专利名称：一种快速筛选抗黑曲霉的活性物质的方法
技术领域：
本发明涉及ー种生物学方法，特别涉及ー种快速筛选抗黑曲霉的活性物质的方法。
背景技术：
一直以来，微生物来源的天然产物在人类疾病的治疗过程中发挥着重要作用。近20多年来，随着传统抗生素的广泛使用，病原菌的耐药性迅速増加，而从传统的土壌微生物中发现结构新颖的活性化合物却出现了明显的下降趋势，在探索具有生物活性天然产物新来源的过程中，海洋微生物引起了广泛的关注。海洋微生物与传统制药业主要前体来源的陆生微生物具有显著不同的生长环境，能通过新颖的代谢方式来适应恶劣的生存环境，从 而可能产生异于陆生微生物的新的次级代谢产物，并且海洋微生物资源丰富。因此我们可以从海洋微生物发酵提取物中寻找新的抗病原菌的药物。由于海洋微生物资源丰富，进行筛选时比较困难，采用传统筛选方法费时而且低效。黑曲霉可引起植物方面的疾病，使植物发生霉变，进ー步造成农业方面的损失,例如黑曲霉感染可导致洋葱的霉变，当条件有利于其生长，黑曲霉的感染会遍及全部，同时会引起ー个普遍的采后的灾害，可以观察到黑曲霉的孢子存在于洋葱的鱗片之间。不仅是洋葱，黑曲霉同时也能引起花生和葡萄的采后灾害等。另一方面，黑曲霉也可引起人类和动物方面的疾病，相比于其他曲霉囷，黑曲霉不太可能引起人体和动物方面的疾病，但如果吸入大量孢子，可能发生了严重的肺病。黑曲霉是耳霉菌症的最常见的原因之一(真菌的耳部感染)，这可能会导致疼痛，临时听カ的损失，并在严重的情况下，损伤耳道和鼓膜。因此，目前需要一种从资源丰富的海洋微生物发酵提取物中快速筛选新的抗黑曲霉的药物的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种从海洋微生物的发酵提取物中快速筛选新的抗黑曲霉的药物的方法。为实现上述目的，提供以下具体技术方案
ー种快速筛选抗黑曲霉的活性物质的方法，包括如下步骤
将待筛选样品，刃天青，黑曲霉孢子菌悬液加入到96微孔板中，在37°C恒温培养箱中培养一定时间，其中设置阴性对照和阳性对照；优选培养12 — 36h ;
得到結果；即得到微孔板的顔色，酶标仪測量荧光值，和抑制率根据结果筛选。筛选微孔板的顔色为蓝色或紫色，酶标仪测量荧光值低于15000，抑制率为40%以上。其中所述酶标仪测量激发波长550nm发射波长590nm处的荧光值。所述抑制率的计算公式为
抑制率％=100%_ (实验孔荧光值-阳性对照荧光值)/ (阴性对照荧光值-阳性对照荧光值)*100%。阴性对照为无菌水代替待筛选样品；阳性对照为176ulRPMI_1640培养基代替黑曲霉孢子菌悬液。具体为将4微升待筛选样品，20微升200ug/ml刃天青和176微升
2.5X 104SpOreS/ml黑曲霉孢子菌悬液加入到96微孔板中，在37°C恒温培养箱中培养24h ；
24h后观察微孔板的颜色变化，并用酶标仪测量激发波长550nm发射波长590nm处的荧光值，然后在由荧光值计数出抑制率；取颜色为蓝色或紫色、荧光值低于15000，抑制率为40%以上的微孔，并显微镜观察。所述的待筛选样品为海洋微生物发酵液提取物。本发明的检测原理是活细胞中的乳酸脱氢酶能将刃天青(蓝色)转化为荧光 物质试卤灵(粉红红色)，产生荧光信号。试卤灵会继续被细胞还原为无荧光的物质ニ氢试卤灵(白色)，使荧光信号下降，无活性的或死亡的细胞丧失了代谢能力而不能还原刃天青使刃天青产生颜色变化，也就不能产生荧光信号，所以该法能通过颜色和荧光信号两方面的变化来特异性检测活性细胞。本发明提供了从海洋微生物发酵液提取物中快速筛选或检测抗黑曲霉活性物质的方法，关键步骤为(1)制备海洋微生物发酵液；(2)从发酵液中提取，分离和纯化组分；
