专利名称：用于检测分析物的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测分析物的方法和装置，具体地，本发明涉及用于检测分析物的方法和装置，其中将由分析物和受体的结合所形成的分析物-受体复合物与尚未与分析物结合的自由受体分离，以随后检测分析物-受体复合物。
背景技术：
生物传感器通过将充当传感材料(sensing material)的受体(receptor)固定至信号传感器(signal transducer)而形成,并且具有能够通过受体与分析物(a nalyte)之间的特殊且强烈的相互作用而非常敏感地检测受体的优点。受体是能够与分析物特殊地结合的物质，受体的典型示例可以是抗体、DNA、糖类，等等。在这种生物传感器中，为了检测不同分析物，必须使用固定有用于各分析物的受体的不同传感器芯片。因此，传感器芯片的开发成本较高并且传感器芯片的使用非常麻烦。此外，在对混合于ー些其它物质(诸如食物或血液)中的分析物进行检测的情况下，存在因来自其它物质的干扰而难以精确检测分析物的缺点。为了解决这ー问题，使用具有分别固定的受体的磁纳米颗粒(magnetic nanoparticle)将各分析物与其它物质分离的预处理方法已经被使用。然而，由于未与分析物结合的颗粒以及与分析物结合的颗粒在磁纳米颗粒被回收时重新收集在一起，故应使用具有固定化受体的另ー个传感器芯片以便仅检测分析物(见图I)。为了更加详细地说明，假设与固定有磁纳米颗粒的受体被称为“A”，另ー个受体“B”应固定在传感器芯片中。受体“A”和“B”与分析物的不同部分結合。也就是说，一个受体的结合不应影响另ー个受体的结合。因此，由于这种检测方法通常使用两种类型的单克隆抗体，故不仅需要大量努力和开销，还应针对不同分析物分别使用不同传感器芯片。
发明内容
技术问题为了解决上述问题或缺陷，本发明的目的是提供用于检测分析物的方法和装置，其中使用过滤分析物-受体复合物并使尚未与分析物结合的自由受体通过的微过滤器使通过分别使分析物和受体结合而形成的分析物-受体复合物与尚未与分析物结合的自由受体分离，以随后检测分析物-受体复合物。本发明的另ー个目的是提供用于检测分析物的方法和装置，其中通过对生物传感器増加分离功能，能够通过固定有一种受体的一种传感器芯片检测多种分析物。本发明的另ー个目的是提供用于检测分析物的方法和装置，其中在具有选择性过滤器的管中使通过分别使分析物和受体结合而形成的分析物-受体复合物与尚未与分析物结合的自由受体分离，以随后在不使用传感器芯片的情况下在管中直接检测分析物-受体复合物并因此增强便利性和敏感性。本发明的又ー个目的是提供用于检测分析物的方法和装置，其中使用磁纳米颗粒的预处理和对分析物的检测在管中实现从而提供高便利性和经济性的效果。技术方案为了实现本发明的上述目的和其它目的，根据本发明的第一个特征，提供了检测分析物的方法，包括以下步骤将受体放入含有分析物的样本中以诱使受体与分析物彼此结合，从而形成分析物-受体复合物，该分析物-受体复合物通过分别使受体与分析物结合而获得；使分析物-受体复合物与尚未与分析物结合的自由受体分离；以及对与自由受体分离的分析物-受体复合物进行检測。根据本发明的第二个特征，使分析物-受体复合物分离的步骤还包括以下步骤使用配备有具有合适大小的孔的微过滤器(下文称微过滤器)的三通阀过滤分析物-受体复合物，微过滤器过滤分析物-受体复合物并使自由受体通过；以及改变三通阀的流向以使分析物-受体复合物与微过滤器分离。根据本发明的第三个特征，使分析物-受体复合物分离的步骤还包括以下步骤 通过利用等电点(isoelectric point)或分析物-受体复合物与自由受体之间的电荷差异由离子交换过滤器选择性地仅吸附分析物-受体复合物；以及通过改变PH或离子强度使分析物-受体复合物与离子交换过滤器分离。根据本发明的第四个特征，提供了检测分析物的方法，包括以下步骤将固定有受体的荧光-磁纳米颗粒加入含有分析物的样本中，从而诱使受体与分析物彼此结合；使用磁体从含有分析物的样本中重新收集荧光-磁纳米颗粒；将重新收集的荧光-磁纳米颗粒移动至附接有具有合适大小的孔的微过滤器的管中，在重新收集的荧光-磁纳米颗粒之中，微过滤器过滤已与分析物结合的荧光-磁纳米颗粒(下文称结合的纳米颗粒)并使尚未与分析物结合的自由荧光-磁纳米颗粒(下文称自由纳米颗粒)通过；对微过滤器施加吸力从而将自由纳米颗粒从管中移除；以及对由遗留在微过滤器中的结合的纳米颗粒发出的荧光进行测量，从而检测分析物。根据本发明的第五个特征，提供了检测分析物的方法，包括以下步骤将含有分析物的样本和固定有受体的荧光-磁纳米颗粒放入附接有微过滤器的管中，从而诱使分析物与纳米颗粒结合；在由放置于管的外部的磁体施加磁场的状态下使荧光-磁纳米颗粒附接至管壁；施加吸力，从而使除附接至管壁的荧光-磁纳米颗粒之外的遗留样本在不穿过微过滤器的情况下从管中移除；将预定量的缓冲溶液放入管中并对缓冲溶液施加吸力，从而使缓冲溶液在不穿过微过滤器的情况下从管中移除，并因此移除能够影响荧光的测量的杂质；在已经移除由磁体产生的磁场的状态下将预定量的缓冲溶液放入管中，并从微过滤器的外部施加吸力，从而通过微过滤器移除自由纳米颗粒；以及对由遗留在微过滤器中的结合的纳米颗粒发出的荧光进行測量，从而检测分析物。