286-299 ；Hoffman (1995) Comput. AppI. Biosci. 11 :675-679。对蛋白质折叠的计算机模拟可用于肽和蛋白质细微结构的构象和能量分析。Monge (1995) J. Mol. Biol. 247 =995-1012 ；Renouf (1995) Adv. Exp. Med. Biol. 376 :37_45。可用合适的程序鉴定赖氨酰氧化酶型酶上与配体和结合伴侣相互作用的位点，用计算机辅助搜索互补的肽序列。Fassina (1994)Immunomethods 5 :114-120。例如，在 Berry(1994)Biochem. Soc. Trans. 22 1033-1036 ；Wodak(1987),Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 :1-13 和 Pabo (1986)Biochemistry 25 :5987-5991 中描述了蛋白质和肽设计的其他系统。上述结构分析得到的结果可用于，例如制备具有一种或多种赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂功能的有机分子、肽和肽模拟物。赖氨酰氧化酶型酶的抑制剂可以是竞争性抑制剂、无竞争性抑制 剂、混合抑制剂或非竞争性抑制剂。竞争性抑制剂通常含有与底物相类似的结构，常结合于活性位点，在底物浓度低时更有效。存在竞争性抑制剂时表观Km升高。无竞争性抑制剂通常结合于酶-底物复合物，或底物结合于活性位点后暴露的位点并且可能使活性位点变形。存在无竞争性抑制剂时表观为Km和Vmax均降低，底物浓度对抑制几乎或完全无作用。混合抑制剂能结合游离酶和酶-底物复合物，从而影响底物的结合和催化活性。非竞争性抑制剂是混合抑制的特殊例子，其中该抑制剂以相等的亲合力结合酶和酶-底物复合体，而底物浓度不影响抑制。非竞争性抑制剂通常结合于酶活性位点以外的区域。关于酶抑制的其他细节可参见，例如Voet等(2008)司上。对于赖氨酰氧化酶类型酶之类的酶，其天然底物(如胶原蛋白、弹性蛋白)在体内通常以极大过量存在(与任何抑制剂在体内能实现的浓度相比)，这种非竞争性抑制剂具有优点，因为其抑制不依赖于底物浓度。抗体在某些实施方式中，赖氨酰氧化酶型酶的调节剂是抗体。在另一些实施方式中，抗体是赖氨酰氧化酶型酶活性的抑制剂。本文所用术语“抗体”指分离的或重组的多肽结合剂，它们含有能特异性结合抗原表位的肽序列(如可变区序列)。该术语采用其最广泛含义，具体覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、纳米抗体(nanobodies)、双抗体(diabodies)、多特异性抗体(如双特异性抗体)和抗体片段，包括但不限于Fv、scFv、Fab、Fab'、F(ab' )2和Fab2，只要他们显示所需的生物学活性。术语“人抗体”指含有人来源序列的抗体，除了可能含有非人的CDR区域外，且并不意味着存在免疫球蛋白分子的全部结构，而是这种抗体对人只有最微小的免疫原性作用(即不会诱导产生对其自身的抗体)。“抗体片段”包括全长抗体的一部分，例如全长抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata等(1995)Protein Eng. 8(10) :1057-1062);单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜酶消化抗体产生二个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段(各含一个抗原结合位点)；和残留的“Fe”片段，此名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白处理产生一个F(ab' )2片段，它有二个抗原结合位点，仍能交联抗原。“Fv”是含有完全的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由一条重链和一条轻链的可变区以非共价紧密缔合组成。在其构型中二条链可变区的各三个CDR相互作用界定了二聚体表面上的抗原结合位点。6个CDR —起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，甚至一个可变区(或只包含这6个抗原特异性⑶R其中3个⑶R的分离Vh或 '区，)就能识别和结合抗原，虽然亲和力通常低于完整的Fv片段。“Fab”片段除含重链和轻链可变区外还含有轻链恒定区和重链第一恒定区(CHl)。Fab片段最初见于抗体用木瓜酶消化之后。Fab'片段与Fab片段不同处在于F(ab')片段的重链CH1区羧基末端多几个残基，包含了抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab' )2片段含有在接近其绞链区处以二硫键相连的二个Fab片段，最初见于用胃蛋白酶消化抗体之后。本文中Fab' -SH是对Fab'片段的命名，此片段恒定区的半胱氨酸残基带有游离巯基。也已知道其它化学偶联的抗体片段。任何脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区氨基酸的序列指定、为二种明确不同的类型，称为K和\轻链。