治疗骨丢失相关疾病的siglec15抗体的制作方法

专利名称：治疗骨丢失相关疾病的siglec 15抗体的制作方法
治疗骨丢失相关疾病的SIGLEC 15抗体
技术领域：
本发明涉及与Siglec-15特异性结合的单克隆抗体和其抗原结合片段，及其用于治疗某些疾病的用途，所述用途包括诊断、预防和治疗癌症或骨丢失，诸如与骨相关疾病有关的、或与破骨细胞分化或活性增高有关的严重的或过度的骨丢失。本发明还涉及这些抗体用于诊断、预防和治疗其中破骨细胞的活性增高的多种其它类型的疾病的用途。
背景技术：
骨是动态的结缔组织，由支持骨的结构、机械和生化完整性和人体矿物质平衡所需的功能上不同的细胞群组成。所涉及的主要细胞类型包括负责骨形成并维持骨量(bonemass)的造骨细胞和负责骨再吸收的破骨细胞。造骨细胞和破骨细胞在称作骨重建的动态 过程中起作用。这些细胞从其祖细胞的发育和增殖受骨微环境中产生的生长因子和细胞因子的网络以及系统激素的控制。骨重建在个体一生中都进行着，并且是维持健康的骨组织和矿物质平衡所必需的。该过程在很大程度上保持着平衡，并受系统激素、肽和下游信号转导通路蛋白、局部转录因子、细胞因子、生长因子和基质重建基因的复杂的相互影响的控制。骨重建过程中出现的任何干扰或不平衡可产生骨骼疾病，其中最常见的骨骼病症以骨量的净减少为特征。该骨量减少的主要原因是破骨细胞数量和/或活性的增高。这种疾病最常见的和可能最熟知的是尤其在绝经期开始之后的妇女中发生的骨质疏松症。事实上，骨质疏松症在中老年和老年妇女中是骨折的最重要的根本原因。虽然雌激素缺乏已被强烈牵扯为绝经后骨质疏松症的因素，但有长期存在的证据一重建是局部受控的过程，因为其发生在遍及骨骼中的不连续的小包(discrete packet)中，如40多年之前由Frost所首先描述的(Frost H. M. 1964)。因为骨重建发生在不连续的小包中，所以局部产生的激素和酶对于骨再吸收的开始和正常重建过程可能比系统激素更重要。该局部控制受微环境中的的造骨细胞和破骨细胞所调节，其中造骨细胞和破骨细胞在所述微环境中起作用。例如，破骨细胞附着于骨基质并在其与骨表面之间形成独立的区室，所述骨表面由皱折缘周围的一圈肌动蛋白形成的封闭区所限定。多个小囊泡朝向骨基质转运酶并使部分消化的骨基质内化。封闭区内的微环境中富集溶酶体酶，且与机体的正常生理PH相比是高度酸性的。皱折缘膜还表达RANKL的受体RANK，和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)受体(二者均负责破骨细胞分化)，以及能够快速使破骨细胞失活的降钙素受体(Baron，R. 2003)。在复杂的抑制和刺激方式中，生长激素、胰岛素样生长因子-I、性类固醇、甲状腺激素、降钙素激素(诸如PTH和前列腺素E2)、多种细胞因子(诸如白介素-IP、白介素-6和肿瘤坏死因子a )和1，25-二羟维生素D(钙三醇)在骨重建过程中共同协调作用(Jilka等 1992 ；Poli 等 1994 ；Srivastava 等 1998 ；de Vemejoul 1996)。因此，通过这些特化的细胞创建的独特的局部环境是由于在其它组织中不表达的独特的遗传序列的表达和/或在其它组织中表达的多核苷酸和多肽的剪接变体的表达所导致是合乎情理的。对破骨细胞活性特异的多核苷酸、多肽和其变体和衍生物的分离和鉴定将允许重建过程的更清楚的理解，并为与骨重建相关的疾病状态的治疗提供了组织特异性治疗靶标。与骨重建相关联的许多疾病未被充分认识，通常是无法治疗或仅可以有限的程度治疗。例如，骨关节炎难以治疗，因为没有集中于减轻疼痛并防止受影响关节变形的疗法和治疗。通常使用非类固醇抗炎药物(NSAID)减轻疼痛。另一个实例是骨质疏松症，其中在美国通过FDA批准使用的目前唯一药物是抗再吸收剂，其防止骨断裂。雌激素替代疗法是抗再吸收剂的一个实例。另外包括阿伦膦酸盐(福善美(Fosamax)—一种二磷酸盐抗再吸收剂)、利塞膦酸盐(Actonel—一种二磷酸盐抗再吸收剂)、雷洛昔芬(Evista—选择性雌激素受体调节剂(SERMS))、降钙素(Calcimar—一种激素)和甲状旁腺素/特立帕肽(teriparatide) (Forteo—人激素(甲状旁腺素)的一种合成形式，其协助调节钙代谢)。诸如阿伦膦酸盐和利塞膦酸盐的二磷酸盐与骨的表面永久结合并干扰破骨细胞 活性。这允许造骨细胞超越再吸收的速度。最常见的副作用是恶心、腹痛和腹泻。然而，阿伦膦酸盐被报道还导致食道的刺激和炎症，并且在一些情况下导致食道的溃疡。利塞膦酸盐在化学上不同于阿伦膦酸盐，且较小可能地导致食道刺激。然而，某些食物、钙、铁补充物、维生素和矿物质，或含钙、镁或铝的抗酸剂可降低利塞膦酸盐的吸收，从而导致效力的丧失。雷洛昔芬和其它SERMS(诸如他莫昔芬(Tamoxifen))的最常见的副作用是热潮红。然而，已显示雷洛昔芬和其它激素替代疗法增加了血块的风险，包括深静脉血栓症和肺栓塞、心血管病和癌症。降钙素在增加骨密度和强化骨方面不如雌激素和其它抗再吸收剂一样有效。注射的或鼻腔喷雾的降钙素的常见副作用是恶心和发红。患者可形成鼻刺激、流鼻涕或流鼻血。可注射的降钙素可在注射部位导致局部皮肤发红、皮疹和发红。表明涉及骨重建的若干疾患或疾病状态之间的关联的情况是使用首次通过FDA批准的依替膦酸盐(Didronel)治疗佩吉特氏病(Paget’ s disease)。佩吉特氏病是以失调和加速的骨重建为特征的骨病，导致了骨衰弱和疼痛。依替膦酸盐已用于“未标志用途(off-label) ”，且在一些研究中显示在患有确定的骨质疏松症的绝经后妇女中增加了骨密度。还已发现在需要长期类固醇药物(诸如强的松(Prednisone)或可的松(Cortisone))的患者中有效防止骨丢失。然而，高剂量或连续使用依替膦酸盐可导致称为骨软化症的另一骨病。如骨质疏松症一样，骨软化症可导致衰弱的骨，具有增高的骨折风险。由于骨软化症忧虑和仍缺少关于降低骨折速率的足够的研究，美国FDA未批准依替膦酸盐用于骨质疏松症的治疗。已主要将骨质疏松症治疗集中于降低骨丢失速率的抗再吸收药物，但新出现的疗法显示了增加骨矿物质密度而非仅维持骨矿物质密度或减慢其恶化的前景。骨质疏松症早期阶段主要由新治疗种类中的药物候选物组成，尤其是组织蛋白酶K抑制剂、骨保护素和隹丐敏感受体拮抗剂(calcilytics)以及新型二磷酸盐。这些中的一些是这样的实例其中基于骨生物学的更深的认识正在开发利用基因组学计划的新型药物，且长期而言其具有改变治疗骨疾患的面貌的可能性。
本发明描述了对Siglec-15特异的抗体用于诊断、预后和治疗(包括预防)癌症或骨丢失(例如，与骨相关疾病有关的、或与破骨细胞分化或活性的增高有关的严重的或过度的骨丢失)的用途。尤其是，本发明涉及抗Siglec-15抗体用于抑制破骨细胞的分化的用途。唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglec)是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员，其具有与唾液酸相互作用的能力(McMillan和Crocker, 2008 ；Crocker等，2007)。存在一些Siglec家族成员，其均共有特定的结构特征，尤其是，表现出结合唾液酸的氨基末端V-setIg结构域和不同数目的C2_set Ig结构域。这些膜受体一般以高度特异的方式表达，且家族成员中的许多在造血细胞中表达(McMillan和Crocker, 2008)。这些蛋白质被认为通过识别聚糖来促进细胞-细胞相互作用、调节信号转导和调控免疫功能(Crocker等，2007)。唾液酸是通常位于细胞表面的复杂糖复合物的端部的九碳糖。其可与多种蛋白质和脂质连接(McMillan 和 Crocker, 2008)。Siglec-15是最近被描述的与Siglec_14具有高度同源性的Siglec家族成员之一(Angata等，2007)。这些作者报道了其优先结合唾液酰Tn结构，且其与DAP12和DAPlO相 互作用。这些相互作用的功能意义是未知的，但提出Siglec-15可能具有激活功能(Angata等，2007)。虽然这些初步洞察了 Siglec-15在哺乳动物中的可能作用，但当将序列鉴定为筛选的部分以发现破骨细胞分化的新型调节物时，促进了对蛋白质的生物学功能的理解的重要进展(Sooknanan等，2007)。在本专利申请中，揭示了在破骨细胞发生的小鼠模型中，通过RNA干扰对Siglec-15转录物的衰减导致了响应于RANKL治疗的前体的分化的显著降低。在人破骨细胞中公开了类似的结果。并且，本公开内容中呈现的研究还显示Siglec-15在细胞膜的定位对于其在破骨细胞分化中的作用是必需的。并且，最近的出版物显示表面糖复合物的末端的唾液酸的存在是适当的破骨细胞分化所需的，且对于破骨细胞前体细胞的融合可能是重要的(Takahata等，2007)。该最新观察创建了分化中的破骨细胞中唾液酸结合和Siglec-15的表达之间的直接功能关联，并有力表明了 Siglec-15在破骨细胞前体的早期分化程序中具有作用。因此，Siglec-15的表达谱，其在破骨细胞分化过程中的强可诱导性、其在膜表面的定位和其结构特征均有助于利用单克隆抗体在细胞表面靶向该蛋白质的可行性。靶向破骨细胞的基于单克隆抗体的疗法的唯一的另外实例是狄诺塞麦(denosumab)，对RANKL特异的人单克隆抗体(Ellis等2008)。本发明涉及抗Siglec-15抗体或抗原结合片段在骨丢失的检测或治疗中尤其在骨相关疾病的情况下或在增高的破骨细胞分化或活性的情况下作为破骨细胞分化的阻断剂的用途。本发明还涉及抗体或抗原结合片段在癌症的检测或治疗中的用途。附图简述图I显示了在来自6个不同供体的人分化中破骨细胞样本中Siglec-15mRNA的基于PCR的表达谱。还描绘了来自30个人正常组织的RNA样本中的表达谱。作为对照，将Siglec-15表达模式与熟知的破骨细胞标志物组织蛋白酶K(CATK)相比较，并包括管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)以用于每个样本中的RNA的量的对照。图2显示了从癌细胞系的NCI-60组中分离的样本中的Siglec_15mRNA的表达。图3呈现了含有作为Fe融合蛋白在293-6E细胞中表达的纯化的人重组Siglec-15的样本的考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶。该制备物被用以产生本专利中公开的单克隆抗体。图4显示了选自来自含抗Siglec_15Fab的Omniclonal文库#25的96孔板的单独单克隆抗体的Fc-Siglec-15ELISA结果。通过粗体数字指示的孔含有示例性单克隆抗体25A1、25B4、25B8、25C1、25D8、25E5、25E6和25E9。还显示了在同样的板上单独使用Fe部分进行的ELISA以鉴定对Fc-Siglec-15融合蛋白的Fe部分特异的那些单克隆抗体。图5呈现了示出将小鼠Fab转化到IgG2小鼠-人嵌合mAb中所涉及的步骤的方案。图6显示了对于示例性抗体25B4、25B8、25C1、2 8、25E6和25E9，小鼠抗Siglec-15Fab的结合与对应的IgG2嵌合单克隆抗体的结合相比较的图。结果表明当转移至完全人IgG2支架时，保持了 Fab可变区的相关结合。