根据本发明的第六个特征，提供了检测分析物的方法，包括以下步骤将含有分析物的样本和固定有受体的荧光-磁纳米颗粒放入附接有微过滤器的管中，从而诱使分析物与纳米颗粒结合；使用移动磁体使荧光-磁纳米颗粒附接至分离器的下端，移动磁体容纳在底部具有分离器的磁体壳中并包括穿透管和通孔，通孔中插有荧光测量探针；施加吸力以通过穿透管将除附接至分离器的下部的荧光-磁纳米颗粒之外的遗留样本从管中移除；通过穿透管供给缓冲溶液以随后再次对缓冲溶液施加吸カ以移除缓冲溶液并因此移除可能影响测量的杂质；在已经移除由磁体产生的磁场的状态下使附接至分离器的下端的荧光-磁纳米颗粒与分离器分离；通过穿透管放入预定量的缓冲溶液，并从微过滤器的外部施加吸力，从而通过微过滤器移除自由纳米颗粒；以及测量由结合的纳米颗粒发出的荧光，从而检测分析物。根据本发明的第七个特征，提供了检测分析物的方法，包括以下步骤将固定有受体的荧光-磁纳米颗粒放入含有分析物的样本中，从而诱使分析物与受体结合；使用磁体从含有分析物的样本中重新收集荧光-磁纳米颗粒；将重新收集的荧光-磁纳米颗粒移动至具有离子交换过滤器的管中；在自由纳米颗粒不被吸附的缓冲溶液条件(下文称选择性缓冲溶液)下，通过离子交换过滤器选择性地仅吸附结合的纳米颗粒并对离子交换过滤器施加吸力，从而通过利用等电点或结合的纳米颗粒与自由纳米颗粒之间的电荷差异由离子交换过滤器移除自由纳米颗粒；以及测量由结合的纳米颗粒发出的荧光，从而检测分析物。
根据本发明的第八个特征，提供了检测分析物的方法，包括以下步骤将含有分析物的样本和固定有受体的荧光-磁纳米颗粒移动至具有离子交换过滤器的管中；在由放置于管的外部的磁体施加磁场的状态下使荧光-磁纳米颗粒附接至管壁；对除附接至管壁的荧光-磁纳米颗粒之外的遗留样本施加吸力，从而使遗留样本在不穿过选择性过滤器的情况下从管中移除；将预定量的缓冲溶液放入管中并对缓冲溶液施加吸力，从而使缓冲溶液在不穿过选择性过滤器的情况下从管中移除，并因此移除能够影响荧光的测量的杂质；在已经移除由磁体产生的磁场的状态下将预定量的缓冲溶液放入管中，并对离子交换过滤器施加吸力，从而通过离子交换过滤器移除自由纳米颗粒；以及对由结合的纳米颗粒发出的荧光进行測量，从而检测分析物。根据本发明的第九个特征，提供了检测分析物的方法，包括以下步骤将含有分析物的样本和固定有受体的荧光-磁纳米颗粒移动至具有离子交换过滤器的管中；使用移动磁体使荧光-磁纳米颗粒附接至分离器的下端，移动磁体容纳在底部具有分离器的磁体壳中并包括穿透管和通孔，通孔中插有荧光测量探针；通过穿透管对除附接至管壁的荧光-磁纳米颗粒之外的遗留样本施加吸力，从而从管中移除遗留样本；通过穿透管供给缓冲溶液以随后再次对缓冲溶液施加吸カ以移除缓冲溶液并因此移除可能影响测量的杂质；在已经移除由磁体产生的磁场的状态下使附接至分离器的下端的荧光-磁纳米颗粒与分离器分离；通过穿透管放入预定量的缓冲溶液，并从离子交换过滤器的外部施加吸力，从而通过离子交换过滤器移除自由纳米颗粒；以及测量由结合的纳米颗粒发出的荧光，从而检测分析物。根据本发明的第十个特征，提供了检测分析物的装置，包括管；选择性过滤器，选择性过滤器放置于管的底部并在输入含有分析物的样本以及通过分别使荧光-磁纳米颗粒与抗体结合而形成的复合物所构成的受体的情况下过滤结合的纳米颗粒并使自由纳米颗粒通过；磁体，磁体放置于管的外部从而选择性地使荧光-磁纳米颗粒附接至管壁；以及荧光测量探针，荧光測量探针插入管内并对由与分析物结合并遗留在所述过滤器中的荧光-磁纳米颗粒发出的荧光进行測量，从而确定分析物。根据本发明的第十一个特征，提供了检测分析物的装置，包括管；选择性过滤器，选择性过滤器放置于管的底部；移动磁体，移动磁体放置于管的内部并包括通孔，通孔容纳在磁体壳内并插有穿透管和荧光测量探针。根据本发明的第十二个特征，提供了检测分析物的装置，包括离子交换过滤器，当含有分析物-受体复合物和自由受体的样本被供给时，离子交换过滤器利用等电点或分析物-受体复合物与自由受体之间的电荷差异选择性地仅吸附分析物-受体复合物并使自由受体通过；三通阀，三通阀连接在离子交换过滤器的后端并使连续输入的自由受体与分析物-受体复合物分离；以及生物传感器芯片，生物传感器芯片检测分析物-受体复合物，其中所述三通阀包括壳体，壳体具有第一端ロ、第二端口和第三端ロ，自由受体和分析物-受体复合物通过第一端口供给，自由受体通过第二端ロ排放，分析物-受体复合物通过第三端ロ排放至生物传感器芯片；以及旋转主体，旋转主体可旋转地设置在壳体中并包括与第一入口和第二入口相连的内部通道，其中在初始状态下，第一入口和第二入口分别与第一端口和第二端ロ匹配，在旋转状态下，第一入口和第二入口分别与第三端口和第一端ロ匹配。