根据重链恒定区的氨基酸序列可将免疫球蛋白分成5种主要类型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分成亚类(同种型)，如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2。“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段包含抗体Vh和\区，这些区位于一条多肽链中。在一些实施方式中，Fv多肽还包含VH与VL区之间的多肽接头使sFv能形成抗原结合所需的结构。对于sFv的综述可参见Pluckthun,收录在“The Pharmacology of MonoclonalAntibodies (《单克隆抗体的药理学》)”第113卷(Rosenburg和Moore主编),纽约施普林格出版社，269-315页(1994)。术语“双抗体”指含二个抗原结合位点的小抗体片段，其重链可变区(Vh)与轻链可变区(')连接在同一条多肽链中(Vh-VJ。所用的接头短到不允许同一链中2个区域配对而迫使其与另一条链的互补区配对，从而产生2个抗原结合位点。双抗体的其他描述可参见，例如 EP 404,097 ;TO93/11161 和 Hollinger 等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448。“分离的”抗体是经过鉴定并与其天然环境组分相分离的和/或回收的抗体。其天然环境组分可包含酶、激素和其他蛋白质或非蛋白溶质。在某些实施方式中，分离的抗体被纯化至(I)用罗氏蛋白定量法测定抗体的重量比大于95%，例如重量比大于99%; (2)足以用例如转杯式测序仪获得N-末端序列或内部氨基酸序列的至少15个残基的纯度；或(3)用凝胶电泳(如SDS-PAGE)在还原或非还原条件下，以考马氏兰或银染色检测已纯化至均一。术语“分离的抗体”包括重组细胞中的原位抗体，因为其中缺少抗体天然环境的至少一种组分。在某些实施方式中，用至少一个纯化步骤制备分离的抗体。在某些实施方式中，所述抗体是人源化抗体或人抗体,人源化抗体包括人免疫球蛋白(受者抗体)，其中源自受者抗体的互补决定区(CDR)残基被具有所需特异性、亲和力和性能的非人动物如小鼠、大鼠或家兔(供者抗体)的CDR残基取代。因此，人源化形式的非人(如鼠)抗体是嵌合的免疫球蛋白，其含有最少量的非人免疫球蛋白序列。所述非人序列主要位于可变区，特别是互补决定区(CDR)中。在一些实施方式中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基所取代。人源化抗体也可含有受者抗体或输入的CDR序列或框架序列中所没有的残基。在某些实施方式中，人源化抗体含有至少一个，通常二个可变区的基本全部，其中所有或基本所有的CDR(序列)对应于非人免疫球蛋白的CDR(序列)，而所有或基本所有的框架区为人免疫球蛋白的共有序列。对于本发明的目的，人源化抗体也可包括免疫球蛋白片段，如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2片段或其他抗原结合子序列。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分(Fe)。参见。例如 Jones 等(1986)Nature 321 :522-525 ;Riechmann 等(1988)Nature332 :323-329 和 Presta(1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596。本领域知道使非人抗体人源化的方法。通常，人源化抗体含有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为“输入”或“供体”残基，通常获自“输入”或“供体”抗体的可变区。例如，可基本上按照Winter及其伙伴的方法，用啮齿类的CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列进行人源化。参见,例如Jones等，同上；Riechmann等，同上和Verhoeyen等(1988) Science 239:1534-1536。因此，这种“人源化”抗体包括嵌合抗体(美国专利4，816，567号)，其中基本上少于完整人可变区的序列被非人物种的相应序 列取代。在某些实施方式中，人源化抗体是人抗体，其中一些CDR残基和可选的一些框架区残基被啮齿类抗体(如鼠单克隆抗体)相应位点的残基所取代。人抗体也可通过，例如用曬菌体展示文库产生。Hoogenboom等(1991) J. Mol.Biol,227 381 ；Marks 等(1991)J. Mol. Biol. 222 :581。Cole 等(1985) “MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy (《单克隆抗体和癌症治疗》)”ARL出版社(Alan R. Liss),77页和Boerner等(1991) J. Immunol. 147 :86-95描述了制备人单克隆抗体的其他方法。