单个靶实体的免疫化学检测的制作方法

专利名称：单个靶实体的免疫化学检测的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫化学可视化和定量样品中单个靶实体如单个分子、单个分子结构、单个粒子等的领域，其中所述单个靶实体被固定化。具体地，本发明涉及用于可视化和定量生物靶或化学靶的单个单元的方法，尤其涉及免疫化学可视化组织学样品中生物靶的单个分子。本发明的方法包括由具有氧化还原酶活性的酶介导在样品的单个靶位点处形成可检测分子离散沉积物的步骤，其中单个靶位点包括单个靶单位。
背景技术：
免疫化学是医学诊断中的常用工具并且它也常用于评估治疗性生物标记。尤其，后者经常要求定量评价治疗性生物标记存在的程度。抗体应用于细胞和组织存在特殊困难，这些困难超过了这些试剂应用于固体支持物上固定或溶液中的纯化蛋白时所遭遇的那些困难。。存在可能影响免疫检测的很多因素，它们当中包括组织固定及产生、抗原修复的 持续时间与类型以及和抗体特异性。另一个困难是检测低水平存在的靶的能力。与可溶性测定法一样，这是一个增加信号而不增加非特异性本底水平的问题。最常探索的方法是信号放大，这通过连续轮次的酶促反应来实现。DAB是辣根过氧化物酶(HRP)的生色底物，其广泛用于以过氧化物酶活性标记的组织学样品中靶蛋白的可视化。该方法利用与靶向样品中蛋白质的抗体连接的HRP使DAB从溶液中沉积到靶定蛋白的位点，并且从而标记所述蛋白质。该方法不是特别灵敏，因而适合检测相对丰富的靶蛋白。与DAB沉积物相关的信号不能进一步放大。其它要说明的缺点是该方法需要量相当大的靶特异性抗体来饱和全部靶位点，并且该方法相对慢的。另外，该方法产生均匀的染色模式，对于显微分析人员来说细胞结构的细胞内解析，例如细胞膜、细胞质和细胞核是均匀的颜色，因而不能准确进行染色定量。催化信号放大法(CSA)(在US 5, 863, 748,5, 688, 966,5, 767, 267,5, 721, 158,5，583，001,5, 196，306,6, 372，937,6, 593，100、US 6，593，100 中描述)应用生物素-酪胺
酰胺和突光素-酪胺酰胺(fluorescyl-tyramide)来增加来自HRP标记祀蛋白的信号，并且因而允许检测到本来通过传统方法(即上述方法)不可检测的低丰度靶。然而，由于强烈的本底染色以及难以解释染色结果，特别是对于荧光原位杂交(FISH)和免疫组化(IHC)样品，临床组织病理学中从来没有广泛地接受CSA作为评价组织学样品的例行方法。最近，已经描述了另外一种基于HRP放大的方法，所述方法允许检测IHC样品中的低丰度靶分子(在W02009036760、W02010094283和W02010094284中描述)。该方法没有使用DAB作为HRP的生色底物，而是作为介导HRP沉积其它可检测性HRP底物的交联剂。该方法引起沉积的HRP底物的信号强烈放大，这使得该方法的灵敏度与CSA法可比，不过与CSA法相比，这新方法有利地不引起本底标记。在该方法的其它优点中，值得提到的是检测过程的速度比传统DAB或生物素-酪胺酰胺检测过程快得多。然而，仍未解决先前方法的问题，即基于评估检测到的染色的量来评估IHC样品中靶的量。这种新方法提供了这样的染色模式，其非常清晰，但是胞内结构分辨率与传统DAB法或CSA法相同的均匀染色。该染色模式不允许将样品中染色的量直接约计为样品中靶的量，因为这两种量之间的相关性不是线性的。因此，组织学样品中由全部这些方法可视化的靶量仅可以相对而非精确地评估。因此，当已经改进方法学的质量保证计划并且提出了 IHC染色的标准时，与解释染色结果相关的计划却未改变。采用不同临界水平(cut-off level)评估组织是“阳性”或“阴性”的不同评分体系常常用来评估抗原。这种目前使用的评估不可避免地伴随对医学诊断可能非常重要的误差。基于评价样品中存在的单个靶分子的精确量评估靶表达，即所谓的单分子检测法(SMD)法，可能是通向IHC中新评分体系的方向，这种新评分体系对于医学诊断和治疗会将更可靠和可重复。不幸的是，允许组织学样品中的靶蛋白单分子可视化的可用技术的数目现在是非常有限的，并且它们仍是相当费力和冗长的方法。