图7显示了用递增浓度的抗Siglec-15IgG2嵌合单克隆抗体25B8、25E6和25E9治疗后对人破骨细胞的分化的抑制。治疗之后，关于TRAP表达对破骨细胞进行染色。图8显示了用递增浓度的抗Siglec_15IgG2嵌合单克隆抗体25B8、25E6和25D8治疗后对小鼠破骨细胞的分化的抑制。治疗之后，关于TRAP表达对破骨细胞进行染色。图9显示了在示例性抗体25C8的存在下人和小鼠Siglec-15的比较性结合。结果表明针对人Siglec-15生成的抗体的结合还与小鼠Siglec-15相互作用。图IOA、IOB和IOC是对于所选择的⑶RLI、⑶RL2和⑶RL3序列(分别)利用Clustalff2程序获得的比对结果的总结；其中“ * ”意为在比对中该栏中的残基在所有序列中相同的，意为已观察到的保守置换，和”意为所观察的半保守置换。利用ClustalW程序产生共有 CDR (Larkin M. A.,等，(2007) ClustalW和 ClustalX 版本 2. Bioinformatics2007 23(21):2947-2948)。图IlAUlB和IlC是对于所选择的CDRHU CDRH2和CDRH3序列(分别)利用Clustalff2程序获得的比对结果的总结；其中“ * ”意为在比对中该栏中的残基在所有序列中相同的，意为已观察到的保守置换，和”意为所观察的半保守置换。利用ClustalW程序产生共有 CDR (Larkin M. A.,等，(2007) ClustalW 和 ClustalX 版本 2. Bioinformatics2007 23(21):2947-2948)。

图12示出了对于Siglec-15特异的25E9候选抗体抑制破骨细胞的骨再吸收活性的能力。图13A、13B、13C、13D和13E通过从过表达Siglec_15cDNA的细胞制备的裂解物的免疫印迹(13A)、从人破骨细胞中制备的裂解物的免疫印迹(13B)和从小鼠破骨细胞中制备的裂解物的免疫印迹(13C)，和从U87成胶质细胞瘤细胞中制备的裂解物的免疫印迹，和通过完整U87细胞的流式细胞术，证明Siglec-15抗体可检测蛋白。图14A和14B显示了针对Siglec-15产生的抗体不与包括Siglec_2和CD33的其它有关Siglec结合。图15显示了证明抗Siglec-15抗体可抑制Siglec-15和唾液酸之间的相互作用的 ELISA。发明概述本发明涉及用于治疗(包括预防)、检测和诊断骨丢失或癌症的抗体和抗原结合片段以及试剂盒。所述抗体和抗原结合片段更具体地可用于检测已分化的破骨细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞、中枢神经系统的癌细胞、前列腺癌细胞、黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或结肠癌细胞和诊断骨丢失、卵巢癌、肾癌、中枢神经系统的癌症、前列腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌。本发明的抗体或抗原结合片段还可用于治疗骨丢失、卵巢癌、肾癌、中枢神经系统的癌症、前列腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌。本发明的抗体或抗原结合片段可与Siglec-15 (SEQ ID NO: 2)的第20至259位氨基酸或与Siglec-15变体(例如，SEQ ID NO: 4)的对应区结合。更具体地，本发明的抗体或抗原结合片段可与Siglec-15 (SEQ ID NO: 2)的第49至165位氨基酸或与Siglec-15变体(例如，SEQ ID NO:4)的对应区结合。本发明更具体地涉及能够与能促使破骨细胞分化的多肽结合且能够抑制多肽的破骨细胞分化活性的分离的抗体或抗原结合片段。本发明的抗体或抗原结合片段涵盖与SEQ ID NO: 2的第20至259位氨基酸结合或 与同SEQ ID NO: 2的第20至259位氨基酸具有至少80%序列同一性的变体结合的那些。更具体地，本发明的抗体或抗原结合片段可更具体地与SEQ ID N0:2的第49至165位氨基酸结合或与同SEQ ID NO: 2的第49至165位氨基酸具有至少80%序列同一性的
变体结合。更具体地，本发明的抗体或抗原结合片段可更具体地与同SEQ ID N0:2具有至少80%序列同一性的多肽结合。根据本发明，抗体或抗原结合片段可因此干扰多肽促使破骨细胞分化或促使肿瘤生长的能力。更具体地涵盖能够与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 2变体的胞外区结合的抗体或抗原结合片段。本发明因此提供了能够与能促使破骨细胞分化的多肽结合并与SEQ ID NO:2或与唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素15 (Siglec-15 ;SEQ ID NO:2) SEQ ID N0:2的第20至259位氨基酸具有至少80%序列同一性(或与SEQ ID NO: 2的第49至165位氨基酸具有至少80%同一性)的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够抑制破骨细胞分化、骨再吸收(降解)或能够阻断Siglec-15与唾液酸结合。本发明的抗体或抗原结合片段可能够干扰(抑制)破骨细胞前体细胞分化为已分化的破骨细胞。根据本发明，分离的抗体或抗原结合片段可以是例如，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或其片段。在一个示例性实施方案中，分离的抗体或抗原结合片段可以是包含人抗体的恒定区或其片段的氨基酸的嵌合抗体或人抗体。恒定区或其片段可来自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在一个更具体的实施方案中，恒定区可来自IgG2。可以特别有用的抗原结合片段包括例如，FV(scFv)、Fab、Fab'或(Fab' )2。抗体或抗原结合片段可在分离的哺乳动物细胞(非杂交瘤细胞)中产生或从分离的哺乳动物细胞产生，或在杂交瘤细胞中产生。分离的哺乳动物细胞的一个示例性实施方案是人细胞。
特别涵盖在分离的哺乳动物细胞(例如，人细胞)中产生单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或其片段。这样产生的嵌合抗体或人抗体可包含人抗体的恒定区或其片段的氨基酸，包括例如，来自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区或其片段。在一个更具体的实施方案中，恒定区可来自IgG2。在本发明的一方面，本发明的抗体或抗原结合片段可干扰(抑制)人破骨细胞前体细胞分化为分化的人破骨细胞。在一个示例性实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段可干扰(抑 制)原代人破骨细胞前体细胞分化为分化的人破骨细胞。具有所述活性的抗体或抗原结合片段可包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或其片段。在一个更具体的实施方案中，可能够具有所述活性的抗体或抗原结合片段包括例如，单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或其片段。在一个甚至更具体的实施方案中，可能够具有所述活性的抗体或抗原结合片段包括例如，可包含人抗体的恒定区或其片段的氨基酸的嵌合抗体、人抗体或其片段。嵌合或人抗体的恒定区或其片段可来自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。更具体地，恒定区可来自IgG2。本发明的抗体和抗原结合片段还可用于一般靶向表达或过表达Siglec-15的细胞，所述细胞包括骨细胞和乳腺癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞和肾癌细胞以及黑素瘤细胞和中枢神经系统的癌细胞。更具体地，抗体和抗原结合片段可用于靶向经历分化的破骨细胞。本发明在其一方面提供了可能够与SEQ ID N0:2特异性结合的分离的或基本上纯化的抗体或抗原结合片段。更具体地且根据本发明的一个实施方案，抗体或抗原结合片段可与位于SEQ IDNO:2的第20位氨基酸和第259位氨基酸之间的结构域结合。根据本发明的另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可能够与SEQ ID N0:2的第20位氨基酸和第259位氨基酸内包含的表位结合。这样，本发明涵盖对SEQ ID NO:2具有特异性的诊断性和/或治疗性抗体或抗原结合片段。本发明还涵盖具有与本发明的抗体相同的表位特异性的抗体或抗原结合片段。通过确定是否其将与本文所描述的抗体结合的表位结合和/或通过用已知与表位结合的抗体或抗原结合片段进行竞争测定可鉴定候选抗体。因此，本发明的另一方面提供了能够与本文所描述的抗体或抗原结合片段竞争的分离的抗体或抗原结合片段。在另外的方面，本发明提供了利用本发明的抗体或抗原结合片段进行治疗的方法和检测的方法。术语“抗体”是指完整的抗体、单克隆抗体或多克隆抗体。术语“抗体”还涵盖多特异性抗体，诸如双特异性抗体。人抗体通常由两条轻链和两条重链组成，每条链包含可变区和恒定区。轻链可变区包含3个⑶R，本文认定为⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3，两侧为框架区。重链可变区包括3个⑶R，本文认定为⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3，两侧为框架区。如本文所用的术语“抗原结合片段”，是指保留与抗原(例如，SEQ ID N0:2或其变体)结合的能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可由完整的抗体的片段来执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由\、VH、(^和Cm结构域组成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，包括两个在铰链区通过二硫桥连接的Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由Vh和Cm结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体的单臂的Vlj和Vh结构域组成，(v)dAb片段(Ward等，(1989) Nature 341:544-546),其由Vh结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(⑶R)，例如，Vh⑶R3。并且，虽然Fv片段的两个结构域'和Vh由独立的基因所编码，但可利用重组方法通过能使它们作为单一多肽链的合成连接子将它们结合，其中在所述单一多肽链中'和VHg配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv);参见，例如，Bird 等.(1988) Science 242:423-426 ;和 Huston 等.(1988)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。所述单链抗体也意在涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”之中。并且，抗原结合片段包括结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)结合结构域多肽(诸如重链可变区、轻链可变区或通过连接子肽与轻链可变区融合的重链可变区)，其与免疫球蛋白铰链区多肽融合，(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。可通过将一个或多个半胱氨酸残基用丝氨酸残基取代来修饰铰链区以防止二聚化。US 2003/0118592和US 2003/0133939中也公开了所述结合结构域免疫球蛋白融合蛋白。利用本领域中的技术人员已知的常规技术获得 这些抗体片段，并筛选所述片段的与完整的抗体相同的效用。