可通过将人免疫球蛋白的基因座引入其内源性免疫球蛋白基因已部分或全部灭活的转基因动物(如小鼠)中制备人抗体。受免疫攻击时观察到生成人抗体，它在所有方面非常类似于在人体中所见，包括基因重排、装配和抗体谱。例如，在美国专利5，545，807 ；5，545，806 ;5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;5，661，016 和以下科学出版物Marks 等(1992)Bio/TechnologylO :779-783 (1992) ；Lonberg 等(1994)Nature 368:856-859;Morrison(1994)Nature 368 :812-813 ;Fishwald 等(1996)Nature Biotechnology 14:845-851 ；Neuberger (1996)Nature Biotechnology 14 :826 和 Lonberg 等(1995)Intern.Rev. Immunol. 13 :65-93 中描述了这种方法。可如上所述采用已知的选择和/或诱变方法使抗体的亲和力成熟。在一些实施方式中，亲和力成熟抗体的亲和力，比用以制备该成熟抗体的起始抗体(通常是鼠、兔、鸡、人源化或人抗体)高5倍或更高、高10倍或更高、高20倍或更高、或高30倍或更高。抗体也可以是双特异性抗体。双特异性抗体可以是对至少2种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，且可以是人或人源化抗体。在本情况中，2种不同的结合特异性可针对2种不同的赖氨酰氧化酶型酶,或针对一种赖氨酰氧化酶型酶的2个不同表位。本文所述的抗体也可以是免疫偶联物。这种免疫偶联物包含与第二分子，如与报告分子偶联的抗体(如抗赖氨酰氧化酶型酶的抗体)。免疫偶联物也可包含与细胞毒剂，如化疗制剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物来源的有酶活性的毒素或其片段)、或放射性同位素偶联(即放射性偶联剂)的抗体。与特定多肽或特定多肽上的某表位“特异性结合”或“有特异性”的抗体，指能结合该特定多肽或表位而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位的抗体。在一些实施方式中，约4°C、25°C、37°C或42°C温度时测得本发明的单克隆形式抗体、scFv、Fab或其他形式抗体特异性结合其靶抗原的解离常数(Kd)等于或低于lOOnM，可选低于10nM，可选低于InM，可选低于0. 5nM，可选低于0. InM，可选低于0. OlnM，或可选低于0. 005nM。在某些实施方式中，本发明的抗体能结合赖氨酰氧化酶型酶的一处或多处加工位点(如蛋白水解切割位点)，从而有效地阻断其前酶或前原酶被加工成催化活性酶，从而降低赖氨酰氧化酶型酶的活性。在某些实施方式中，本发明的抗体结合人LOX的结合亲和力比其与其他赖氨酰氧化酶型酶，如L0XL1、L0XL2、L0XL3和L0XL4的结合亲和力高，例如高10倍，至少高100倍，或甚至至少高1000倍。在另一些实施方式中，本发明的抗体结合人L0XL2的结合亲和力比其与其他赖氨 酰氧化酶型酶，如LOX、LOXL I、L0XL3和L0XL4的结合亲和力高，例如高10倍，至少高100倍，或甚至至少高1000倍。在某些实施方式中，本发明的抗体是赖氨酰氧化酶型酶催化活性的非竞争性抑制剂。在某些实施方式中，本发明的抗体结合在赖氨酰氧化酶型酶催化域之外。在某些实施方式中，本发明的抗体结合L0XL2的SRCR4域。在某些实施方式中，结合L0XL2的SRCR4域并具有非竞争性抑制剂功能的抗-L0XL2抗体是共有的美国专利申请公开号US 2009/0053224和US 2009/0104201中所述的AB0023抗体。在某些实施方式中，结合L0XL2的SRCR4域并具有非竞争性抑制剂功能的抗-L0XL2抗体是共有的美国专利申请公开号US 2009/0053224和US 2009/0104201中所述的AB0024抗体。本发明的抗体可选不仅结合赖氨酰氧化酶型酶而且减少或抑制赖氨酰氧化酶型酶的摄取或内化，例如通过整联蛋白P I或其他细胞受体或蛋白质。例如，这种抗体能结合胞外基质蛋白、细胞受体和/或整联蛋白。在共有的美国专利申请公开号US 2009/0053224和US 2009/0104201中提供了能识别赖氨酰氧化酶型酶的示范性抗体，和关于抗赖氨酰氧化酶型酶抗体的其它内容，为了描述抗赖氨酰氧化酶型酶的抗体、其制备方法和用途，将上述专利申请全文通过引用纳入本文。调节赖氨酰氧化酶型酶表达的多核苷酸赖氨酰氧化酶型酶的调节(如抑制)可通过在转录或翻译水平下调赖氨酰氧化酶型酶的表达而实现。一种此类调节方法涉及采用能序列特异性结合编码赖氨酰氧化酶型酶的mRNA转录物的反义寡核苷酸或多核苷酸。反义寡核苷酸(或反义寡核苷酸类似物)结合靶mRNA分子可导致胞内RNA酶H切割该杂交体。某些情况下反义RNA-mRNA杂交体的形成可能干扰正确剪接。这两种情况都减少或消除了适合翻译的完整、功能性靶mRNA的数量。在其他情况下，反义寡核苷酸或寡核苷酸类似物结合靶mRNA分子能妨碍(如通过空间位障)核糖体结合，从而防止mRNA翻译。反义寡核苷酸可含有任何类型的核苷酸亚基，例如，它们可以是DNA、RNA、类似物如肽核酸(PNA)或上述物质的混合物。RNA寡核苷酸能与祀mRNA分子形成较稳定的双链体，但未杂交的寡核苷酸在胞内稳定性低于其他类型的寡核苷酸或寡核苷酸类似物。可通过利用为此目的设计的载体在细胞内表达这些RNA寡核苷酸来缓解其不稳定性。例如，当试图靶向编码丰富且长寿命蛋白质的mRNA时可采用此种方法。设计反义寡核苷酸时要考虑的其他事情包括(i)与靶序列结合的充分特异性；