(3)将甸种待测组分，刃天青溶液和黑曲霉抱子囷悬液加入到96微孔板中；(4)在黑曲霉的培养条件下培养24h ；(5)根据刃天青的颜色、在激发波长为550nm发射波长为590nm荧光值以及有荧光值计数出抑制率判断组分对黑曲霉的抑制作用大小；(6)在显微镜下观察由刃天青得出对黑曲霉有抑制作用的组分，由此判断组分抑制黑曲霉的哪个阶段。本发明实施例提供了 3株海洋微生物发酵液提取物分离的87个馏分中筛选出6个馏分有抗黑曲霉活性。本发明用刃天青指示剂作为指示黑曲霉生长情况的指示剂，以刃天青颜色变化，荧光值的大小以及由荧光值得出的抑制率，直观地、准确地的反应了黑曲霉的生长情況。由于刃天青指示剂颜色变化明显，易于肉眼观察；由刃天青得到的荧光值以及由荧光值计算得出的抑制率能准备的反应黑曲霉的生长情況，使得刃天青作为抗黑曲霉活性实验的指示剂较其他指示剂，如XTT，甲基橙等更具有优势。刃天青在该方法中的运用，使得该方法简便，快速，准确。本发明还提供了用黑曲霉的形态来检测由刃天青指示剂得出的活性物质对黑曲霉抑制作用的強弱。在显微镜观察下由黑曲霉孢子或孢子萌发形态来判断活性物质对黑曲霉抑制作用强弱以及活性物质抑制黑曲霉哪个阶段。由于该方法更易于观察，使得实验结果更加可靠、精确。本发明通过刃天青颜色变化，荧光值的大小以及由荧光值计算得出抑制率的大小来判断样品有无抗黑曲霉作用。以及通过刃天青颜色变化，荧光值大小以及由荧光值计算得出抑制率判断出馏分对黑曲霉有抑制率作用；然后在倒置显微镜下观察有抗黑曲霉活性的96微孔从而进一歩判断活性馏分对黑曲霉抑制作用的大小以及对黑曲霉抑制作用阶段。本发明的判断方法具体为通过刃天青的顔色来判断组分对黑曲霉有无活性；96孔中颜色呈蓝色，则代表样品对黑曲霉有抑制活性；96孔中颜色呈粉红色或红色，则代表样品对黑曲霉没有抑制活性。荧光值在5000以下或由荧光值得出的抑制率为70%以上，则代表样品对黑曲霉有很强的抑制作用；荧光值在5000到15000或由荧光值得出的抑制率在40%-70%，则代表样品对黑曲霉有较好的抑制作用；荧光值在15000以上或抑制率在40%以下，则代表样品对黑曲霉有微弱或无抑制作用。本发明的方法比传统的平板筛选法具有操作简单、工作量少、能进行高通量筛选、能判断活性样品对黑曲霉是抑菌还是杀菌作用等优点。由于该方法采用了多重指标来判断对黑曲霉的抑制作用，使得结果更加精确可靠。本发明从海洋微生物发酵液提取物中快速筛选或检测抗黑曲霉的活性物质的方法，可以大批量的筛选海洋微生物发酵液提取物。该方法操作简单，所需的实验器材和药品简单，工作量较少；同时该方法采取刃天青颜色变化、荧光值、抑制率以及黑曲霉形态变化的多重判断标准，使得实验结果更加精确可靠。本方法快速易行，可以从大量的海洋微生物发酵液提取物中筛选出抗黑曲霉的活性物质，为研究抗黑曲霉的药物奠定基础。
图I为经刃天青顔色，荧光值和抑制率判断得出的活性强的I个瓶霉发酵样品抗黑曲霉活性状况在显微镜下的图片，用Nikon TE2000-S倒置显微镜拍摄的(100X); 图2为图I的阴性对照图片，用Nikon TE2000-S倒置显微镜拍摄(100X)。
具体实施例方式 下面通过具体实施例，对本发明进行解释。需要说明的是，下列实施例仅仅是说明性的，并不以任何方式限制本发明。另外，下列实施例中所采用的所有仪器、材料等均为市售可得的，如在下列实施例中没有明确指出的操作，可以通过本领域技术人员常规的操作方法进行。实施例I :海洋微生物发酵液提取物样品的制备；