典型抗原结合位点包括由免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的配对形成的可变区。抗体可变区的结构是非常一致的并表现出非常相似的结构。这些可变区通常包括相对同源的框架区(FR)，其与称作互补决定区(CDR)的3个高变区间隔。抗原结合片段的总结合活性通常受⑶R序列的支配。FR通常在对于最优抗原结合的⑶R的适当定位和三维排列中起作用。本发明的抗体和/或抗原结合片段可源于例如，小鼠、大鼠或任何其它哺乳动物或源于诸如通过重组DNA技术的其它来源。本发明的另外的范围、适用性和优点将从下文给出的非限制性详细描述中变得显而易见。然而，应理解地是，在表明本发明的示例性实施方案时，该详细描述参照附图仅以实例的方式给出。发明详述破骨细胞和正常组织中Siglec-15的表达谱本发明涉及单克隆抗体靶向见于多种骨相关疾病中的破骨细胞的用途，其中在所述骨相关疾病中，观察到由于破骨细胞增高的活性导致严重骨丢失。为了将抗体定向到破骨细胞，必须进行在细胞的细胞表面表达的破骨细胞特异性抗原的鉴定。存在若干对于鉴定细胞特异性抗原可用的技术，并且用来在用RANKL处理的分化中的破骨细胞中鉴定Siglec-15的方法(称作基于消减转录的mRNA的扩增(STAR)的创新性探索平台)描述在公布的专利申请第PCT/CA2007/000210号中。人破骨细胞STAR文库的分析产生了编码分泌蛋白和细胞表面蛋白的许多基因。这些其中之一称作AB-0326，含有编码328个氨基酸的多肽的开放阅读框，所述多肽对应于由具有SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列的987个碱基对的cDNA编码的SEQ ID NO:2。公众可获得的数据的研究显示AB-0326核苷酸序列与称作⑶33抗原样3 (⑶33L3)的人基因的核苷酸序列相同。后来发现CD33L3是唾液酸结合蛋白的Siglec家族的成员，且基于与其它Siglec的同源性被重命名为Siglec-15 (Crocker等，2007)。基于该信息,分离了小鼠直系同源基因并测序，发现其在氨基酸水平上与人序列约85%相同。SEQ ID N0:3和SEQ IDN0:4分别显示了鼠类Siglec-15的cDNA和多肽的序列。生物信息学分析预测了 I型膜锚定蛋白，其呈现了其对于胞外区室的功能性结构域。与其它Siglec序列一样,氨基末端信号肽(位于SEQ ID NO: 2的第I位和第19位氨基酸之间)将该蛋白靶向细胞的膜，且通过位于羧基末端的单个跨膜螺旋(位于SEQ ID NO: 2的第261位和第283位氨基酸之间)将最终加工过的蛋白质锚定于膜。V-set Ig结构域位于SEQ ID NO:2的第49位和第165位氨基酸之间，而C2-set Ig结构域位于SEQ ID NO:2的第178位和第244位氨基酸之间。本发明涉及破骨细胞的分化过程中的Siglec-15的功能。先前的发现(Sooknanan等，2007)证实了响应于RANKL的编码人Siglec-15的转录物是显著上调的。该测定在RNA宏阵列(macroarray)上进行,其含有来自来自不同的人PBMNC供体的一些不同的人破骨细胞分化实验的点印的总RNA样本。并且,这些研究(Sooknanan等.2007)揭示Siglec-15转录物在30个人正常组织的大组中仅在一个正常组织中表达，表明了 Siglec-15基因表达 的非常高的破骨细胞特异性。利用更灵敏的方法诸如半定量RT-PCR，在许多破骨细胞样本中在RANKL处理一天之内刺激了 Siglec-15mRNA的表达，表明该基因在细胞融合开始之前在破骨细胞前体细胞中早期表达。最后，通过半定量RT-PCR评估了 Siglec-15的组织表达谱，并发现其仅在单一正常人组织中表达，因此验证了 Sooknanan等的宏阵列结果。总之，如通过Siglec-15所例证的，这些表达结果强调了申请人的探索方法在其鉴定高度限制于分化中的破骨细胞的靶标的能力中的效力。基于Siglec-15在破骨细胞的分化的早期的表达、其在正常组织中的有限表达和Siglec-15在破骨细胞的活性中的关键的生物学作用，选择Siglec-15作为治疗靶标以用于开发用来检测、预防和治疗骨相关疾病(诸如癌症诱导的骨丢失和骨质疏松症)的单克隆抗体。因此，提供了多种抗Siglec-15抗体和其具有免疫功能的片段，诸如用于靶向Siglec-15的嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体、抗体片段、单链抗体、结构域抗体和具有抗原结合区的多肽。[SEQ ID NO:2作为抗原和来源于SEQ ID NO:2的表位在国际申请第PCT/CA2007/000210号中，申请人意外地发现SEQ ID N0:2参与破骨细胞分化。因此该抗原可用来在体外或在体内靶向表达抗原的细胞，和用于开发用来在体外或在体内测量抗原的检测测定。因此本发明提供了用于产生特异性抗体和/或对表达SEQ ID N0:2的细胞特异的抗原。该抗原或表位可包含SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:2变体的至少10个氨基酸(和高达总长度)的片段。一个示例性的抗原是完全SEQ ID N0:2蛋白或与SEQ ID NO:2具有至少80%序列同一性的变体形式或包含SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:2变体的至少10个氨基酸的片段。本文所描述的抗原或表位可与载体诸如匙孔血蓝蛋白(KHL)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或其它载体融合以产生抗体和抗原结合片段。本发明还提供了在SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸中包含的表位以产生本文所描述的抗体和抗原结合片段。表位可包含在SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸中或在SEQ ID NO:2变体的对应部分中包含的至少10个氨基酸的片段。本发明还提供了用于产生针对SEQ ID NO: 2或针对SEQ ID NO: 2变体的抗体的组合物，该组合物可包含在SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸中或在SEQ I N0:2变体的对应部分中包含的SEQID NO:2的表位和载体。组合物的示例性实施方案是用于产生针对SEQ ID NO: 2或针对SEQ ID NO: 2变体的抗体的药物组合物。该药物组合物可包含在SEQ ID NO: 2的第20位至第259位氨基酸中或在SEQ ID NO: 2变体的对应部分中包含的SEQ ID NO: 2的表位和药学上可接受的载体。在又一个另外的方面，本发明提供了用于产生针对SEQ ID NO:2或针对SEQ IDNO:2变体的抗体的方法。该方法可包括施用多肽，所述多肽包含在SEQ ID N0:2的第20位至第259位氨基酸中或在SEQ ID NO:2变体的对应部分中包含的SEQ ID NO:2的表位。在再一方面，本发明提供了在SEQ ID N0:2的第20位至第259位氨基酸中或在 SEQ ID NO:2变体的对应部分中包含的SEQ ID NO:2的表位用于产生针对SEQ ID N0:2或针对SEQ ID N0:2变体的抗体的用途。与SEQ ID NO:2具有80%同一性的SEQ ID NO:2变体的示例性实施方案包括例如但不限于，SEQ ID N0:4和以以下gene bank登录号或NCBI参照序列公布于数据库中的其它类似物AAY40743. I、XP_512109. 2、XP_001089000. I、XP_601064. 4、NP_001094508. I、XP_855238. 1、XP_574176. 2 和 EAX01462. I。与SEQID NO:2或SEQ ID NO:2变体结合的抗体和抗原结合片段关于其对于目标抗原的特异性首先从Fab文库中分离抗体。抗体的轻链可变域或重链可变域的氨基酸序列的比较所显示的最突出的特征使我们取得CDR中和可变区中的共有序列。SEQ ID NO: 148-158 和 197-210 中提供了 CDR 的共有序列。SEQ ID NO: 191-196中提供了可变区的共有序列。本文所描述的可变区可与期望的物种的恒定区融合从而允许通过期望的物种的效应细胞来识别抗体。恒定区可来源于，例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亚型。在框中克隆或合成恒定区与可变区在本领域技术人员的技术范围内，并且可例如通过重组DNA技术来进行。在本发明的某些实施方案中，与SEQ ID N0:2结合的抗体可以是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亚型。本发明的更具体的实施方案涉及IgGl亚型的抗体。抗体可以是IgGl亚型的人源化抗体，其在调节抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体介导的细胞毒性(CMC)中具有生物活性，或与免疫复合物有关。典型的ADCC包括自然杀伤(NK)细胞的激活并依赖于NK细胞的表面上的Fe受体对抗体覆盖的细胞的识别。Fe受体识别抗体的Fe结构域,诸如存在于IgGl上的，其与靶细胞的表面结合，所述靶细胞特别是表达抗原诸如SEQ ID N0:2的骨细胞。一旦与IgG的Fe受体结合后，NK细胞释放细胞因子和细胞毒性颗粒，其进入靶细胞并通过触发细胞凋亡来促使细胞死亡。本发明描述了一系列与SEQ ID NO:2结合的抗体。在某些实施方案中，抗体可选自由以下组成的组多克隆抗体、单克隆抗体(诸如嵌合抗体或人源化抗体)、抗体片段(诸如抗原结合片段)、单链抗体、结构域抗体和具有抗原结合区的多肽。本发明因此在其另一方面提供了包含轻链可变域的分离的抗体或抗原结合片段，所述轻链可变域具有a.选自由以下组成的组的 CDRLl 序列SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:75, SEQ IDN0:81、SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO: 105,SEQ ID NO: IlUSEQID NO:173、SEQ ID NO:179 和 SEQ ID NO:185 ；b.选自由以下组成的组的 CDRL2 序列SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:76. SEQ IDNO:82,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:112,SEQID NO: 174、SEQ ID NO: 180 和 SEQ ID NO: 186 和 / 或；c.选自由以下组成的组的 CDRL3 序列SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:77, SEQ IDNO:83,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO: 10USEQ ID NO: 107,SEQ ID NO: 113,SEQID NO:175、SEQ ID NO:181 和 SEQ ID NO:187。