(ii)可溶性；(iii)抵御胞内和胞外核酸酶的稳定性；(iv)穿透细胞膜的能力；和(v)当用于治疗生物体时的低毒性。可得到用于鉴定对靶mRNA具有最高预测结合亲和力的寡核苷酸序列的算法，根据说明靶mRNA和这种寡核苷酸二者结构改变时能量变化的热动力学循环来鉴定。例如Walton 等(1999)Biotechnol. Bioeng. 65 :1_9 用这种方法设计了针对兔 ￠-球蛋白(RBG)和小鼠肿瘤坏死因子-a (TNFa)转录物的反义寡核苷酸。同一研究小组还报导证明合理选出的针对三种模型靶mRNA (人乳酸脱氢酶A和B及大鼠gpl30)的寡核苷酸在细胞培养中的反义活性在几乎所有情况中均有效。这包括采用含磷酸二酯和硫代磷酸酯化学物制备的寡核苷酸针对两类细胞中的三种不同靶分子的试验。
此外，已有多种方法采用体外系统设计和预测特定寡核苷酸效力。参见，例如Matveeva 等(1998)Nature Biotechnology 16:1374-1375。本发明所述的反义寡核苷酸包括含有至少10个核苷酸，例如10-15个、15-20个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少22个、至少25个、至少30个、或甚至至少40个核苷酸的多核苷酸或多核苷酸类似物。这种多核苷酸或多核苷酸类似物在体内在生理条件下能与编码赖氨酰氧化酶型酶，如LOX或L0XL2的mRNA退火或杂交(即基于碱基互补形成双链体结构)。本发明所述的反义寡核苷酸可由给予细胞或组织的核酸构建物表达。这种反义序列的表达可选受可诱导启动子的调控，使得可在细胞或组织中打开和关闭反义序列的表达。或者可化学合成反义寡核苷酸并将其直接给予细胞或组织，例如作为药物组合物的一部分。反义技术已导致产生高精确度反义设计算法和广泛的各种各样寡核苷酸递送系统，从而使该领域普通技术人员能够设计出并执行适合于下调已知序列表达的反义方法。关于反义技术的其它信息可参见，例如Lichtenstein等,“Antisense Technology APractical Approach (《反义技术,实践方法》)”,牛津大学出版社，1998。小RNA 和 RNAi抑制赖氨酰氧化酶型酶活性的另一种方法是RNA干扰(RNAi)，此法采用与靶mRNA同源并导致其降解的双链小干扰性RNA(siRNA)分子。Carthew(2001)Curr. Opin. Cell.Biol. 13 :244-248oRNA干扰通常为两步过程。在称为起始步骤的第一步中，输入的dsRNA被消化成含21-23个核苷酸的小干扰性RNA (siRNA)，这可能是通过双链-特异性核糖核酸酶RNA酶III家族成员Dicer酶的作用，以ATP-依赖方式切割双链RNA完成。输入的RNA可直接递送或通过转基因或病毒递送。后续的切割将RNA降解成19-21bp的双链体(siRNA)，各带有2-核苷酸的 3’悬垂。Hutvagner 等(2002) Curr. Opin. Genet. Dev. 12 :225-232 ；Bernstein (2001)Nature 409 :363_366。在第二步效应器步骤中，siRNA双链体结合核酸酶复合体形成RNA-诱导的沉默复合体(RISC)。活化RISC需要siRNA双链体的ATP依赖性解旋。活性RISC(含单个siRNA和RNA酶)然后通过碱基配对相互作用靶向同源转录物，并通常从siRNA的3’末端开始将mRNA 切成约 12 个核苷酸的片段。Hutvagner 等，同上；Hammond 等(2001)Nat. Rev. Gen. 2 110-119 ；Sharp (2001) Genes. Dev. 15 :485_490。RNAi 和相关方法在 Tuschl (2001)Chem. Biochem. 2 :239-245 ；Cullen(2002)Nat.Immunol. 3 :597-599 和 Brantl (2002) Biochem. Biophys. Acta. 1575 :15-25 中也有描述。合成适合用于本发明作为赖氨酰氧化酶型酶活性抑制剂的RNAi分子的示范性策略，是扫描起始密码子下游适当mRNA序列的AA 二核苷酸。记录每个AA和下游(即3’毗连)的19个核苷酸作为潜在的siRNA靶位点。优选编码区中的靶位点，因为结合于mRNA非翻译区(UTR)和/或翻译起始复合体的蛋白质可能干扰siRNA内切核酸酶复合体的结合。Tuschl (2001)同上。但应理解，针对非翻译区的siRNA也可能有效，因为已证明针对GAPDH基因5’UTR的siRNA介导了细胞GAPDH mRNA降低约90%并完全消除其蛋白质水平(安碧公司(Ambion)，德克萨斯州奥斯汀)。