根据本发明的第十二个特征，提供了检测分析物的装置，包括三通阀，三通阀使分析物-受体复合物与尚未与分析物结合的自由受体分离；以及生物传感器，生物传感器 检测分析物-受体复合物，其中三通阀包括壳体，壳体具有第一端ロ、第二端口和第三端ロ，含有分析物-受体复合物和尚未与分析物结合的自由受体的样本通过第一端口供给，尚未与分析物结合的自由受体通过第二端ロ排放，分析物-受体复合物通过第三端ロ排放至生物传感器芯片；旋转主体，旋转主体可旋转地设置在壳体中，并包括与第一入口和第二入口相连的内部通道，其中在初始状态下，第一入口和第二入口分别与第一端口和第二端ロ匹配，在旋转状态下，第一入口和第二入ロ分别与第三端口和第一端ロ匹配；以及微过滤器，微过滤器设置在第一入口与第二入口之间的内部通道中并过滤分析物-受体复合物并使尚未与分析物结合的自由受体通过。有益效果如上所述，根据本发明，使通过使分析物和受体结合而形成的分析物-受体复合物与尚未与分析物结合的自由受体分离，以随后检测分析物-受体复合物，并因此获得与直接检测分析物的效果相同的效果。在检测如上所述的分析物-受体复合物的情况下，与直接检测分析物的情况不同，通过为生物传感器増加分离功能，可通过固定有一种受体的一种传感器芯片检测各种类型的分析物。例如，当检测各种类型的分析物时，与各分析物相关的抗体在山羊体内产生并且被用作受体。在这种情况下，通过固定有针对山羊抗体的第二抗体的传感器芯片检测各种类型的分析物-抗体复合物，从而获得改善便利性和负担能力的效果。此外，根据本发明，在配备有选择性过滤器的管中使通过分别使分析物和受体结合而形成的分析物-受体复合物与尚未与分析物结合的自由受体分离，以随后在不使用传感器芯片的情况下直接检测分析物-受体复合物并因此获得改善便利性和敏感性的效果。此外，根据本发明的，预处理和使用磁纳米颗粒对分析物的检测在单个管中实现，从而获得增强便利性和经济性的效果。
图I是对传统方法进行说明的图示，在传统方法中，通过固定有磁纳米颗粒的第ー受体分离分析物以产生分析物-受体复合物，并使用结合有对与第一受体的部分不同的部分进行识别的第二受体的传感器芯片对分析物-受体复合物进行检测，从而检测分析物。
图2是对根据本发明的第一个实施方式的方法进行说明的图示，在该方法中，使尚未与分析物结合的自由受体与分析物-受体复合物分离，以随后检测分析物-受体复合物，图3是对根据本发明的第一个实施方式的情况进行说明的图示，在该情况中，使用配备有针对受体的第二受体的传感器芯片检测分析物-受体复合物。图4是对根据本发明的第二个实施方式的检测细菌的方法进行说明的图示，在该方法中，在反应杯中进行使固定有抗体的荧光磁纳米颗粒(下文称荧光磁纳米颗粒-抗体(fluorescent magnetic nanopart i c I e-ant i body ) ； F-MNP-Ab)与细菌结合的预处理并重新收集荧光磁纳米颗粒-抗体(F-MNP-Ab)，以随后在过滤器管中移除尚未与细菌结合的自由荧光磁纳米颗粒-抗体(F-MNP-Ab)并测量荧光。图5是对根据本发明的第三个实施方式的方法进行说明的图示，在该方法中，在过滤器管中使用荧光磁纳米颗粒-抗体(F-MNP-Ab)进行预处理，以随后移除自由荧光磁纳米颗粒-抗体(F-MNP-Ab)并测量荧光。图6和7分别是对检测细菌的方法进行说明的图示，在该方法中，在具有附接有穿透管和荧光测量探针的磁体的过滤器管中使用荧光磁纳米颗粒-抗体(F-MNP-Ab)进行预处理，随后分别移除自由F-MNP-Ab并测量荧光，图8是示出根据本发明的第四个实施方式的分析物分离设备的变型的截面图。图9是对根据本发明的第五个实施方式的检测分析物的方法进行说明的图示，在该方法中，通过附接至三通阀的滤波器对细菌-抗体复合物进行过滤，并改变流向以提取细菌-抗体复合物，随后将所提取的细菌-抗体复合物注入传感器芯片。图10是对根据本发明的第六个实施方式的方法进行说明的图示，在该方法中，使用阴离子交换过滤器和三通阀将自由抗体与分析物-抗体复合物分离并使用传感器芯片检测所分离的分析物-抗体复合物。图11是示出根据本发明的附接有能够改变流向的微过滤器和三通阀的生物传感器系统的示意图。图12是示出在图11的系统中使尚未与细菌结合的自由抗体与细菌-抗体复合物分离以随后检测细菌-抗体复合物的实验的实验结果的曲线图。
具体实施例方式在下文中，将根据本发明的实施方式详细描述根据本发明的具体方法，但本发明的范围不仅限于这些实施例。根据本发明的检测分析物的方法包括以下步骤将受体放入含有分析物的样本以诱使受体和分析物彼此结合，从而形成通过分别使受体与分析物结合而获得的分析物-受体复合物(下文称“复合物”);使复合物与尚未与分析物结合的受体(下文称“自由受体”)分离；以及对与自由受体分离的复合物进行检测。这里，分析物是成为检测目标的物质。分析物的典型示例可以是细菌、病毒、蛋白质、核酸、糖类、脂类、金属离子、有机化合物等。此外，受体是独自与分析物的具体结合物质。受体的典型示例可以是抗体或蛋白质，包括酶、多肽类、核酸、糖类等。
图2是对根据本发明的第一个实施方式的方法进行说明的图示，在该方法中，使自由受体与复合物分离，以随后检测复合物，图3是对根据本发明的第一个实施方式的情况进行说明的图示，在该情况中，使用配备有针对受体的第二受体的传感器芯片检测复合物。參照图2和3，根据本发明的第一个实施方式的分析物检测方法，包括以下步骤将受体8a加入第一分析物(A) 7以诱使分析物(A) 7与受体8a结合；使分析物-受体复合物9与自由受体8a分离，随后使用固定有针对复合物9的受体8a的第二受体8b的传感器芯片6对所分离的复合物9进行检测。由于复合物9和自由受体8a在诸如大小、电荷、以及等电点的诸多特性上都彼此不同，故本创造性发明能够利用复合物9和自由受体8a的不同特性由选择性过滤器分离复合物9与自由受体8a。