分离的抗体或抗原结合片段还可包括重链可变域，所述重链可变域具有a.选自由以下组成的组的 CDRHl 序列SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:78, SEQ IDNO:84,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:I14,SEQID NO:176、SEQ ID NO:182 和 SEQ ID NO:188 ；b.选自由以下组成的组的 CDRH2 序列SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:79, SEQ IDNO:85,SEQ ID N0:91、SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:115,SEQID NO: 177、SEQ ID NO: 183 和 SEQ ID NO: 189 和 / 或;c.选自由以下组成的组的 CDRH3 序列SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:86,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:116,SEQID NO:178、SEQ ID NO:184 和 SEQ ID NO:190。在另一方面，本发明提供了分离的抗体或抗原结合片段，其可包含具有以下的轻链可变域a)CDRLl，所述 CDRLl 与选自由 SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO:69、SEQ ID N0:75 和SEQ ID NO: 105组成的组的⑶RLl序列可具有至少80%同一性b)CDRL2，所述CDRL2 与选自由 SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 76、SEQID NO:82和SEQ ID NO: 106组成的组的CDRL2序列可具有至少80%同一性，或；c)CDRL3，所述CDRL3 与选自由 SEQ ID N0:151、SEQ ID NO: 152,SEQ ID NO: 77,SEQID NO:83,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO: 107 和 SEQ ID NO: 152 组成的组的 CDRL3 序列可具有
至少80%同一性。在又一另外的方面，本发明提供了分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含具有以下的重链可变域a) CDRHl，所述CDRHl 与选自由 SEQ ID NO: 153,SEQ ID NO: 154,SEQ ID NO:84,SEQID NO:96和SEQ ID NO: 102组成的组的CDRHl序列可具有至少80%同一性；b)CDRH2，所述CDRH2 与选自由 SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQID NO:73、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:103 和 SEQ ID NO:109组成的组的⑶RH2序列可具有至少80%同一性，或；c)CDRH3，所述 CDRH3 与选自由 SEQ ID NO: 158,SEQ ID NO: 74,SEQ ID NO:98,SEQID NO: 104,SEQ ID NO: 110和SEQ ID NO: 116组成的组的CDRH3序列可具有至少80%同一性。
在一个示例性实施方案中，抗体或抗原结合片段可包含轻链可变区的任何单独的⑶R或⑶R1XDR2和/或⑶R3的组合。更具体地可选择⑶R3。组合可包括例如，⑶RLl和CDRL3 ;CDRLI 和 CDRL2 ;CDRL2 和 CDRL3 和；CDRL2 和 CDRL3。在另一个示例性实施方案中，抗体或抗原结合片段可包含重链可变区的任何单独的⑶R或⑶R1XDR2和/或⑶R3的组合。更具体地可选择⑶R3。组合可包括例如，⑶RHl和 CDRH3 ;CDRH1 和 CDRH2 ;CDRH2 和 CDRH3 和；CDRH1、CDRH2 和 CDRH3。根据本发明，抗体或抗原结合片段可包含⑶RL1、⑶RL2或⑶RL3中的至少两个CDR。还根据本发明，抗体或抗原结合片段可包含一个⑶RLl、一个⑶RL2和一个⑶RL3。再根据本发明，抗体或抗原结合片段可包含
a. CDRL1、CDRL2 或 CDRL3 中的至少两个 CDR，和；b.⑶RHl、一个⑶RH2或一个⑶RH3中的至少两个⑶R。更优选地，抗体或抗原结合片段可包含一个⑶RLl、一个⑶RL2和一个⑶RL3。更优选地，抗体或抗原结合片段还可包含一个⑶RHl、一个⑶RH2和一个⑶RH3。在另一方面，本发明提供了分离的抗体或抗原结合片段，其包含具有以下的重链可变域a.选自由以下组成的组的 CDRHl 序列SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:78, SEQ IDNO:84,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:I14,SEQID NO:176、SEQ ID NO:182 和 SEQ ID NO:188 ；b.选自由以下组成的组的 CDRH2 序列SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:79, SEQ IDNO:85,SEQ ID N0:91、SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:115,SEQID NO: 177、SEQ ID NO: 183 和 SEQ ID NO: 189 和 / 或;c.选自由以下组成的组的 CDRH3 序列SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:86,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:116,SEQID NO:178、SEQ ID NO:184 和 SEQ ID NO:190。根据本发明，抗体或抗原结合片段可包含一个⑶RHl、一个⑶RH2或一个⑶RH3。根据本发明，抗体或抗原结合片段还可包含一个⑶RHl、一个⑶RH2和一个⑶RH3。当仅轻链可变域或重链可变域其中之一可用时，可利用本领域中已知的方法通过筛选互补可变域的文库来重构抗体或抗原结合片段(Portolano等，The Journal ofImmunology(1993) 150:880-887，Clarkson 等，Nature(1991)352:624-628)。本发明还涵盖多肽或抗体，所述多肽或抗体包含在本文所描述的CDR的至少一个中具有至少一个保守氨基酸置换的可变链。本发明还涵盖多肽或抗体，所述多肽或抗体包含在⑶R的至少两个中具有至少一个保守氨基酸置换的可变链。本发明还涵盖多肽或抗体，所述多肽或抗体包含在3个⑶R中具有至少一个保守氨基酸置换的可变链。本发明还涵盖多肽或抗体，所述多肽或抗体包含在⑶R的至少一个中具有至少两个保守氨基酸置换的可变链。本发明还涵盖多肽或抗体，所述多肽或抗体包含在⑶R的至少两个中具有至少两个保守氨基酸置换的可变链。本发明还涵盖多肽或抗体，所述多肽或抗体包含在3个CDR中具有至少两个保守氨基酸置换的可变链。在另一方面，本发明涉及多肽、抗体或抗原结合片段，所述多肽、抗体或抗原结合片段(在单一多肽链上或在不同的多肽链上)包含本文所描述的抗体或抗原结合片段其中之一的轻链可变域的至少一个互补决定区和重链可变域的至少一个互补决定区。本发明在其另一方面涉及可(在单一多肽链上或在不同的多肽链上)包含本文所描述的抗体或抗原结合片段的全部6个互补决定区(CDR)的抗体。本发明的抗体或抗原结合片段还可包含位于CDR的氨基区和/或羧基区两侧的另外的氨基酸。那些另外的氨基酸可与本文所描述的对应的抗体的框架区相同或可包括例如，保守氨基酸置换。 根据本发明的一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRLl序列，该CDRLl序列包括或由下式组成RSXlaX2aSLLHSNGX3aTYLY(SEQ ID NO: 148)，其中Xla可以是例如，中性亲水性氨基酸；其中X2a可以是例如，赖氨酸或谷氨酸。其中X3a可以是例如，疏水性氨基酸或天冬酰胺。在一个更具体的实施方案中，Xla可以是例如，丝氨酸。在一个更具体的实施方案中，X2a可以是例如，赖氨酸。更具体地，X3a可以是例如，异亮氨酸或缬氨酸。 在一个更具体的实施方案中，X3a可以是异亮氨酸。根据本发明的又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRLl序列，该⑶RLl序列包括或由下式组成RASXaloNIXbloXcloYLA(SEQ ID NO: 197)其中Xaltl可以是任何氨基酸或例如G或E ;Xbltl可以是任何氨基酸或例如Y或H，和；Xcltl可以是任何氨基酸或例如S或N。根据本发明的又一另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRLl序列，该CDRLl 序列包括或由下式组成式 RSSX1xSLLHSNGX2xTYLY(SEQ ID N0:201)的 CDRL1，其中 Xlx和X2x如本文所定义。根据本发明的又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRLl序列，该CDRLl序列包括或由下式组成式RSXa6KSLLHSNGNTYLY(SEQ ID NO:202)的CDRL1，其中Xa6如本文所定义。抗体或抗原结合片段还可包含例如⑶RLl序列，所述⑶RLl序列选自包括或由SEQID N0:75、SEQ ID N0:69、SEQ ID NO: 105和表3或表5B中所列的其它CDRLl组成的那些序列。根据另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含⑶RL2序列，该⑶RL2序列包括或由下式组成XlbMSNLAS(SEQ ID NO: 149)，
其中Xlb可以是例如，碱性氨基酸。更具体地，Xlb可以是例如，谷氨酰胺或天冬酰胺。在一个更具体的实施方案中，Xlb可以是谷氨酰胺。根据又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含⑶RL2序列，该⑶RL2序列包括或由下式组成RXlcSNLX2cS(SEQ ID NO: 150)，其中X1。可以是例如，蛋氨酸或苏氨酸并且其中X2。可以是例如，疏水性氨基酸。更具体地，X2。可以是例如，丙氨酸或缬氨酸。在一个更具体的实施方案中，X1。可以是例如，蛋氨酸。 在一个更具体的实施方案中，X2。可以是例如，丙氨酸。根据本发明的又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRL2序列，该⑶RL2序列包括或由下式组成NAKTLXallXbll (SEQ ID NO: 198)Xall可以是任何氨基酸或例如P或A，和；Xbll可以是任何氨基酸或例如酸性氨基酸诸如E或D。抗体或抗原结合片段还可包含例如⑶RL2序列，所述⑶RL2序列选自包括或由SEQID NO:76, SEQ ID N0:82、SEQ ID NO: 106和表3或表5B中所列的其它CDRL2组成的那些序列。根据又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRL3序列，该CDRL3序列包括或由下式组成XldQX2dLEX3dPX4dT(SEQ ID NO: 151)其中Xld可以是例如，疏水性氨基酸；其中X2d可以是例如，碱性氨基酸；其中X3d可以是例如，酪氨酸或亮氨酸，和；其中X4d可以是例如，芳香族氨基酸。更具体地，Xld可以是例如，蛋氨酸或丙氨酸。在一个更具体的实施方案中，Xld可以是例如，蛋氨酸。更具体地，X2d可以是，例如组氨酸或天冬酰胺。在一个更具体的实施方案中，乂2(1可以是例如，组氨酸。在一个更具体的实施方案中，X3d可以是例如，酪氨酸。更具体地，X4d可以是例如，酪氨酸或苯丙氨酸。在一个更具体的实施方案中，乂4(1可以是例如，酪氨酸。根据另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含⑶RL3序列，该⑶RL3序列包括或由下式组成QQffSSNPXleT(SEQ ID NO: 152)其中Xle是脯氨酸或亮氨酸。根据本发明的又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRL3序列，该⑶RL3序列包括或由下式组成QHYGXal2PLT(SEQ ID NO: 199)