一旦如上所述获得潜在的靶位点组，就可利用序列比对软件(如获自NCBI的BLAST软件)将该组靶位点的序列与适当的基因组数据库(例如，人、小鼠、大鼠等)作比较。淘汰显示与其他编码序列明显同源的潜在靶位点。选择合格的靶序列作为siRNA合成的模板。选出的序列可包括G/C含量低的序列，因为已证明这些序列介导基因沉默比G/C含量高于55%的序列更有效。可沿着靶基因的长度选择若干靶位点进行评价。为更好地评价所选siRNA，应联用阴性对照。阴性对照siRNA可包括与测试siRNA核苷酸组成相同但与基因组缺乏显著同源性的序列。因此，例如可采用siRNA的乱序核苷酸序列，只要它不显示与任何其它基因有任何显著的同源性。本发明的siRNA分子可转录自一旦引入宿主细胞就能促进稳定表达该siRNA转录物的表达载体。可工程改造这些载体而表达小发夹RNA(shRNA)，再经体内加工成为能进行基因特异性沉默的siRNA分子。参见，例如fcummelkamp等(2002) Science 296 :550-553 ；Paddison 等(2002)Genes Dev. 16 :948-958 ；Paul等(2002)Nature Biotech. 20 :505-508 ；Yu 等(2002)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 :6047_6052。 小发夹RNA(shRNA)是单链多核苷酸，能形成双链发夹环结构。双链区由第一序列和第二序列形成，所述第一序列与靶序列，如编码赖氨酰氧化酶型酶的多核苷酸(如LOX或L0XL2mRNA)杂交，所述第二序列与该第一序列互补。所述第一和第二序列形成双链区；同时位于第一与第二序列之间的未配对碱基接头核苷酸形成发夹环结构。shRNA的双链区(茎)可包含限制性内切核酸酶识别位点。shRNA分子可任选具有核苷酸悬垂如2-bp悬垂，例如3’UU_悬垂。尽管可以有变化，但茎长度范围通常为约15-49bp、约15-35bp、约19-35bp、约21_31bp，或约21_29bp ;环大小的范围约4-30bp，例如约4-23bp。为了在细胞内表达shRNA，可采用含有启动子(如RNA聚合酶IIIHl-RNA启动子或U6RNA启动子)、供插入shRNA编码序列的克隆位点和转录终止信号(如4_5个腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对伸展序列)的质粒载体。聚合酶III启动子一般含有明确的转录起始和终止位点，其转录物缺乏聚A尾。这些启动子的终止信号为聚胸苷区段，通常在第二个编码的尿苷之后切断转录物。表达的shRNA在此位置被切断产生3’UU悬垂，类似于合成的siRNA的3’悬垂。在哺乳动物细胞中表达shRNA的其他方法在前文引用的参考文献中有所描述。合适的shRNA表达载体的一个例子是pSUPER (华盛顿州西雅图的寡聚引擎有限公司(01igoengine，InC.))，它包含RNA聚合酶III Hl-RNA基因启动子和明确的转录起始位点以及由5对连续腺嘌呤-胸腺喃唳组成的终止信号。Brummelkamp等，同上。在第二个尿苷(终止序列所编码的5个之中)后位点切断转录产物，产生类似于合成siRNA末端的转录物，它也含有核苷酸悬垂。将待转录成shRNA的序列克隆入此种载体中，将产生含有由短间隔子隔开的第一序列和第二序列的转录物，所述第一序列与靶mRNA(如编码赖氨酰氧化酶型酶的mRNA)的一部分互补，所述第二序列包含第一序列的反向互补序列。得到的转录物自身折叠形成茎环结构而介导RNA干扰(RNAi)。另一种合适的siRNA表达载体可在分开的pol III启动子调控下编码有义和反义siRNA。Miyagishi 等(2002)Nature Biotech. 20 :497_500。此载体产生的 siRNA 也包含 5个胸苷(T5)终止信号。可用多种方法，如脂质转染法，将siRNA、shRNA和/或编码它们的载体引入细胞。已开发了载体介导的方法。例如，可利用逆转录病毒递送siRNA分子。用逆转录病毒递送siRNA分子在某些情况下具有优点，因为逆转录病毒递送能有效、均一并可立即选出稳定的 “敲减(knock-down) ” 细胞。Devroe 等(2002) BMC Biotechnol. 2 :15。近年的科学出版物已确认这种短的双链RNA分子抑制靶mRNA的表达的确有效，并清楚证明了这类分子的治疗潜能。例如，已采用RNAi来抑制丙肝病毒感染的细胞(McCaffrey et al. (2002) Nature 418 :38-39)，HIV-1 感染的细胞(Jacque 等(2002)Nature 418 :435-438)，宫颈癌细胞(Jiang 等(2002)Oncogene 21 :6041-6048)和白血病细胞(Wilda 等(2002)0ncogene21 :5716-5724)。调节赖氨酰氧化酶型酶表达的方法调节赖氨酰氧化酶型酶活性的另一种方法是调节其编码基因的表达，如果基因表达受抑制可导致其活性水平较低，如果基因表达活化则活性水平较高。有许多方法可实现对细胞内基因表达的调节。例如，寡核苷酸可通过链置换或通过形成三联螺旋结合基因组DNA(如赖氨酰氧化酶型酶的调控区)而阻断转录，从而防止赖氨酰氧化酶型酶表达。