基本上，全部可用的蛋白质单分子检测技术均采用基于DNA的放大体系。蛋白质单分子检测法首次以免疫-PCR展示(Sano T，Smith CL，Cantor CR.免疫-PCR :借助特异性抗体-DNA偶联物的非常敏感的抗原检测法(Immuno-PCR :very sensitive antigendetection by means of specific antibody-DNA conjugates), Science 1992 ;258 :120-122 ；Adler M，Wacker R，Niemeyer CM.用于日常超灵敏定量蛋白质的实时免疫-PCR测定法(A real-time immuno-PCR assay for routine ultrasensitive quantificationof proteins), Biochem Biophys Res Commun 2003 ；308 :240-250 ；Niemeyer CM, AdlerM，Wacker R.免疫-PCR :借助核酸扩增的高灵敏度蛋白质检测法(Immuno-PCR highsensitivity detection of proteins by nucleic酸amplification),Trends Biotechnol2005 ；23 :208-216)。使用抗体-DNA杂合结构物，抗体的亲合力由PCR可实现的敏感检测来补偿。此外，免疫-DNA检测策略被扩展至使用滚环扩增法(RCA)，一种产生与免疫-DNA偶联物系留(tethered)的长 ssDNA低聚物的等温技术(Gusev Y, Sparkowski J, RaghunathanA, Ferguson H Jr, Montano J, Bogdan N, Schweitzer B, Wiltshire S, Kingsmore SF,Maltzman W，Wheeler V.滚环扩增法一种提高免疫组织化学和流式细胞术灵敏度的新方法(Rolling circle amplification a new approach to increase sensitivity forimmunohistochemistry and flow cytometry), Am J Pathol 2001 ;159:63-69)。所提到的这些SMD方法的一些明显缺点如下⑴抗体-DNA杂合体的合成可能是问题，因为控制DNA偶联物的位置和每个蛋白质的DNA偶联物的数目并不总是直接明了的，经常导致不均匀的DNA标签/抗体比例；扩增反应难以控制；扩增步骤对温度敏感；标记是不稳定的，标记物会随着时间推移从靶弥散等。尽管在采用内蛋白子化学(intein chemistry)(或化学连接)将寡核苷酸标签位点特异地与蛋白质缀合方面的最新进展已经十分成功，但偶联物产生仍是费力的；(ii)所述方法的步骤需要控制温度；(iii)检测过程包括太多步骤；和(iv)整个检测过程占用相对长的时间。本发明的SMD方法克服上述障碍，并且使得样品中的单个靶实体可视化和量化，其中所述单个实体是在样品中固定的并且可靠的。发明简述本发明提供快速、简单且稳健的方法，它们用于不同样品中各种单个靶实体的可视化、检测和定量，其中所述靶是固定的。所述方法特别有利于评价复杂生物样品，如组织学样品。本发明的方法包括一种新颖强大的信号放大系统，该系统可以使得大量的样品中处于非常宽的动态浓度范围的独自单个靶实体，诸如单个分子、单个分子结构、单个分子复合体(complex)、单个粒子等可视化。术语“单个靶实体”在此与术语“单个/独自靶单位”可互换使用。本发明的方法包括如下步骤a)在样品中形成一个或更多个用酶活性标记的靶位点，其中，所述靶位的每一者包含单个靶单位，其中，所述靶位点通过样品的单个靶单位的总量的部分亚群体来形成；和b)在每个单个靶位点处形成可检测分子(也称为“报道分子”或“报告子”)的离散沉积物。在一些实施方式中，由于样品可能已经包含本发明的靶位点，所以上述步骤(a)可能是多余的。在其它实施方式中，本发明的方法可以包括一个或更多个其它步骤，例如c)将单个靶位点处报道分子的离散沉积物检测为可视清晰点。在一个实施方式中，本发明涉及一种样品中的独自单个靶单位可视化方法(方法(I))，其中所述靶被固定，包括a)用一种或多种结合剂来孵育含有大量靶的独自单位的样品，其中，(I)所述结合剂的至少一种含有酶；(2)所述结合剂的至少一种能够与独自单个祀单位直接结合，并形成一个或更多个离散单个靶位点，即独自单个靶单位的部分亚群体，其中每 一单个离散单个靶位点包括所述部分亚群体的一个独自单个单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂中至少一者含有所述酶；a)在水溶液⑴中孵育(a)的样品，所述水溶液⑴含有量少于2mM的过氧化物化合物，与(a)的离散单个靶位点结合的酶的第一底物，以及，所述酶的第二底物，其中所述第一底物是水溶性富电子有机化合物，所述有机化合物(I)能够与所述酶反应时产生自由基；且(2)能够在所述酶和过氧化物化合物存在的情况下交联所述第二底物的分子，从而产生所述第二底物的水不溶性聚合产物，并且，其中所述第二底物是一种偶联物分子，该偶联物分子含有适合作为所述酶的底物的至少两种化合物和可检测标记物，其中所述可检测标记物选自荧光性、发光性、放射性或生色性物质和特定特异性结合对的一个成员，从而在(a)的离散单个靶位点处形成第二底物的离散沉积物，并且可视化(a)的所述单个靶位点。