Xal2可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如A或V。根据本发明的另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含⑶RL3序列，该⑶RL3序列包括或由下式组成Xa8QXb8LEXe8PYT (SEQ ID NO: 203)，其中Xa8本文所定义。根据本发明的又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRL3序列，该⑶RL3序列包括或由下式组成=QHHYGXa4PLT(SEQ ID NO:204)，其中Xa4如本文所定义。抗体或抗原结合片段还可包括例如⑶RL3序列，所述⑶RL3序列选自包括或由SEQID NO:77,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO: 107,SEQ ID NO: 152 和表 3 和表 5B 中所列的其它CDRL3组成的那些序列。根据另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含⑶RHl序列，该⑶RHl序列包括或由下式组成 GYTFXlfX2fYX3fMX4f(SEQ ID NO: 153)其中Xlf可以是例如，苏氨酸或天冬酰胺；其中X2f可以是例如，苏氨酸、精氨酸、丝氨酸或天冬氨酸；其中X3f可以是例如，色氨酸或天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸，和；其中X4f可以是例如，酪氨酸、组氨酸或天冬氨酸。在一个更具体的实施方案中，Xlf可以是例如，苏氨酸。在一个更具体的实施方案中，X2f可以是例如，丝氨酸。在一个更具体的实施方案中，X3f可以是例如，色氨酸。在一个更具体的实施方案中，X4f可以是例如，组氨酸。根据又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRHl序列，该CDRHl序列包括或由下式组成GYTFTDYX5fMH(SEQ ID NO: 154)其中X5f可以是例如，酸性氨基酸。更具体地，X5f可以是例如，谷氨酸或天冬氨酸。在一个更具体的实施方案中，X5f可以是例如，天冬氨酸。根据本发明的另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含⑶RHl序列，该⑶RHl序列包括或由下式组成=Gytftx11YWmkseq id no:205)，其中X11如本文所定义。根据本发明的又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRHl序列，该CDRHl序列包括或由下式组成GYTFTDYXlsMH(SEQ ID NO: 208)，其中Xls如本文所定义。抗体或抗原结合片段还可包含例如⑶RHl序列，所述⑶RHl序列选自包括或由SEQID NO:84, SEQ ID N0:96、SEQ ID NO: 102和表3或表5A所列的其它CDRHl组成的那些序列。根据另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含⑶RH2序列，该⑶RH2序列包括或由下式组成LINPXlgNX2gRX3gN(SEQ ID NO: 155)其中Xlg可以是例如，中性疏水性氨基酸；其中X2g可以是例如，丙氨酸或甘氨酸，和；其中X3g可以是例如，脯氨酸或苏氨酸。更具体地，Xlg可以是例如，丝氨酸或苏氨酸。在一个更具体的实施方案中，Xlg可以是例如，苏氨酸。在一个更具体的实施方案中，X2g可以是例如，甘氨酸。在一个更具体的实施方案中，X3g可以是例如，苏氨酸。根据又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH2序列，该CDRH2序列包括或由下式组成XlhIDPETGGTA(SEQ ID NO: 156)其中Xlh可以是例如，丙氨酸或苏氨酸。根据一个更具体的实施方案，Xlh可以是，例如，苏氨酸。根据又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH2序列，该CDRH2序 列包括或由下式组成EIXliPX2iX3iSX4iX5iN(SEQ ID NO: 157)其中Xli可以是例如，天冬氨酸或天冬酰胺；其中X2i可以是例如，天冬氨酸或丝氨酸；其中X3i可以是例如，天冬氨酸或丝氨酸；其中X4i可以是例如，酪氨酸或苏氨酸，和；其中X5i可以是例如，苏氨酸或异亮氨酸。根据本发明的又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH2序列，该⑶RH2序列包括或由下式组成AXal3YPGNGDSR(SEQ ID NO:200)Xal3可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如I或V。根据本发明的另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含⑶RH2序列，该⑶RH2序列包括或由下式组成=XltIDPETGGTA(SEQ ID NO:206)，其中Xlt如本文所定义。根据本发明的又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH2序列，该 CDRH2 序列包括或由下式组成LINPXlmNX2mRX3mN(SEQ ID NO: 207)，其中 Xlm、X2n^P X3m 如本文所定义。根据本发明的又一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含⑶RH2序列，该⑶RH2序列包括或由下式组成=XltIDPETGGTA(SEQ ID NO:209)，其中Xlt如本文所定义。抗体或抗原结合片段还可包括例如⑶RH2序列,所述⑶RH2序列选自包括或由SEQID NO:73、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:103 和 SEQ ID NO:109和表3或表5A所列的其它⑶RH2组成的那些序列。根据另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含⑶RH3序列，该⑶RH3序列包括或由下式组成TXljFYYX2jX3jX4jNYDVGFAY(SEQ ID NO: 158)其中Xlj可以是例如，中性亲水性氨基酸；其中X2j可以是例如，中性亲水性氨基酸；其中X3j可以是例如，酪氨酸或组氨酸，和；其中X4j可以是例如，酪氨酸或丝氨酸。更具体地，Xlj可以是例如，丝氨酸或苏氨酸。在一个更具体的实施方案中，XuI以是例如，丝氨酸。
更具体地，X2j可以是例如，丝氨酸或苏氨酸。在一个更具体的实施方案中，X2j可以是例如，苏氨酸。在一个更具体的实施方案中，X3j可以是例如，酪氨酸。在一个更具体的实施方案中，X4j可以是例如，丝氨酸。根据本发明的另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含⑶RH3序列，该⑶RH3序列包括或由下式组成TX1vFYYX2vX3vX4vNYDVGFAY(SEQ ID NO: 210)，其中 Xlv、X2v、X3v 和 X4v如本文所定义。抗体或抗原结合片段可包括例如⑶RH3序列，所述⑶RH3序列选自包括或由SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 116 和表 3 或表 5A所列的其它CDRH3组成的那些序列。本文所描述的重链和/或轻链的框架区可来源于本文所示出的框架区中的一个或多个。因此抗体或抗原结合片段可包含本文所描述的CDR中的一个或多个(例如，选自特异性的⑶R或选自共有⑶R SEQ ID NO: 148-158和197-210)和来源于本文所示出的轻链可变区或重链可变区的框架区。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段可包含具有下式的重链可变区(或片段)XlkX2kQxaQQx4kX5kX6kEx7kVx8kPGASVKLSCKASGYTFTx11 YWMHWVKQRPGQGLEWIGLINPXlmNX2niRX3niNYNEXlnFX2nX3nKATLTVDKSSSTAYMX4nLSSLTSEDSAVYYCARG⑶⑶YFDYWGQGTTLTVSS (SEQ IDNO:191)其中Xlk可以是例如Q或E ;X2k可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如V或I ;X3k可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如V或L ;X4k可以是任何氨基酸或例如P或S ;X5k可以是任何氨基酸或例如R或G ;X6k可以是任何氨基酸或例如A或T ;X7k可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如L或I ;X8k可以是任何氨基酸或碱性氨基酸诸如例如R或K ;X11可以是任何氨基酸或中性亲水性氨基酸诸如例如例如S或T ;Xlni可以是任何氨基酸或中性亲水性氨基酸诸如例如T或S ;X2m可以是任何氨基酸或例如G或A ;X3m可以是任何氨基酸或例如P或T ;Xln可以是任何氨基酸或碱性氨基酸诸如例如K或R ;X2n可以是任何氨基酸或碱性氨基酸诸如例如N或K ;X3n可以是任何氨基酸或例如N或中性亲水性氨基酸诸如S或T，和；X4n可以是任何氨基酸或碱性氨基酸诸如例如Q或H。在本发明的另一个实施方案，本发明的抗体或抗原结合片段可包含具有下式的重链可变区(或片段)Xl0VX20LQQSGAELARPGASVKFSCKASGYTFTRNWIQWVKQRPGQGLEWIGAXal3YPGNGDSRYTQKFKGKATLTADKSSXlqTAYMQLX2qX3qLX4qSEDSAVYYCARLAGNYAYYFDYWGQGTALTVSS(SEQ ID NO: 192)