就这点而言，已描述了利用所谓的“转回(switch back)”化学连接，其中一个寡核苷酸识别靶分子一条链上聚嘌 呤伸展序列和另一链上的同型嘌呤(homopurine)序列。也可利用含人工碱基的寡核苷酸形成三联螺旋，从而就离子强度和PH而言扩展结合条件。编码赖氨酰氧化酶型酶基因的转录调节也可通过，例如向细胞引入含功能域和DNA-结合域的融合蛋白或编码这种融合蛋白的核酸来实现。例如，功能域可以是转录活化域或转录抑制域。示范性的转录活化域包括VP16、VP64和NF- K B的p65亚基；示范性的转录抑制域包括KRAB，KOX和v-erbA。在某些实施方式中，这种融合蛋白的DNA结合域是序列特异性DNA结合域，能结合在编码赖氨酰氧化酶型酶的基因中或其附近，或结合此类基因的调控区。此DNA-结合域可天然结合在该基因处或调控区或其附近，或可经工程改造而如此结合。例如，该DNA结合域可获自能调节编码赖氨酰氧化酶型酶基因表达的天然蛋白质。或者，该DNA结合域可经工程改造而能结合所选择的编码赖氨酰氧化酶型酶的基因中或其附近的序列，或该基因的调控区中的序列。就此而言，可采用锌指DNA结合域，因为有可能工程改造锌指蛋白使之能结合任何所选的DNA序列。锌指结合域包含一个或多个锌指结构。Miller等(1985)EMBO J 4 1609-1614 ；Rhodes (1993) Scientific American，2 月56-65 ;美国专利 6，453，242。通常一个锌指长约30个氨基酸含4个锌配位氨基酸残基。结构研究证明典型(C2H2)锌指基序含有抵靠a螺旋(通常含2个锌配位组氨酸残基)堆积的2个3片层(保持在通常含2个锌配位半胱氨酸残基的P转角中)。锌指包括典型的C2H2锌指(其中锌离子由2个半胱氨酸和2个组氨酸残基配位)和非典型的锌指，例如C3H锌指(其中锌离子由3个半胱氨酸和I个组氨酸残基配位)和C4锌指(其中锌离子由4个半胱氨酸残基配位)。非典型锌指也可包括这些锌配位残基之一被不同于半胱氨酸或组氨酸的氨基酸所取代的锌指。参见，例如WO 02/057293 (2002年7 月 25 日)和 US2003/0108880 (2003 年 6 月 12 日)。可工程改造锌指的结合域使之与天然锌指蛋白相比具有新的结合特异性；从而使工程改造的锌指结合域构造能结合所选序列。参见如Beer I i等( 2002) NatureBiotechnol. 20 :135-141 ;Pabo 等(2001) Ann. Rev. Biochem. 70 :313-340 ;Isalan 等(2001)Nature Biotechnol. 19 :656-660 ；Segal 等(2001)Curr. Opin. Biotechnol. 12 :632-637 ;Choo等(2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10 :411_416。工程改造方法包括但不限于合理的设计和各类经验选择方法。例如，合理设计包括利用含三联体(或四联体)核苷酸序列和各个锌指氨基酸序列的数据库，设计中将每个三联体或四联体核苷酸序列与能结合特定三联体或四联体序列的锌指的一种或多种氨基酸序列相关联。参见，例如美国专利6，140,081 ;6，453，242 ；6，534，261 ;6，610，512 ;6，746,838 ;6，866，997 ;7，030，215 ;7，067，617 ;美国专利申请公开号 2002/0165356 ；2004/0197892 ；2007/0154989 ；2007/0213269 和国际专利申请公开号W098/53059 和 WO 2003/016496。示范性的选择方法包括噬菌体展示、相互作用捕获、杂交选择和双杂交系统，在美国专利 5，789，538 ;5，925，523 ;6，007，988 ;6，013，453 ;6，140，466 ;6，200，759 ;6，242，568 ;6，410，248 ;6，733，970 ;6，790，941 ;7，029，847 和 7，297，491 ；以及美国专利申请公开号 2007/0009948 和 2007/0009962 ；W098/37186 ；W0 01/60970 和 GB 2，338，237 中有所描述。例如，美国专利6，794，136 (2004年9月21日)描述了使锌指结合域的结合特异性的增强。关于指间接头序列的锌指工程改造的其他方面内容已在美国专利6，479，626和美国专利申请公开号2003/0119023中公开。也参见Moore等(2001a)Proc. Natl. Acad.Sci. USA 98 :1432-436 ；Moore 等(2001b)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :1437-1441 和 WO01/53480。关于含经工程改造的锌指DNA-结合域的融合蛋白应用的其他细节可参见如美国专利 6，534，261 ;6，607，882 ;6，824，978 ;6，933，113 ;6，979，539 ;7，013，219 ;7，070，934 ；7，163,824 和 7，220,719。调节赖氨酰氧化酶型酶表达的其他方法包括靶向诱变其基因或调控其基因表达的调控区。例如，在美国专利申请公布号2005/0064474 ;2007/0134796和2007/0218528中提供了利用含核酸酶功能域和工程改造的DNA-结合域的融合蛋白进行靶向诱变的示范性方法。