包括上述步骤(a)和(b)的本发明方法可以进一步包括检测在单个靶位点处的离散沉积物的一个或更多个步骤。在一个实施方式中，上述方法(I)可以用于检测和可视化样品中的固定靶的单个独自单位的，其中所述靶以宽泛的动态浓度范围存在，所述方法包括如下步骤
a)将样品与一种或多种结合剂孵育，其中(I)所述结合剂的至少一种含有酶；(2)所述结合剂的至少一种能够与独自单个祀单位直接结合，并且用独自单个靶单位的第一部分亚群体形成一个或更多个离散的第一靶位点，其中每一单个的离散的第一靶位点包括独自单个单位的所述第一部分亚群体的一个独自单个单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂中至少一者含有具有氧化还原酶活性的酶；b)将(a)的样品与结合于(a)的第一靶位点的酶的第一底物、所述酶的第二底物分子的第一群体、和根据权利要求I的步骤(b)所述的过氧化物化合物孵育，从而在(a)的 第一靶位点处形成第一群体的第二底物分子的离散沉积物；c)将(b)的样品与下述量的过氧化氢溶液孵育，所述的量足以猝灭与(a)的第一单个靶位点结合的酶的残余活性；d)将样品(C)与一种或多种结合剂孵育，其中(I)所述结合剂的至少一种含有酶；(2)所述结合剂的至少一种能够与独自的靶单位直接结合，从而用独自单个靶单位的第二部分亚群体形成一个或更多个离散的第二靶位点，其中每一单个离散的第二靶位点含有独自单个单位的所述第二部分亚群体的一个独自单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂中至少一者含有所述酶；e)将(d)的样品与结合于第二单个靶位点的酶的第一底物、所述酶的第二底物分子的第二群体和根据上述方法(I)的步骤(b)(即权利要求I的步骤(b)的)所述的过氧化物化合物孵育，从而在(d)的第二靶位点处形成第二群体的第二底物分子的离散沉积物；f)在样品中将第一靶位点处的第一群体的第二底物分子的离散沉积物检测为第一可视清晰点，从而检测靶的第一群体的一个或更多个独自单个单位；g)在样品中进行检测，以在第二靶位点处的第二群体的第二底物分子的离散沉积物作为第二可视清晰点，从而检测靶的第二群体的一个或更多个独自单个单位。在本发明的另一实施方式中，方法(I)可以用于检测和可视化样品中至少两种不同的固定靶的独自单位，所述方法包括以下步骤a)将样品与能够结合第一靶的一种或多种结合剂孵育，其中(I)所述结合剂的至少一种含有酶；(2)所述结合剂的至少一种能够与第一独自单个祀单位直接结合，从而，用第一独自单个靶单位形成一个或更多个离散的第一单个靶位点，其中每一单个离散的第一靶位点含有第一靶的一个独自单个单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂中至少一者含有所述酶；b)将(a)的样品与结合于第一单个靶位点的酶的第一底物、所述酶的第二底物分子的第一群体和根据上述方法(I)的步骤(b)(即权利要求I的步骤(b))所述的过氧化物化合物孵育，从而在(a)的第一单个靶位点形成第一群体的第二底物分子的离散沉积物；c)将(b)的样品与下述量的过氧化氢溶液孵育，所述的量足以猝灭与(a)的第一单个结合位点结合的酶的残余活性；d)将样品(C)与能够同第二靶结合的一种或多种结合剂孵育，其中
(I)所述结合剂的至少一种含有酶；(2)所述结合剂的至少一种能够与第二独自的靶单位直接结合，从而用第二靶独自单个单位来形成一个或更多个离散的第二单个靶位点，其中每一单个离散的第二靶位点含有第二靶的一个独自单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少一种含有该酶；e)将(d)的样品与结合于第二单个结合位点的酶的第一底物、具有氧化还原酶活性的酶的第二底物分子的第二群体和根据上述方法(I)的步骤(b)(即权利要求I的步骤(b))所述的过氧化物化合物孵育，从而在(d)的第二靶位点形成第二群体的第二底物分子的离散沉积物；f)在样品中将第一靶位点处的第一群体的第二底物分子的离散沉积物检测为第一可视清晰点，从而检测第一靶的一个或更多个独自单个单位；