其中X1。可以是例如Q或D ;X2。可以是任何氨基酸或碱性氨基酸诸如例如K或Q ;Xal3可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如I或V ;Xlq可以是任何氨基酸或例如S或N ;X2q可以是任何氨基酸或例如S或N ;X3q可以是任何氨基酸或例如G或S，和；X4q可以是任何氨基酸或例如A或S。在本发明的又一个另外的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段可包含具有下式的重链可变区(或片段) XlrX2rX3rLQQSGX4rELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYXlsMHWVKQTPVHGLEWIGXltIDPETGGTAYNQKFKGKATLTADX1uSSX2uTAYMELSSLTSEDSAVYYCTX1vFYYX2vX3vX4vNYDVGFAYWGQGTLVTVSA(SEQ idNO:193)其中Xk可以是例如E或Q ;X&可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如A或I ;X3r可以是任何氨基酸或例如Y或Q ;X#可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如A或V ;Xls可以是任何氨基酸或酸性氨基酸诸如例如D或E ;Xlt可以是任何氨基酸或例如A或T ;Xlu可以是任何氨基酸或碱性氨基酸诸如例如K或R ;X2u可以是任何氨基酸或中性亲水性氨基酸诸如例如S或T ;Xlv可以是任何氨基酸或中性亲水性氨基酸诸如例如S或T ;X2v可以是任何氨基酸或中性亲水性氨基酸诸如例如T或S ;X3v可以是任何氨基酸或例如Y或H，和；X4v可以是任何氨基酸或例如S或Y。在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段可包含具有下式的轻链可变区(或片段)DIVMTX1wAX2wFSNPVX3wLGTX4wASISCRSSX1xSLLHSNGX2xTYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSXlySGSGTX2yFTLRISRVEAEDVGVYYCXa8QXb8LEXc8PYTFGXa9GTKLEIK(SEQ ID NO: 194)其中Xlw可以是任何氨基酸或碱性氨基酸诸如例如Q或H ;X2w可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如V或A ;X3w可以是任何氨基酸或例如T或I ;X4w可以是任何氨基酸或例如S或P ;Xlx可以是任何氨基酸或例如E或K ;X2x可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如V或I ;Xly可以是任何氨基酸或例如S或G ;X2y可以是任何氨基酸或例如D或A ;Xa8可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如M或A ;Xb8可以是任何氨基酸或碱性氨基酸诸如例如N或H ;Xe8可以是任何氨基酸或例如Y或L，和；
Xa9可以是任何氨基酸或例如G或S。在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段可包含具有下式的轻链可变区(或片段)XlzIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASXal0NIXbl0Xcl0YLAWY QQKQGKSPQLLVYNAKTLXallXbllGVXa3Xb3RFSGSGSGTQXc3SL KINXd3LQPEDFGSYXe3CQHHYGXa4PLTFGXa5GTKXb5ELK(SEQ ID NO: 195)其中Xlz可以是任何氨基酸或例如D或N ;Xaltl可以是任何氨基酸或例如E或G ;Xbltl可以是任何氨基酸或例如Y或H ;Xeltl可以是任何氨基酸或例如S或N ; Xallll可以是任何氨基酸或例如P或A ;Xbll可以是任何氨基酸或酸性氨基酸诸如例如E或D ;Xa3可以是任何氨基酸或例如P或S ;Xb3可以是任何氨基酸或例如V或S ;Xe3可以是任何氨基酸或芳香族氨基酸诸如例如F或Y ;Xd3可以是任何氨基酸或例如N或S ;Xe3可以是任何氨基酸或例如H或Y ;Xa4可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如A或V ;Xa5可以是任何氨基酸或例如S或A，和；Xb5可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如V或L。在又一个另外的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段可包含具有下式的轻链可变区(或片段)DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSXa6KSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRXa7SRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:196)其中Xa6可以是任何氨基酸或中性亲水性氨基酸诸如例如S或T，和；Xa7可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如I或L。与Siglec-15结合的抗体在本发明的某些实施方案中，与Siglec-15结合的抗体是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亚型。在优选的实施方案中，抗体是IgG2亚型的抗体。在本实施方案中，抗体是IgG2亚型的人源化抗体，其在阻断破骨细胞表面上正常Siglec-15功能的生物活性中具有生物学活性。所述阻断，例如，可防止Siglec-15与其底物、其配体、其自身或相邻细胞上的其它蛋白质缔合。本发明公开了一系列与Siglec-15结合的抗体。在某些实施方案中，抗体由单克隆抗体和其具有免疫学功能的片段组成，诸如嵌合和人源化单克隆抗体、抗体片段、单链抗体、结构域抗体和具有抗原结合区的多肽。典型的抗原结合位点包括由免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的配对形成的可变区。抗体可变区的结构是非常一致的并表现出非常相似的结构。这些可变区通常包括相对同源的框架区(FR)，其与称作互补决定区(CDR)的3个高变区间隔。虽然抗原结合片段的总结合活性受CDR序列的支配，但FR在对于最优抗原结合的CDR的合适的定位和三维排列中起关键作用。
表I公开了与抗Siglec-15抗体的特定实例的完整的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链对应的核苷酸和氨基酸的序列。表I-与Siglec-15结合的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的完整序列
权利要求
1.一种分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段能够与能促进破骨细胞分化的多肽结合并具有与唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素15(Siglec-15 ；SEQ IDNO:2)的第20位至第259位氨基酸至少80%相同的序列，其中所述抗体或抗原结合片段能够抑制破骨细胞分化、骨再吸收或能够阻断Siglec-15与唾液酸结合。
2.如权利要求I所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够抑制破骨细胞前体细胞分化成分化的破骨细胞。
3.如权利要求2所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的抗体或抗原结合片段是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或其片段。
4.如权利要求3所述的分离的抗体或抗原结合片段，特征在于其从分离的哺乳动物细胞产生。
5.如权利要求4所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的哺乳动物细胞是人细胞。
6.如权利要求5所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或其片段。
7.如权利要求6所述的分离的抗体或抗原结合片段，特征在于其为包含人抗体的恒定区或其片段的氨基酸的嵌合抗体或人抗体。
8.如权利要求7所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述恒定区或其片段来自IgGU IgG2、IgG3 或 IgG4。
9.如权利要求8所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述恒定区来自IgG2。
10.如权利要求3所述的分离的抗体或抗原结合片段，特征在于其为包含人抗体的恒定区或其片段的氨基酸的嵌合抗体或人抗体。
11.如权利要求10所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述恒定区或其片段来自IgGU IgG2、IgG3 或 IgG4。
12.如权利要求11所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述恒定区来自IgG2。
13.如权利要求2所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是FV (scFv) > Fab> Fab'或(Fab' )2。
14.如权利要求2所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述破骨细胞前体细胞是人破骨细胞前体细胞。
15.如权利要求8所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述人破骨细胞前体细胞是原代人破骨细胞前体细胞。
16.如权利要求9所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的抗体或抗原结合片段是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或其片段。
17.如权利要求16所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的抗体或抗原结合片段是单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或其片段。
18.如权利要求17所述的分离的抗体或抗原结合片段，特征在于其为包含人抗体的恒定区或其片段的氨基酸的嵌合抗体或人抗体。
19.如权利要求18所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述恒定区或其片段来自IgGU IgG2、IgG3 或 IgG4。
20.如权利要求19所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述恒定区来自IgG2。
21.如权利要求I至20中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，特征在于与非变性的Siglec-15结合。
22.如权利要求21所述的抗体或抗原结合片段，特征在于其与Siglec-15而非Siglec-2或CD33特异性结合。
23.如权利要求I至22中任一项所述的抗体或抗原结合片段，特征在于Ing的抗体能够与少于500ng的SEQ ID NO:2结合。
24.一种分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段能够与SEQ IDNO: 2或与同SEQ ID NO: 2的第20位至第259位氨基酸具有至少80%序列同一性的变体特异性结合，且能够在卵巢癌细胞、肾癌细胞、中枢神经系统的癌细胞、前列腺癌细胞、黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或结肠癌细胞中检测所述SEQ ID NO:2或变体。