制剂、药盒和给药途径本发明也提供含有经鉴定可作为赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂(如赖氨酰氧化酶型酶的抑制剂或激活剂)的化合物的治疗组合物。这种组合物通常包含所述调节剂和药学上可接受的运载体。也可将补充的活性化合物掺入此组合物中。本文所用的术语“治疗有效量”或“有效量”指当单独给予或与另一治疗剂联合给予细胞、组织或对象(如哺乳动物，如人，或非人动物如灵长动物、啮齿动物、牛、马、猪、绵羊等等)时能有效防止或改善疾病状况或疾病进程的治疗药物用量。治疗有效剂量还指足以导致症状全部或部分改善，如相关医学状况的治疗、治愈、预防或改善；或提高对这类状况的治疗、治愈、预防或改善的速度的化合物用量。例如，赖氨酰氧化酶型酶活性抑制剂的治疗有效量视疾病或疾患的类型、疾病或疾患的范围、和患该疾病或疾患的生物体的大小而不同。本文公开的治疗化合物可用于，尤其是减少纤维化损伤，抑制肿瘤生长和抑制癌转移。因此，赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂(如抑制剂)的“治疗有效量”是可导致减少纤 维化损伤，减少肿瘤生长和/或降低癌转移的用量。例如，当赖氨酰氧化酶的抑制剂是抗体和体内给予该抗体时，取决于体重、给药途径、疾病严重程度等，正常剂量可按哺乳动物体重从每天约10ng/kg变化到100mg/kg,例如，约I微克/千克/天到50毫克/千克/天，任选约100微克/千克/天到20毫克/千克/天，500微克/千克/天到10毫克/千克/天，或I毫克/千克/天到10毫克/千克/天。根据本公开，本领域技术人员知晓各种药物组合物和他们的制备技术及用途。对于合适的药物组合物和他们的给药技术的详细列表，并可由以下教材进一步补充，如Remington' s Pharmaceutical Sciences (《雷明顿药物科学》)，第 17 版，1985 ;Brunton等 “Goodman and Gilman’ s The Pharmacological Basis of Therapeutics (《古德曼吉尔曼治疗学的药理学基础》)”，麦格劳希尔公司(McGraw-Hill)，2005 ;费城科学大学(编)，“Remington :The Science and Practice of Pharmacy (《雷明顿药物科学和实践》)”, Lffff出版社(Lippincott Williams&Wilkins), 2005 ;和费城科学大学(编)，“Remington :ThePrinciples of Pharmacy Practice (《雷明顿药物实践原理》)”，Lffff出版社,2008。本发明的治疗组合物还包含药学上可接受的物质、组分或运载体，如液体或固体充填剂、稀释剂、赋形剂、溶剂，或包封材料即运载体。这些运载体参与将本发明调节剂从机体的一处器官或区域转运到机体的另一器官或区域。各种运载体应在其他成分相容并对患者无害的意义上而言为“可接受的”。可用作药学上可接受运载体原料的一些例子包括糖类如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂如可可脂和栓剂用蜡；油如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇如聚乙二醇；酯如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏液；乙醇酒精；磷酸缓冲液和用于药物制剂中的其他无毒相容性物质。该组合物中也可存在湿润剂、乳化剂和润滑剂，如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。本发明的另一方面涉及实施赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂给药的药盒。在一种实施方式中，药盒包含配制在药物运载体中的赖氨酰氧化酶型酶活性调节剂(如LOX或L0XL2的抑制剂)，可选含有一种或多种其他合适的治疗剂。所述制剂和递送方法可根据纤维化损伤、肿瘤生长和转移的部位和程度调整。示范性的制剂包含但不限于适合胃肠道外，如静脉内、动脉内、眼内或皮下给药的制剂，包括包裹在胶束、脂质体或药物释放胶囊中的制剂(活性药剂纳入设计用于缓释的生物相容性包衣中)；可吸收制剂；外用制剂如滴眼剂、乳膏、油膏和凝胶；和其他制剂如吸入剂、气溶胶和喷雾剂。本发明化合物的剂量视需要治疗疾病的范围和严重程度、所给予的组合物活性、对象的整体健康状况，以及本领域技术人员熟知的其他要考虑事项而变化。在另一些实施方式中，局部递送本文所述组合物。局部递送可使该组合物不通过全身而递送至创伤、肿瘤或纤维化区域；与全身递送相比减少该组合物的身体负担。因此，本发明提供全身和局部递送(如递送给肿瘤或纤维化组织)的制剂和递送方法。可选将编码抗赖氨酰氧化酶型酶的抗体的核酸(或任何其他类型的调节剂，如赖氨酰氧化酶型酶活性的抑制剂，如核酶、siRNA、shRNA或微小RNA)包封在载体病毒载体内。、本领域已知多种载体病毒，包括细小病毒、乳多泡病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、逆转录病毒和慢病毒。