选择过滤器代表选择性地仅过滤或吸附复合物以使复合物与自由受体分离的过滤器。选择性过滤器的典型示例可以是微过滤器或离子交换过滤器。由于细菌的大小为几微米，而抗体的大小为10纳米，故在使用抗体作为受体分别对作为分析物的细菌进行检测的情况下，能够使用具有约0. 2至I微米的孔的微过滤器选择性地仅过滤细菌-抗体复合物。通过这种方式分离的细菌-抗体复合物能够被任何检测抗体的方法方便地检测。例如，细菌-抗体复合物可被固定有第二抗体的传感器芯片检測。这里，当在山羊体内制造与细菌结合的抗体时，第二抗体表示用于山羊的免疫球蛋白G蛋白质的抗体。因此，如果山羊体内所生成的抗体被用于各种类型的细菌，则所有细菌-抗体复合物都能够使用固定有针对山羊免疫球蛋白G的第二抗体的传感器芯片检測。换言之，在分析物7是细菌且受体8a是抗体的情况下，在本发明的第一个实施方式中，使用固定有作为第二受体8b的第二抗体的传感器芯片6对细菌和抗体彼此结合的细菌-抗体复合物进行检測。此外，可使用具有能够分别与抗体结合的表面的任何传感器芯片。例如，可使用蛋白质，诸如蛋白质A或蛋白质G。此外，如果事先分别在抗体上附接合适的标记，则还能够使用更加简单的检测方法。例如，在含有许多物质的样本的情况下，如在食物和血清中，需要使用磁纳米颗粒来分离细菌。因此，可以通过在磁纳米颗粒上引入荧光来使用与图4的方法相同的方法。当然，在磁纳米颗粒上引入的标记不仅限于荧光，还可采用使高敏感度检测成为可能的任何标记，诸如放射线、辐射、或酶。图4是对根据本发明的第二个实施方式的检测细菌的方法进行说明的图示，在该方法中，在反应杯中进行使固定有抗体的荧光磁纳米颗粒(下文称荧光磁纳米颗粒-抗体(fluorescent magnetic nanopart i c I e-ant i body ) ； F-MNP-Ab)与细菌结合的预处理并重新收集荧光磁纳米颗粒-抗体(F-MNP-Ab)，随后在过滤器管中移除尚未与细菌结合的自由荧光磁纳米颗粒-抗体(F-MNP-Ab)并测量荧光。在根据本发明的第二个实施方式的分析物检测方法的情况下，如图4所示，荧光磁纳米颗粒-抗体(F-MNP-Ab) 11被放入位于单个反应杯15中的样本I内以与细菌10结合。随后，如果使用磁体探针(probe) 13进行重新收集，则已经与细菌10结合的F-MNP-Ab11和尚未与细菌10结合的自由F-MNP-Ab 11均被重新收集。在图4中，參考标号3指代不同于分析物的物质。将这些F-MNP-Ab 11和自由F_MNP_Ab 11移动至底部附接有微过滤器19的过滤器管17，微过滤器19具有约0. 2至I微米的孔。通过对管17的底部施加吸力来移除自由F-MNP-Ab 11。通过增加适当缓冲溶液并再次施加吸力来完全移除自由F-MNP-Ab 11。最后，在添加适当的缓冲溶液之后，使用荧光测量探针21对微过滤器19中的由保持在与细菌结合的状态下的F-MNP-Ab发出的荧光进行測量，从而确定分析物。除非样本太浑浊，还能够如图5所示在单个管中进行整个处理。图5是对根据本发明的第三个实施方式的方法进行说明的图示，在该方法中，在过滤器管中使用荧光磁纳米颗粒-抗体(F-MNP-Ab)进行预处理，以随后移除自由荧光磁纳 米颗粒-抗体(F-MNP-Ab)并测量荧光。在根据本发明的第三个实施方式的分析物检测方法的情况下，如图5所示，样本I首先被放入过滤器管17。这里，荧光磁纳米颗粒-抗体(F-MNP-Ab) 11被放入样本I以与细菌10结合。随后，通过对F-MNP-Ab 11施加围绕管17的壁的磁体23的磁场重新收集F-MNP-Ab 11。如果使用电磁体作为围绕管壁的磁体，则对电磁体的线圈施加电流以对F-MNP-Ab 11施加磁场。与此同时,如果使用永磁体作为围绕管壁的磁体,则使永磁体移动并接触该管，从而对F-MNP-Ab 11施加磁场。此后，通过吸カ将含有其他物质3的溶液从管的上部移除。随后，加入缓冲溶液并且从管的上部再次施加吸カ以进行冲洗。随后，释放磁体23的磁场并且从管的下端施加吸力，从而移除自由F-MNP-AblI。通过加入适当缓冲溶液并再次施加吸力来完全移除自由F-MNP-Ab 11。最后，在加入适当缓冲溶液之后，使用荧光测量探针21对微过滤器19中的由保持在与细菌结合的状态下的F-MNP-Ab发出的荧光进行測量，从而确定分析物。此外，与本发明的第三个实施方式中一祥，由于当使用围绕管17的壁的磁体23时花费很长时间来重新收集F-MNP-Ab 11，故可使用图6至8中所示的设备来缩短回收时间并简化工艺。图6和7分别是对检测细菌的方法进行说明的图示，在该方法中，在具有附接有穿透管和荧光测量探针的磁体的过滤器管中使用荧光磁纳米颗粒-抗体(F-MNP-Ab)进行预处理，随后分别移除自由F-MNP-Ab并测量荧光，图8是示出根据本发明的第四个实施方式的分析物分离设备的变型的截面图。