25.一种分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段能够与SEQ IDNO: 2或与同SEQ ID NO: 2的第20位至第259位氨基酸具有至少80%序列同一性的变体特异性结合，且能够抑制卵巢癌细胞、肾癌细胞、中枢神经系统的癌细胞、前列腺癌细胞、黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或结肠癌细胞的生长。
26.如权利要求I至25中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链可变域，所述轻链可变域包含选自由以下组成的组的序列与SEQ ID NO: 38至少70%相同的序列、与SEQ ID NO:42至少70%相同的序列、与SEQ ID NO:46至少70%相同的序列、与SEQ ID NO: 50至少70%相同的序列、与SEQ ID NO: 54至少70%相同的序列、与SEQID NO: 58至少70%相同的序列、与SEQ ID NO:62至少70%相同的序列、与SEQ ID NO:66至少70%相同的序列、与SEQ ID NO: 162至少70%相同的序列、与SEQ ID NO: 166至少70%相同的序列和与SEQ ID NO: 170至少70%相同的序列。
27.如权利要求I至26所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变域，所述重链可变域包含选自由以下组成的组的序列与SEQ ID NO:40至少70%相同的序列、与SEQ ID NO:44至少70%相同的序列、与SEQ ID NO:48至少70%相同的序列、与SEQID NO: 52至少70%相同的序列、与SEQ ID NO: 56至少70%相同的序列、与SEQ ID NO:60至少70%相同的序列、与SEQ ID NO: 64至少70%相同的序列、与SEQ ID NO: 68至少70%相同的序列、与SEQ ID NO: 164至少70%相同的序列、与SEQ ID NO: 168至少70%相同的序列和与SEQ ID NO: 172至少70%相同的序列。
28.一种分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段能够与Siglec-15或与其变体特异性结合,所述抗体包含 a)SEQ ID NO: 38中限定的轻链可变域的3个⑶R和SEQ ID NO: 40中限定的重链可变域的3个CDR， b)SEQID NO: 42中限定的轻链可变域的3个⑶R和SEQ ID NO: 44中限定的重链可变域的3个CDR ; c)SEQID NO: 46中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO: 48中限定的重链可变域的3个CDR ; d)SEQ ID NO: 50中限定的轻链可变域的3个⑶R和SEQ ID NO: 52中限定的重链可变域的3个CDR ; e)SEQID NO: 54中限定的轻链可变域的3个⑶R和SEQ ID NO: 56中限定的重链可变域的3个CDR ; f)SEQ ID NO: 58中限定的轻链可变域的3个⑶R和SEQ ID N0:60中限定的重链可变域的3个CDR ; g)SEQ ID NO:62中限定的轻链可变域的3个⑶R和SEQ ID N0:64中限定的重链可变域的3个CDR， h)SEQ ID NO:66中限定的轻链可变域的3个⑶R和SEQ ID N0:68中限定的重链可变域的3个CDR， i)SEQID NO: 162中限定的轻链可变域的3个⑶R和SEQ ID NO: 164中限定的重链可变域的3个⑶R， j) SEQ ID NO: 166中限定的轻链可变域的3个⑶R和SEQ ID NO: 168中限定的重链可变域的3个⑶R，和； k) SEQ ID NO: 170中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO: 172中限定的重链可变域的3个⑶R。
29.一种分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段能够与Siglec-15或与其变体特异性结合,所述抗体包含 a)与SEQID NO: 194具有至少70%序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO: 191具有至少70%序列同一性的重链可变域； b)与SEQID NO: 195具有至少70%序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO: 192具有至少70%序列同一性的重链可变域； c)与SEQID NO: 196具有至少70%序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO: 193具有至少70%序列同一性的重链可变域； d)与SEQID NO:38具有至少70%序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID N0:40具有至少70%序列同一性的重链可变域； e)与SEQID NO: 42具有至少70%序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO: 44具有至少70%序列同一性的重链可变域； f)与SEQID NO:46具有至少70%序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID N0:48具有至少70%序列同一性的重链可变域； g)与SEQID NO: 50具有至少70%序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO: 52具有至少70%序列同一性的重链可变域； h)与SEQID NO: 54具有至少70%序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO: 56具有至少70%序列同一性的重链可变域； i)与SEQID NO: 58具有至少70%序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:60具有至少70%序列同一性的重链可变域； j)与SEQ ID NO: 62具有至少70%序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO: 64具有至少70%序列同一性的重链可变域， k)与SEQ ID NO:66具有至少70%序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:68具有至少70%序列同一性的重链可变域， I)与SEQ ID NO: 162具有至少70%序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO: 164具有至少70%序列同一性的重链可变域，m)与SEQ ID NO: 166具有至少70%序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO: 168具有至少70%序列同一性的重链可变域，和； n)与SEQ ID NO: 170具有至少70%序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO: 172具有至少70%序列同一性的重链可变域。
30.如权利要求29所述的分离的抗体或抗原结合片段，特征在于其包含 a)轻链可变域，所述轻链可变域与SEQID NO: 194具有至少70%序列同一性且具有如SEQ ID N0:148 或 SEQ ID N0:201 中限定的 CDRL1、如 SEQ ID NO: 149 中限定的 CDRL2 和如SEQ ID NO: 151 或 SEQ ID NO:203 中限定的 CDRL3 和； b)重链可变域，所述重链可变域与SEQID NO: 191具有至少70%序列同一性且具有如SEQ ID NO: 153 或 SEQ ID NO: 205 中限定的 CDRHl、如 SEQ ID NO: 155 或 SEQ ID NO: 207 中限定的CDRH2和具有序列ARG⑶⑶YFDY的CDRH3。
31.如权利要求30所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRLl选自由RSSKSLLHSNGITYLY、RSSKSLLHSNGVTYLY 或 RSSESLLHSNGITYLY 组成的组。
32.如权利要求29或30所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRL2是QMSNLAS。
33.如权利要求29至32中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRL3选自由 AQNLELPYT、MQHLEYPYT 或 AQNLEYPYT 组成的组。
34.如权利要求29至33中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRHl选自由GYTFTSYWMH和GYTFITYWMH组成的组。
35.如权利要求29至34中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRH2选自由 LINPTNGRTN、LINPSNARTN 和 LINPSNGRPN 组成的组。
36.如权利要求29所述的分离的抗体或抗原结合片段，特征在于其包含 a)轻链可变域，所述轻链可变域与SEQID NO: 195具有至少70%序列同一性且具有如SEQ ID NO: 197 中限定的 CDRL1、如 SEQID NO: 198 中限定的 CDRL2 和如 SEQ ID NO:204 ^限定的⑶RL3和； b)重链可变域，所述重链可变域与SEQID NO: 192具有至少70%序列同一性且具有具有序列 GYTFTRNWIQ 的 CDRHlJn SEQID NO: 200 中限定的 CDRH2 和具有序列 ARLAGNYAYYFDY的 CDRH3。
37.如权利要求36所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRLl选自由RASGNIHNYLA 和 RASENIYSYLA 组成的组。
38.如权利要求36或37所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRL2选自由NAKTLPE和NAKTLAD组成的组。
39.如权利要求36至38中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRL3选自由QHHYGVPLT和QHHYGAPLT组成的组。
40.如权利要求36至39中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRH2选自由AIYPGNGDSR和AVYPGNGDSR组成的组。
41.如权利要求29所述的分离的抗体或抗原结合片段，特征在于其包含 a)轻链可变域，所述轻链可变域与SEQ ID NO: 196具有至少70%序列同一性且具有如SEQ ID NO:202 中限定的 CDRLl、如 SEQID NO: 150 中限定的 CDRL2 和如 SEQ ID NO: 151 或SEQ ID NO :203 中限定的 CDRL3，和； b)重链可变域，所述重链可变域与SEQ ID NO: 193具有至少70%序列同一性且具有如SEQ ID NO: 154 或 SEQ ID NO: 208 中限定的 CDRHl、如 SEQ ID NO: 156 或 SEQ ID NO: 209 中限定的 CDRH2 和如 SEQ ID NO: 158 或 SEQ ID N0:210 中限定的 CDRH3。