实验材料三批提取物样品共87个，分别来自耐碱朽1檬球菌(Citricoccusalkalitolerans)，保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号MCCC1A00280;平台资源号1535C0001000000149;采自太平洋；该菌生物危害程度四类；非致命菌；革兰氏阳性好氧菌，过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性；菌落成黄色球形或者近似球形。聚多曲霉(Aspergillus sydowii)，保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号MCCC 3A00240 ;平台资源号1535C0001000011892 ;采自西太平洋；菌落质地为丝绒状至絮状，致密；颜色呈灰蓝色至暗蓝色，初期稍淡，老后渐深，近于暗蓝灰緑色，有辐射形沟纹；通常具大量滲出液，褐色至暗褐色无气味或具轻微霉味；菌落反面呈淡褐或暗褐色至酱色，近于栗色或酱红色。该菌为非致病菌。瓶霉(Phialophora sp. http://www.mccc.org.cn/detailRecord.asp auto_id =740),保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号MCCC 3A00108;平台资源号1535C0001000000942 ;采自太平洋；该菌生物危害程度四类；菌落质地为丝绒状至絮状，致密；颜色成青緑色，孢子青緑色，基丝淡黄緑色，孢子成团。该菌为非致病菌。取上述菌种进行活化，发酵，所得的发酵液进行提取和分离。PDA液体培养基马铃薯提取液I. 0L，酵母膏I. 0克，蛋白胨3. 0克，葡萄糖15. 0克，琼脂17. Og；
马铃薯提取液的制备取去皮马铃薯200克，切成小块，加海水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，PH自然。实验步骤
一、聚多曲霉发酵液提取物样品的制备1、取菌株聚多曲霉接种入PDA液体培养基中进行活化，28°C摇床培养24小吋，活化后的菌株接种至大米固体发酵培养基(大米105g,小米45g,葡萄糖3g,蛋白胨3g,酵母粉I. 5g，PH自然)中，室温放置两周；
2、发酵两周后，取发酵样品先进行水洗，所得的样品进行离心(12，OOOrpm，lOmin)，得到上清液水样，发酵液中ー些蛋白质，糖类物质等进入水样部分，将水样做废弃处理，这样就去除了蛋白质，糖类等物质，然后用甲醇进行萃取，反复萃取3次，萃取的方法是将甲醇加入离心后去除水样的沉积物中，采用高速弥散机(购买自德国IKA艾卡集团广州仪科实验室技术有限公司产品编号T25 DS25)将沉积物打成匀浆，离心(12，000rpm，10min)，取上清甲醇样，采用旋转蒸发仪(购买自德国Heidolph公司，产品编号Hei_VAP value)浓缩成浸膏，然后用甲醇复溶至3mL。4°C保存备用；
3、用反相高效液相色谱仪分析步骤2所得样品，采用甲醇与 水混合比例(甲醇水=5 % 95%, 2 分钟；甲醇水=25 % - 60 % :75% — 40%, 42 分钟；甲醇水=60 % 一100% :40% 一 0%, 50分钟)等度洗脱，根据图谱上出峰的时间接洗脱液。原则是ー个洗脱液对应ー个信号峰，但图谱上出峰时间接近的信号峰可合并。洗脱液采用旋转蒸发仪浓缩，最后得到提取物样品共34个；
ニ、耐碱柠檬球菌发酵液提取物样品的制备
1、取菌株耐碱柠檬球菌接种入TSB液体培养基(胰蛋白胨大豆肉汤培养基，购买自海博生物有限公司，产品编号HB4114)中进行活化，28°C摇床培养24小时，活化后的菌株接种至AM12液体发酵培养基(鱼粉8g/L，淀粉10g/L，玉米粉10g/L，蛋白胨5g/L，甘油6g/L, CaC03 2 g/L, 3%海盐或陈海水，pH 7. 5)中，28°C摇床培养7天；