根据本发明的第四个实施方式的分析物检测方法使用图6至8中所示的各分析物检测装置。根据本发明的第四个实施方式的分析物检测装置配备有位于管31底部的微过滤器19，其中微过滤器19过滤已与分析物结合的F-MNP-Ab 11并使尚未与分析物结合的自由F-MNP-Ab 11 通过。此外，根据本发明的第四个实施方式，将安装在磁体壳34中的磁体33放置在管31的内部，以快速地重新收集F-MNP-Ab 11。将穿透管35和荧光测量探针21插入位于磁体33中心的通孔。两个管36a和36b经由三通阀36c与穿透管35相连，其中这两个管中的一个用于抽吸管中的溶液，另ー个则用于供给缓冲溶液。通过切换阀36c的方向，插入磁体33的穿透管35与缓冲溶液供给管36a或抽吸管36b相连。可使用电磁体或永磁体作为磁体33。当使用永磁体作为磁体33时，永磁体安装在磁体壳34中以上下移动，并且分离器37设置在磁体壳34的底部，如图7所示。因此，当磁体向下移动时，F-MNP-Ab 11通过磁力被重新收集，而在磁体向上移动时，F-MNP-Ab 11从分离器37中排出。这里，将描述使用永磁体的示例。此外，根据本发明的第四个实施方式，如图8中所示的分析物检测装置采用管31a和磁体33, 二者的直径从管31a和磁体33的下部向底部放置有微过滤器19的磁铁壳的底部逐渐減少，因此拓宽了 F-MNP-Ab 11与磁体33之间的接触面积，从而使溶液更加容易地穿过管的下部向下流动并且更加快速地重新收集F-MNP-Ab 11。在根据本发明的第四个实施方式的分析物检测方法的情况下，通过与第三个实施方式的方式相同的方式，将样本I和F-MNP-Ab 11放入过滤器管31，以使F-MNP-Ab 11与细菌10结合，随后通过使永磁体33下降至分离器37的部分以依靠磁力重新收集F-MNP-Ab11，如图6中所示。在这ー阶段，推荐将包括磁体的磁体壳34放置在最靠近过滤器管31的底面的位置，以减少回收所需的时间。操纵三通阀36c以使穿透管35与抽吸管36b相连，从而吸取样本I并因此移除含有其他物质3的溶液。因此，仅吸附在分离器37的下表面上的F-MNP-Ab 11遗留在过滤器管31内。随后，操纵三通阀36c以使穿透管35与缓冲溶液供给管36a相连，随后通过缓冲溶液供给管36a将缓冲溶液添加至过滤器管31内，以随后通过抽吸管36b吸取缓冲溶液，从而对F-MNP-Ab 11进行冲洗。在这ー步骤中，希望磁体壳34应稍微升起以平稳地进行冲洗处理。随后，如图7所示，当永磁体33在磁体壳34内向上移动时，F-MNP-Ab 11从分离器分离。此后，通过对微过滤器19的下端施加吸力来移除尚未与细菌10结合的自由F-MNP-Ab
11。随后，通过再次加入适当缓冲溶液并再次对微过滤器19的下端施加吸カ以完全移除自由F-MNP-Ab 11。最后，在加入适当的缓冲溶液之后，使用荧光测量探针21对微过滤器19中的由保持在与细菌结合的状态下的F-MNP-Ab 11发出的荧光进行测量，从而确定分析物。如上所述的使用过滤器管的方法非常简单，因此便于使处理自动化，并且如果对于每个待检测细菌仅开发F-MNP-Ab，则变得非常经济。在需要更加精确的测量结果的情况下，如图9所示，使用三通阀来分离细菌_抗体复合物，随后通过传感器芯片对所分离的细菌-抗体复合物进行检測。图9是对根据本发明的第五个实施方式的检测分析物的方法进行说明的图示，在该方法中，通过附接至三通阀的滤波器对细菌-抗体复合物进行过滤，并改变流向以提取细菌-抗体复合物，随后将所提取的细菌-抗体复合物注入传感器芯片。根据本发明的第五个实施方式的分析物检测装置包括使已与细菌结合的细菌-抗体复合物5与尚未与细菌结合的自由抗体分离的三通阀40 ；以及固定有第二抗体以检测细菌-抗体复合物5的生物传感器芯片6。三通阀40包括壳体41，壳体41具有第一端ロ 41a、第二端ロ 41b以及第三端ロ41c,含有细菌-抗体复合物5和尚未与细菌结合的自由受体的样本通过第一端ロ 41a供给，自由受体通过第二端ロ 41b排放，并且细菌-抗体复合物5通过第三端ロ 41c排放至生物传感器芯片；旋转主体43，可旋转地设置在壳体41上并包括与第一入口 43a和第二入口43b相连的内部通道，其中第一入口 43a和第二入口 43b在初始状态下分别与第一端ロ 41a和第二端ロ 41b匹配，第一入口 43a和第二入口 43b在旋转状态下分别与第三端ロ 41c和第一端ロ 41a匹配；以及微过滤器45，设置在旋转主体43的第一入ロ 43a与第二入ロ 43b之间的内部通道中并过滤细 菌-抗体复合物5并使自由受体通过。參照图9，在本发明的第五个实施方式的分析物检测方法的情况下，通过分别使磁纳米颗粒(MNP)与抗体结合而形成的颗粒(下文称“MNP-Ab”)Ila首先被放入含有细菌10和其它物质3的样本以诱使细菌10和MNP-Ab结合以产生细菌-MNP-Ab复合物5。随后，根据上述方法使用磁体将细菌-MNP-Ab复合物5和未与细菌10结合的MNP-Ab Ila (下文称“自由MNP-Ab”)与样本分离并重新收集。随后，将细菌-MNP-Ab复合物5和自由MNP-Ab Ila放入三通阀40的第一端ロ41a中，以通过微过滤器45对细菌-MNP-Ab复合物5进行过滤并通过第二端ロ 41b对自由MNP-Ab Ila进行排放。随后，当通过旋转三通阀40的旋转主体34以改变流向从而供给缓冲溶液时，仅能够获得细菌-MNP-Ab复合物5以随后注入传感器芯片6。在这种情况下，传感器芯片6固定有第二抗体以捕获细菌-MNP-Ab复合物5。这里，应注意，可使用未固定有用于该细菌的抗体而是固定有第二抗体的传感器芯片，因为已经移除未与细菌10结合的自由MNP-Abl la，并且仅留有细菌-MNP-Ab复合物