实施例实施例I :人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)血管发生/血管生成试验概沭进行研究以测定在体外血管发生/血管生成试验中抗-L0XL2抗体AB0023的效力。为此目的，用基于HUVEC的体外系统测定了一定范围的AB0023剂量和VEGF (血管生成促进剂)、苏拉明(Suramin，血管生成抑制剂)和单独培养液。该试验进行了 11天，第1、4、7和9天更换培养液。11天后用70%乙醇固定各孔，检测表达内皮标志⑶31的血管。每孔拍摄4个随机视野的图像，用专用软件分析包计算出各孔的血管分支点数目、血管数目和血管总长度。此分析所得结果表明，按血管分支点数目、血管数目和血管总长度所测定，在该试验中AB0023显著抑制血管形成。最高剂量(50 ii g/ml)完全消除了血管形成,而10、5和I U g/ml剂量与对照孔相比，显著降低所有这三种参数(p < 0. 05，单向AN0VA)。测试物AB0023的2种最低剂量(0. 5和0. I y g/ml)也导致所测的三种血管参数降低，但与对照孔相比无统计学差异。与对照孔相比，苏拉明和VEGF分别引起所有三种血管参数减少和增加(p < 0. 05，单向 AN0VA)。这些结果得到的结论是，在基于HUVEC的体外血管发生/血管生成试验中，所测试的AB0023四种最高剂量(50、10、5和liig/ml)均显著抑制了新血管的形成。细胞培养和给药在装有内皮生长培养液的24孔板中培养HUVEC和基质产生细胞(人成纤维细胞饲养层)直到培养物呈现最早期阶段的血管形成。此时(第I天)，如表I所示向各孔加入含测试制剂和对照的新鲜内皮细胞生长培养液，每孔0. 5ml。按照表I 一式二份或一式三份加入测试制剂和对照，同时设一式三份只加培养液的孔作为内皮生长的基线对照。平板在37°C、5% CO2培养。第4、7和9天按表I详述，除去所有孔中的培养液并小心替换为含测试制剂和对照的新鲜培养液。第11天如以下详述固定平板并标记CD31。实验时每天用倒置显微镜观察培养板确保细胞生长正常无污染。表I
权利要求
1.一种鉴定L0XL2活性抑制剂的方法，所述方法包括 (a)提供内皮细胞在基质细胞存在下生长的共培养物； (b)向该共培养物加入测试分子；和 (C)检测该共培养物的血管生成或血管发生； 其中，使共培养物中的血管生成或血管发生程度比缺乏测试分子的共培养物降低的测试分子鉴定为L0XL2活性抑制剂。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是人内皮细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述基质细胞是人细胞。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述基质细胞是成纤维细胞。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述测试分子是多肽。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述多肽是抗体。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗体是抗-L0XL2抗体。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述测试分子是核酸。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸是siRNA。
11.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述测试分子是分子量低于1，000D的有机小分子。
12.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述血管生成或血管发生程度降低由血管数目或密度降低表明。
13.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述血管生成或血管发生程度降低由血管长度减少表明。
14.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述血管生成或血管发生程度降低由血管分支程度减少表明。
15.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述血管生成或血管发生程度减少由CD31水平降低表明。
全文摘要
本发明公开利用体外试验鉴定LOXL2催化活性抑制剂的方法。在某些实施方式中，这些体外试验所鉴定的抑制剂能有效抑制肿瘤结缔织生成和纤维化。
文档编号G01N33/00GK102713601SQ201080047940
公开日2012年10月3日 申请日期2010年8月20日 优先权日2009年8月21日
发明者D·马歇尔, V·史密斯 申请人:吉联亚生物科技有限公司