2、发酵7天后离心(12，OOOrpmIOmin)去除菌体，取上清与こ酸こ酯加入到分液漏斗中进行反复萃取3次，取漏斗中こ酸こ酯相，采用旋转蒸发仪浓缩成浸膏后，用こ酸こ酯复溶至3mL。4°C保存备用；
3、用反相高效液相色谱分析步骤2所得样品，采用甲醇与こ酸こ酯混合比例(甲醇水=5%:95%，2 分钟;甲醇水=20% 60%:80% 40%，45分钟;甲醇:水=60% 100% :40% 0%，60分钟)等度洗脱，根据图谱上出峰的时间接洗脱液。原则是ー个洗脱液对应ー个信号峰，但谱图上出峰时间接近的信号峰可合井。洗脱样采用旋转蒸发仪浓缩，最后得到提取物样品共27个。三、瓶霉发酵液提取物样品的制备
1、取菌株瓶霉接种入PDA液体培养基中进行活化，28°C摇床培养24小吋，活化后的菌株接种至大米固体发酵培养基(大米105g,小米45g,葡萄糖3g,蛋白胨3g,酵母粉I. 5g,PH自然)中，室温放置两周；
2、发酵两周后，取发酵样品先进行水洗，所得的样品进行离心(12，OOOrpm，lOmin)，得到水样，发酵液中ー些蛋白质，糖类等物质进入水样部分，将水样做废弃处理，这样就去除了蛋白质，糖类等物质，然后用甲醇进行萃取，反复萃取3次，萃取的方法是将甲醇加入离心后的去除水样的沉积物中，采用高速弥散机(购买自德国IKA艾卡集団广州仪科实验室技术有限公司产品编号T25 DS25)将沉积物打成匀浆，离心(12，000rpm，10min)，取上清甲醇样，采用旋转蒸发仪(购买自德国Heidolph公司，产品编号Hei_VAP value)浓缩成浸膏，然后用甲醇复溶至3mL。4°C保存备用。
3、用反相高效液相色谱仪分析步骤2所得样品，采用甲醇与水混合比例(甲醇冰=5%:95%，2 分钟;甲醇:水=25% 60%:75% 40%，35分钟;甲醇:水=60% 100% :40% 0%，45分钟)等度洗脱，根据图谱上出峰的时间接洗脱液。原则是ー个洗脱液对应ー个信号峰，但图谱上出峰时间接近的信号峰可合井。洗脱液采用旋转蒸发仪浓缩，最后得到提取物样品共26个。实施例2 活性样品的筛选
样品 黑曲霉孢子菌悬液挑取在新鮮PDA平板上培养了 2-3d的黑曲霉孢子到0. 5%吐温-20生理盐水中摇匀；然后用血球计数板在显微镜下计数。通过显微镜下计数计算出黑曲霉孢子菌悬液的各个浓度，然后用RPMI-1640培养基把黑曲霉孢子菌悬液稀释到2. 5 X 104spores/ml o刃天青溶液用无菌水配置200ug/ml的刃天青溶液
试验步骤
1、将176微升2.5X 104SpOreS/ml黑曲霉孢子菌悬液、20微升200ug/ml刃天青溶液和4微升发酵液提取物(实施例所得到87个提取物样品，分别加入)同时加入到96微孔板中；在96微孔板中设两个阴性对照和两个阳性对照。(阴性对照为4ul的无菌水代替4ul发酵液提取物；阳性对照为176微升RPMI-1640培养基(购买于sigma公司)代替黑曲霉孢子菌悬液)；
2、将96微孔板放入到37°C恒温培养箱中培养24h；
3、24h后观察96微孔板中各个孔的顔色；并与阴性和阳性孔做对比。然后将96微孔板在酶标仪中測量激发波长为550nm发射波长为590nm处的荧光值并通过公式计数出抑制率。将96微孔板颜色显示为蓝色、荧光值在15000以下和抑制率在70%的孔在倒置显微镜下观察黑曲霉的形态；
4、从显微镜下的黑曲霉的形态进一歩判断活性物质对黑曲霉的抑制作用以及判断活性物质抑制黑曲霉的哪个阶段(黑曲霉孢子的萌发或黑曲霉菌丝的生长)。抑制率公式