5。因此，所有类型的细菌都能够通过传感器芯片6进行检測，因此增加了便利性和负担能力。细菌-MNP-Ab复合物5的检测能够在使用表面等离子体共振(SPR, surfaceplasmon resonance)现象的SPR生物传感器中和采用所有类型的方法诸如使用压电现象的石英晶体微天平(QCM, quartz crystal microbalance)的传感器芯片中实现。此外，因为细菌被固定至磁纳米颗粒(MNP),故还可通过使用巨磁电阻(GMR, giant magnetoresistance)的传感器芯片来完成细菌-MNP-Ab复合物5的检测。此外，如果向磁纳米颗粒(MNP)赋予荧光性质或使导致颜色反应的酶与磁纳米颗粒(MNP)相连，则还可通过采用测量荧光或吸收率的方法的传感器芯片来完成细菌-MNP-Ab复合物5的检测。即使在抗体未固定有磁纳米颗粒(MNP)的情况下，也能够通过向磁纳米颗粒(MNP)赋予荧光特性或使磁纳米颗粒(MNP)与导致颜色反应的酶相连而使用与上述一个传感器相同的传感器。 通过这种方法，在检测诸如蛋白质的小物质的情况下，可利用诸如大小、电荷、以及等电点等特性中的各种差异，但是，在这里将描述使用等电点的方法。等电点意味着特殊蛋白质的净电荷变成0时的氢离子浓度指数(pH)。如果pH变得高于等电点，则蛋白质具有负的净电荷，如果PH变得低于等电点，则蛋白质具有正的净电荷。如果分析物的等电点为5且抗体的等电点为7，则分析物-抗体复合物的等电点大于5且小于例如约6的值。因此，能够找到尚未与分析物结合的自由抗体不与阴离子交換过滤器结合而仅分析物-抗体复合物与阴离子交换过滤器结合的PH条件。图10是对根据本发明的第六个实施方式的方法进行说明的图示，在该方法中，使用阴离子交换过滤器和三通阀将自由抗体与分析物-抗体复合物分离并使用传感器芯片对所分离的分析物-抗体复合物进行检测。
例如，如果自由抗体未结合且仅分析物-抗体复合物结合的条件在pH 6. 5下满足，则首先将抗体8放入含有分析物7的样本中，以诱使分析物7与抗体8结合，随后在具有PH 6. 5的缓冲溶液中穿过阴离子交换过滤器51。因此，仅分析物-抗体复合物被阴离子交换过滤器51吸附并且尚未与分析物7结合的自由抗体8通过三通阀40通过废物方向上的出口排放。随后，如果使pH已经被调节至5的缓冲溶液在三通阀40的出口的方向转向传感器芯片6的方向的状态下流动，则分析物-抗体复合物在阴离子交换过滤器51中被喷出以通过三通阀40排放至传感器芯片6。被分离的分析物-抗体复合物可通过与先前描述的分析物-抗体复合物的检测方法相同的方式检测。此外，由于MNP-Ab还能够以与第五个实施方式的方式相同的方式被应用，故能够使用预处理和磁纳米颗粒进行高敏感度检测。此外，当在根据使用图4和5中所示的过滤器管的第二至第四个实施方式的方法中将选择性过滤器，即，微过滤器19改为离子交换过滤器并且改变缓冲溶液的pH吋，能够仅将与分析物7结合的F-MNP-Ab 11吸附至离子交换过滤器并移除尚未与分析物结合的自 由 F-MNP-Ab 11。如果仅提供区分分析物-受体复合物与尚未与分析物结合的自由受体以选择性地过滤或吸附分析物-受体复合物和自由受体的选择性过滤器，则上述方法还可应用于诸如细菌、蛋白质、核酸、糖类、有机物质、以及重金属的分析物。下面将更加详细地描述本发明的优选实施例。然而，下面的实施方式不限制本发明的范围，而仅仅是实施本发明的示例。<实施例1>仅分离抗体-细菌复合物以检测细菌为了确定如何使抗体-细菌复合物与尚未与细菌结合的抗体分离，并随后对所分离的抗体-细菌复合物进行检测，已经制造了图11中所示的使用QCM的生物传感器系统。图11是示出根据本发明的附接有能够改变流向的微过滤器和三通阀的生物传感器系统的示意图。图11中所示的根据本发明的生物传感器系统包括泵61，泵送缓冲溶液以进行流动；注入阀62,用于注入大肠杆菌抗体和大肠杆菌(colon bacilli);三通阀40a ;室63,容纳固定有用于山羊免疫球蛋白G蛋白质的第二抗体的QCM传感器芯片；以及废物收集瓶67,通过导管68顺序地连接。振荡器(0scillator)64、计频器(Frequency counter)65以及检测信号分析计算机66依次与QCM传感器芯片相连。根据还系统的特性，具有约0. 5 y m孔的微过滤器45或能够对抗体-细菌复合物进行过滤的微过滤器45设置在注入阀62和QCM传感器芯片的室63之间，以使用三通阀40a将流向改变为①和②的方向。在该实验中，磷酸盐缓冲溶液(PBS)被用作运载溶液，并且流速被设定为50 Ul/min。QCM传感器芯片固定有用于山羊免疫球蛋白G蛋白质的第二抗体。首先,注入10 ii g山羊体内产生的大肠杆菌抗体(anti-E. coli antibody raisedin the goat)并且随后将三通阀40a的流向改为①。随后，使缓冲溶液流动30分钟。随后，将三通阀40a的流向改为②，随后观察频率变化。因此，频率不发生变化。这意味着室中的QCM传感器芯片未检测到用于大肠杆菌的任何抗体，因为抗体蛋白质穿过过滤器并且在①的流向中被移除。