42.如权利要求41中所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRLl选自由RSSKSLLHSNGNTYLY 和 RSTKSLLHSNGNTYLY 组成的组。
43.如权利要求41或42所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRL2是RMSNLASO
44.如权利要求41至43中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRL3是 MQHLEYPFT。
45.如权利要求41至44中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRHl选自由GYTFTDYDMH和GYTFTDYEMH组成的组。
46.如权利要求41至45中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRH2选自由TIDPETGGTA和AIDPETGGTA组成的组。
47.如权利要求41至46中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRH3选自由 TSFYYTYSNYDVGFAY、TSFYYTYYNYDVGFAY 和 TTFYYSHYNYDVGFAY 组成的组。
48.一种分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段能够与如权利要求I至47中任一项所述的抗体或抗原结合片段竞争。
49.如权利要求I至48中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含恒定区或其片段。
50.如权利要求I至48中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其为scFv、Fab、Fab'或(Fab' )2。
51.如权利要求I至49中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
52.如权利要求I至49中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是多克隆抗体。
53.如权利要求I至52中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体与可检测部分或细胞毒性部分偶联。
54.一种核酸，所述核酸编码如权利要求26至47中任一项所述的抗体或抗原结合片段的轻链可变域和/或重链可变域。
55.—种载体,所述载体包含如权利要求54所述的核酸。
56.如权利要求55所述的载体,其中所述载体是表达载体。
57.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含如权利要求54所述的核酸。
58.如权利要求57所述的分离的细胞，其中所述细胞包含编码轻链可变域的核酸和编码重链可变域的核酸。
59.如权利要求58所述的分离的细胞，其中所述细胞能够表达、组装和/或分泌抗体或其抗原结合片段。
60.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含或表达如权利要求I至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
61.如权利要求60所述的分离的细胞，其中所述细胞包含编码轻链可变域的核酸和编码重链可变域的核酸。
62.如权利要求61所述的分离的细胞，其中所述细胞能够表达、组装和/或分泌抗体或其抗原结合片段。
63.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求I至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种和药学上可接受的载体。
64.—种组合物，所述组合物包含如权利要求I至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种和载体。
65.如权利要求I至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种用于治疗骨丢失的用途。
66.如权利要求I至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段用于治疗卵巢癌、肾癌、中枢神经系统的癌症、前列腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌的用途。
67.如权利要求I至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种用于诊断骨丢失或骨病的用途。
68.如权利要求I至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种用于诊断卵巢癌、肾癌、中枢神经系统的癌症、前列腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌的用途。
69.一种治疗骨丢失的方法，所述方法包括将如权利要求I至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种施用于有需要的哺乳动物。
70.一种治疗卵巢癌、肾癌、中枢神经系统的癌症、前列腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌的方法，所述方法包括将如权利要求I至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种施用于有需要的哺乳动物。
71.—种检测骨丢失或骨病的方法，所述方法包括将如权利要求I至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种施用于有需要的哺乳动物。
72.—种检测卵巢癌、肾癌、中枢神经系统的癌症、前列腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌的方法，所述方法包括将如权利要求I至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段施用于有需要的哺乳动物。
73.一种检测SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 2变体的方法，所述SEQ ID NO: 2变体与SEQID NO: 2的第20位至第259位氨基酸具有至少80%序列同一性，所述方法包括使表达SEQID NO:2或SEQ ID NO:2变体的细胞或包含或怀疑包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2变体的样本与如权利要求I至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种接触并测量结合。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述样本来自哺乳动物。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述哺乳动物患有或怀疑患有骨丢失。
76.如权利要求74所述的方法，其中所述哺乳动物患有或怀疑患有卵巢癌、肾癌、中枢神经系统的癌症、前列腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌。
77.如权利要求73至76中任一项所述的方法，其中所述样本是获自所述哺乳动物的血清样本、血浆样本或血液样本。
78.如权利要求73至76中任一项所述的方法，其中所述样本是获自所述哺乳动物的组织样本。
79.如权利要求73所述的方法，其中所述样本是细胞培养上清液。
80.如权利要求78至79中任一项所述的方法，所述方法包括定量与SEQID NO: 2或与所述SEQ ID NO:2变体结合的抗体的量。
81.—种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求I至53中任一项所述的抗体。
82.SEQ ID NO:2或其至少10个氨基酸的片段用于产生用来诊断或治疗骨丢失、卵巢癌、肾癌、中枢神经系统的癌症、前列腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌的抗体的用途。
83.根据权利要求82所述的用途，其中所述片段包含在SEQID NO: 2的第20位至第259位氨基酸中。
84.—种产生抗体或抗原结合片段的方法，所述抗体或抗原结合片段能够抑制破骨细胞前体细胞的分化(成为分化的破骨细胞)或能够抑制破骨细胞的再吸收活性，所述方法包括将SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:2具有至少80%同一性的变体或其至少10个氨基酸的片段施用于哺乳动物。
85.如权利要求84所述的方法，所述方法还包括分离或纯化所述抗体或抗原结合片 段。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述片段包含在SEQID NO: 2的第20位至第259位氨基酸中。
87.一种鉴定能够抑制卵巢癌细胞、肾癌细胞、中枢神经系统的癌细胞、前列腺癌细胞、黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞和结肠癌细胞的生长的化合物的方法，所述方法包括向包含与SEQ ID NO: 2的第20位至第259位氨基酸至少80%相同的区的多肽或表达所述多肽的细胞提供候选化合物并测量所述多肽的所述活性或表达，根据所述多肽的降低的活性或表达确实地鉴定适宜的抑制性化合物。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述候选化合物与所述多肽特异性地结合。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述候选化合物是抗体或抗原结合片段。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述候选化合物是siRNA或反义核酸。
91.一种抑制癌细胞的生长的方法，所述癌细胞选自由以下组成的组卵巢癌细胞、肾癌细胞、中枢神经系统的癌细胞、前列腺癌细胞、黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或结肠癌细胞，所述方法包括向所述癌细胞提供能够削弱与SEQ ID NO:2至少80%相同的多肽的表达的核酸，其中所述癌细胞表达与SEQ ID NO:2至少80%相同的所述多肽。
92.如权利要求90所述的方法，其中所述核酸是siRNA或反义核酸。
全文摘要
本文描述了与Siglec-15特异性结合的新型抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可阻断Siglec-15的生物活性，并适用于治疗骨丢失的组合物，且更具体为适用于具有增高的Siglec-15细胞表面表达的骨病，诸如其中存在破骨细胞的骨降解活性增高的病症。本发明还涉及表达抗体或抗原结合片段(诸如单克隆抗体、人源化抗体或嵌合抗体)的细胞。此外，还公开了利用所述抗体和片段检测和治疗骨丢失、骨相关疾病或癌症的方法。
文档编号G01N33/53GK102803293SQ201080053103
公开日2012年11月28日 申请日期2010年10月6日 优先权日2009年10月6日
发明者G·B·特雷姆勃雷, M·菲利昂, M·司徒伯雷 申请人:阿莱斯亚生物疗法股份有限公司