抑制率％=100%_ (实验孔荧光值-阳性对照荧光值)/ (阴性对照荧光值-阳性对照荧光值)*100%，结果87个海洋微生物发酵液提取物中，由聚多曲霉发酵得来的34个样品中其中只有I个活性强的抗黑曲霉活性样品刃天青显示为蓝色、荧光值为9002. 47、抑制率在72. 2% ;将其进ー步在倒置显微镜下观察结果为该样品中黑曲霉的菌丝较短。由耐碱柠檬球菌发酵得来的27个样品中其中有5个活性好的抗黑曲霉活性样品，进ー步经显微镜观察后有3个活性较强的抗黑曲霉活性刃天青显示为蓝色或蓝紫色，荧光值为15000以下，抑制率为65%以上的样品有5个；将其进一歩在倒置显微镜下观察结果为2个样品中黑曲霉的菌丝很短，I个样品中黑曲霉菌丝较短，2个样品相对于对照来说菌丝没有那么密集。由瓶霉发酵得来的26个样品，其中只有I个活性强的抗黑曲霉活性样品刃天青显示为蓝色，荧光值为1375. 937，抑制率为98. 7% ;将其进ー步在倒置显微镜下观察结果为该样品中黑曲霉的菌丝较短。见图I和图2。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨 的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
权利要求
1.ー种快速筛选抗黑曲霉的活性物质的方法，其特征在于，包括如下步骤 将待筛选样品，刃天青，黑曲霉孢子菌悬液加入到96微孔板中，在37°C恒温培养箱中培养一定时间，其中设置阴性对照和阳性对照；优选培养12 — 36h ; 得到结果； 根据结果筛选。
2.权利要求I的方法，其特征在于，所述的得到结果为微孔板的顔色，酶标仪测量荧光值，和抑制率。
3.权利要求2的方法，其特征在于，所述的根据结果筛选为微孔板的顔色为蓝色或紫色，酶标仪测量荧光值低于15000，抑制率为40%以上。
4.权利要求2的方法，其特征在于，所述酶标仪测量激发波长550nm发射波长590nm处 的荧光值。
5.权利要求2的方法，其特征在于，所述抑制率的计算公式为 抑制率％=100%_ (实验孔荧光值-阳性对照荧光值)/ (阴性对照荧光值-阳性对照荧光值)*100%。
6.权利要求I的方法，其特征在于，所述阴性对照为无菌水代替待筛选样品；阳性对照为176ulRPMI-1640培养基代替黑曲霉孢子菌悬液。
7.权利要求I所述的方法，其特征在干， 将4微升待筛选样品，20微升200ug/ml刃天青和176微升2. 5X 104SpOreS/ml黑曲霉孢子菌悬液加入到96微孔板中，在37°C恒温培养箱中培养24h ； 24h后观察微孔板的颜色变化，并用酶标仪测量激发波长550nm发射波长590nm处的荧光值，然后在由荧光值计数出抑制率；取颜色为蓝色或紫色、荧光值低于15000，抑制率为40%以上的微孔，并显微镜观察。
8.权利要求I一 7任一方法,其特征在于,待筛选样品为海洋微生物发酵液提取物。
全文摘要
本发明涉及一种快速筛选抗黑曲霉的活性物质的方法。包括将待筛选样品，刃天青，黑曲霉孢子菌悬液加入到96微孔板中，在37℃恒温培养箱中培养一定时间，其中设置阴性对照和阳性对照；优选培养12-36h；得到结果；然后根据结果筛选出抗黑曲霉的活性物质。当微孔板的颜色为蓝色或紫色，酶标仪测量荧光值低于15000，抑制率为40%以上时，所检测的样品为抗黑曲霉的活性物质。该方法简便，快速，准确。
文档编号C12Q1/18GK102851351SQ201210346418
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者陈建明, 胡彬, 王蔚, 陈卓, 李芊, 杨慧 申请人:国家海洋局第三海洋研究所