随后，在已经将IOyg抗体与IO5Cfu大肠杆菌混合并已经将该混合物注入之后，进行与上述实验相同的实验。因此，如图12所示，确认频率降低。換言之，因为已与大肠杆菌结合的抗体不穿过过滤器，故它们被过滤器捕获。随后，当流向被改为②的方向时，所结合的抗体进入QCM传感器芯片的室63以在传感器芯片中被检测。上述结果示出使用适当的孔将已经与细菌结合的抗体和尚未与细菌结合的抗体分离以对细菌-抗体复合物进行检测。如上所述，本发明将分离功能増加至生物传感器，以通过传感器芯片检测各种类型的分析物。エ业适用性本发明可应用于对诸如细菌、蛋白质、核酸、有机化合物、以及重金属的分析物进 行检测。如上所述，本发明已经參照特别优选的实施方式进行描述。然而，本发明不限于上述实施方式，并且对于本领域技术人员来说，在不背离本发明的精神的情况下，可以进行各种修改和变更。因此，本发明的保护范围不被限定在其详细描述内，而是通过所附权利要求和本发明的技术精神所限定。
权利要求
1.检测分析物的方法，包括以下步骤 将受体放入含有所述分析物的样本中以诱使所述受体与所述分析物彼此結合，从而形成分析物-受体复合物，所述分析物-受体复合物通过分别使所述受体与所述分析物结合而获得； 使所述分析物-受体复合物与尚未与所述分析物结合的自由受体分离；以及 对与所述自由受体分离的所述分析物-受体复合物进行检測。
2.如权利要求I所述的方法，其中使所述分析物-受体复合物分离的步骤还包括以下步骤 使用配备有微过滤器的三通阀过滤所述分析物-受体复合物，所述微过滤器过滤所述分析物-受体复合物并使所述自由受体通过；以及 改变所述三通阀的流向以使所述分析物-受体复合物与所述微过滤器分离。
3.如权利要求I所述的方法，其中使所述分析物-受体复合物分离的步骤还包括以下步骤 通过利用等电点或所述分析物-受体复合物与所述自由受体之间的电荷差异由离子交换过滤器选择性地仅吸附所述分析物-受体复合物；以及 通过改变PH或离子强度使所述分析物-受体复合物与所述离子交换过滤器分离。
4.如权利要求I所述的方法，其中所述受体在固定有荧光-磁纳米颗粒的状态下被使用，并且 使所述分析物-受体复合物分离的步骤还包括以下步骤 将固定有所述受体的荧光-磁纳米颗粒加入含有所述分析物的样本中，从而分别使所述分析物与所述纳米颗粒结合； 使用磁体从含有所述分析物的样本中重新收集所述荧光-磁纳米颗粒； 将重新收集的荧光-磁纳米颗粒移动至附接有选择性过滤器的管中，在重新收集的荧光-磁纳米颗粒之中，所述选择性过滤器过滤已与所述分析物结合的荧光-磁纳米颗粒并使尚未与所述分析物结合的自由荧光-磁纳米颗粒通过；以及 对所述过滤器施加吸力从而将尚未与所述分析物结合的自由荧光-磁纳米颗粒从所述管中移除。
5.如权利要求I所述的方法，其中所述受体在固定有荧光-磁纳米颗粒的状态下被使用，并且 使所述分析物-受体复合物分离的步骤还包括以下步骤 将固定有所述受体的荧光-磁纳米颗粒放入附接有选择性过滤器的管中，从而分别使所述分析物与所述纳米颗粒结合，所述选择性过滤器过滤已与所述分析物结合的荧光-磁纳米颗粒并使尚未与所述分析物结合的自由荧光-磁纳米颗粒通过； 在由放置于所述管的外部的磁体施加磁场的状态下使所述荧光-磁纳米颗粒附接至所述管的壁； 施加吸力，从而使除附接至管壁的荧光-磁纳米颗粒之外的遗留样本在不穿过所述选择性过滤器的情况下从所述管中移除；以及， 在已经移除由所述磁体产生的磁场的状态下将预定量的缓冲溶液放入所述管中，并从所述选择性过滤器的外部施加吸力，以随后穿过所述选择性过滤器并因此移除尚未与所述分析物结合的自由荧光-磁纳米颗粒。
6.如权利要求I所述的方法，其中所述受体在固定有荧光-磁纳米颗粒的状态下被使用，并且 使所述分析物-受体复合物分离的步骤还包括以下步骤 将固定有所述受体的荧光-磁纳米颗粒放入附接有选择性过滤器的管中，从而分别使所述分析物与所述纳米颗粒结合，所述选择性过滤器过滤已与所述分析物结合的荧光-磁纳米颗粒并使尚未与所述分析物结合的自由荧光-磁纳米颗粒通过； 使用移动磁体使所述荧光-磁纳米颗粒附接至分离器的下端，所述移动磁体容纳在底部具有分离器的磁体壳中并包括抽吸与缓冲溶液供给管、以及通孔，所述通孔中插有荧光测量探针； 通过所述抽吸与缓冲溶液供给管将除附接至所述分离器的下部的荧光-磁纳米颗粒之外的遗留样本从所述管中移除； 通过所述抽吸与缓冲溶液供给管供给缓冲溶液以随后移除所述缓冲溶液并因此移除可能影响测量的杂质； 在已经移除由所述磁体产生的磁场的状态下使附接至所述分离器的下端的荧光-磁纳米颗粒与所述分离器分离M及 通过所述抽吸与缓冲溶液供给管放入预定量的缓冲溶液，并从所述选择性过滤器的外部施加吸力，以随后穿过所述选择性过滤器并因此移除尚未与所述分析物结合的自由荧光-磁纳米颗粒。
7.如权利要求I所述的方法，其中从所述复合物检测所述分析物的步骤使用能够与各分析物的受体结合的第二受体。
8.如权利要求4至6中任一项所述的方法，其中通过对由遗留在所述过滤器中的荧光-磁纳米颗粒发出的荧光进行測量来检测所述分析物。
9.如权利要求4至6中任一项所述的方法，其中利用已与所述分析物结合的荧光-磁纳米颗粒和尚未与所述分析物结合的自由荧光-磁纳米颗粒的大小差异的微过滤器被用作所述选择性过滤器。
10.如权利要求4至6中任一项所述的方法，其中利用等电点或已与所述分析物结合的荧光-磁纳米颗粒与尚未与所述分析物结合的自由荧光-磁纳米颗粒之间的电荷差异的离子交换过滤器被用作所述选择性过滤器。
11.检测分析物的装置包括 管； 选择性过滤器，所述选择性过滤器放置于所述管的底部并在输入含有所述分析物的样本以及通过分别使荧光-磁纳米颗粒与抗体结合而形成的复合物所构成的受体的情况下过滤与所述分析物结合的复合物并使未与所述分析物结合的复合物通过； 磁体，所述磁体放置于所述管的内部或外部从而选择性地使所述复合物附接至所述管的壁；以及 荧光测量探针，所述荧光測量探针选择性地插入所述管并对由与所述分析物结合并遗留在所述过滤器中的复合物发出的荧光进行測量，从而确定所述分析物。
12.用于检测分析物的装置包括管； 选择 性过滤器，所述选择性过滤器放置于所述管的底部并在输入含有所述分析物的样本以及通过分别使荧光-磁纳米颗粒与抗体结合而形成的复合物所构成的受体的情况下过滤与所述分析物结合的复合物并使未与所述分析物结合的自由复合物通过； 移动磁体，所述移动磁体放置于所述管的内部或外部并测量荧光，所述移动磁体具有位于磁体壳的下端的分离器，所述移动磁体可移动地包含在所述磁体壳中并具有第一通孔和第二通孔，所述第一通孔中插有用于吸取除已与所述分析物结合的复合物和尚未与所述分析物结合的自由复合物之外的样本并供给缓冲溶液的穿透管，所述第二通孔中插有荧光测量探针；以及 荧光测量探针，所述荧光測量探针选择性地插入所述管并对由与所述分析物结合并遗留在所述过滤器中的复合物发出的荧光进行測量，从而确定所述分析物。
13.根据权利要求12所述的用于检测分析物的装置，其中所述管和所述移动磁体的直径分别从它们的下端向所述选择性过滤器被放置的位置逐步地减小。
14.用于检测分析物的装置包括 离子交换过滤器，当含有分析物-受体复合物和尚未与所述分析物结合的自由受体的样本被供给时，所述离子交换过滤器利用等电点或所述分析物-受体复合物与尚未与所述分析物结合的自由受体之间的电荷差异选择性地仅吸附分析物-受体复合物并使尚未与所述分析物结合的自由受体通过； 三通阀，所述三通阀连接在所述离子交换过滤器的后端并使尚未与连续输入的分析物结合的自由受体与所述分析物-受体复合物分离；以及 生物传感器芯片，所述生物传感器芯片检测所述分析物-受体复合物，其中所述三通阀包括 壳体，所述壳体具有第一端ロ、第二端口和第三端ロ，尚未与所述分析物结合的自由受体和所述分析物-受体复合物通过所述第一端口供给，尚未与所述分析物结合的自由受体通过所述第二端ロ排放，所述分析物-受体复合物通过所述第三端ロ排放至所述生物传感器芯片；以及 旋转主体，所述旋转主体可旋转地设置在所述壳体中并包括与第一入口和第二入口相连的内部通道，其中在初始状态下，所述第一入口和所述第二入口分别与所述第一端口和所述第二端ロ匹配，在旋转状态下，所述第一入ロ和所述第二入ロ分别与所述第三端ロ和所述第一端ロ匹配。
15.用于检测分析物的装置包括 三通阀，所述三通阀使分析物-受体复合物与尚未与所述分析物结合的自由受体分离；以及 生物传感器，所述生物传感器检测所述分析物-受体复合物，其中所述三通阀包括 壳体，所述壳体具有第一端ロ、第二端口和第三端ロ，含有尚未与所述分析物结合的自由受体和所述分析物-受体复合物的样本通过所述第一端口供给，尚未与所述分析物结合的自由受体通过所述第二端ロ排放，所述分析物-受体复合物通过所述第三端ロ排放至所述生物传感器芯片； 旋转主体，所述旋转主体可旋转地设置在所述壳体中，并包括与第一入ロ和第二入ロ相连的内部通道，其中在初始状态下，所述第一入口和所述第二入ロ分别与所述第一端ロ和所述第二端ロ匹配，在旋转状态下，所述第一入ロ和所述第二入ロ分别与所述第三端ロ和所述第一端ロ匹配；以及 微过滤器，所述微过滤器设置在所述第一入口与所述第二入口之间的所述内部通道中 并过滤所述分析物-受体复合物并使尚未与所述分析物结合的自由受体通过。
全文摘要
提供了用于检测分析物的方法和装置，其中使通过使分析物与受体结合而形成的分析物-受体复合物与尚未与分析物结合的自由受体分离，以随后检测分析物-受体复合物。用于检测分析物的方法和装置不仅提供通过单个传感器芯片检测多种物质的效果，还提供从含有多种物质的样本中检测特定对象物质并轻易地放大信号的优点。
文档编号G01N33/53GK102656454SQ201080055921
公开日2012年9月5日 申请日期2010年11月16日 优先权日2009年11月17日
发明者崔秉鹤, 崔锡正, 金成一 申请人:阿莫绿色技术有限公司