g)在样品中将第二靶位点处的第二群体的第二底物分子的离散沉积物检测作第可视清晰点，从而检测第二靶的一个或更多个独自单个单位。本发明的另一方面涉及用于定量样品中靶的方法，包括a)根据本发明的任一方法(如上述)处理生物样品；b)定量样品中的可视清晰点；c)评价样品中靶的量。本发明的另一方面涉及将本文所述的单个靶检测和定量法在医疗诊断中的用途，特别用于这样的预测性和治疗性应用，其中，生物标记的单个单位的可视化和定量对于诊断的精确性、评估治疗性疗法的功效、预测疾病后果、疾病风险预后或将患者针对治疗学方案分类(stratification)等是必需的。本发明的另一方面涉及了使用本发明方法检测和定量各种独自单个靶单位的测定法。非常强大和稳健的本发明放大系统同时是灵活和易控制的。其极大地扩展了目前检测方法的限值，尤其是使用常规亮视野或荧光显微镜评价样品的检测方法。特别是，使用包括本发明放大系统的检测方法时，(i)可以可视化和定量复杂样品(如组织学样品)中固定靶的单个实体；(ii)可以使用各种分析模式检测和定量固定靶的单个实体；(iii)可以非常快速地检测和定量固定靶的单个实体，如在10_20min内，然而，如果需要，可视化和检测过程可以延长或长时间中断而不有损于结果的质量；(iv)不需要通常用来降低本底标记的封闭；(V)不需要温度控制；(vi)可在非常宽泛的动态范围内检测和定量固定靶的单个实体，(vii)可以在一个过程中检测和定量样品中的多种固定靶的单个实体。因此，本发明的SMD可视化系统的巨大优点是，它简单、快速、稳健、可靠和灵活。它允许使用多种测定法可视化和定量多种样品中的多种单个靶实体。额外的优点是，该方法使用了这样的化合物，它们是市售和易于产生的充分定义的化学化合物。另一优点是，本方法的全部过程可以手工和自动地实施。
附图
简述图I显示表示为Her2(+2)的组织样品的免疫化学染色的典型显微镜照片，其中(I)是其中Her2根据本发明可视化的样品，(2)是其中Her2根据W02009036760中所述方法可视化的样品。右侧小图是方法(I)和方法(2)的染色图案的示意图。图2是根据本发明方法(显示根据权利要求I所述的步骤(b)和根据权利要求23-24所述的步骤(c))的单分子检测过程的示意图。图3显示根据本发明方法(参见实施例10)定量细胞中的Her2化的结果a. O+Herceptest对照细胞系的10倍图像的单色分害I],每图识别21点(黑色)；
b.I+Herceptest对照细胞系的10倍图像的单色分割每图识别36点(黑色)；
c.3+Herceptest对照细胞系的10倍图像的单色分割每图识别2567点(黑色);d.乳癌 10倍图像的双色分割，点是黑色，核是白色，本底是灰色，样品同C。本发明的
具体实施例方式使样品中固定靶的独自单位可视化的方法本发明的一个方面涉及样品中是靶，例如单个靶分子、单个粒子等的单个独自的单位的可视化方法，其中，靶的单个独自的单位被固定。本发明的一个实施方式涉及被固定的单个靶单位可视化方法，所述方法包括如下步骤a)形成一个或更多个离散单个靶位点，这里，每个离散的单个靶位点含有单个独自革巴单位；b)在(a)的离散单个靶位点处形成可检测分子的离散沉积物，从而显现所述单个靶位点，并且，任选地，c)检测在离散单个靶位点处的离散沉积物。特别地，上述方法的步骤(a)、(b)以及可选择的(C)可以如下进行a) a)将含有独自靶单位的群体的样品与一种或多种结合剂孵育，其中(I)所述结合剂的至少一种含有酶；(2)所述结合剂的至少一种能够与独自单个祀单位直接结合，并且形成靶的一个或更多个离散的单个靶位点，即独自单个单位的部分亚群体，其中每一单个的离散单个靶位点含有所述部分亚群体的一个独自单个单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂中至少一者含有该酶；b)将(a)的样品在水溶液⑴中孵育，所述水溶液⑴含有量少于2mM的过氧化物化合物，与(a)的离散单个靶位点结合的酶的第一底物，以及，所述酶的第二底物，其中，所述第一底物是水溶性富电子有机化合物，所述富电子有机化合物是I)能够与所述酶反应时产生自由基；并且2)能够在所述酶和过氧化物化合物存在的情况下交联所述第二底物的分子产生，从而产生所述第二底物的水不溶性聚合产物，并且，其中所述第二底物是偶联物分子，其含有适合作为所述酶的底物的至少两种化合物和可检测标记物，其中所述可检测标记物选自荧光性、发光性、放射性或生色性物质以及和特异性结合对的成员，从而在(a)的离散单个靶位点处形成第二底物的离散沉积物，并使(a)的所述单个靶位点作为可视清晰点而可视化，并且，任选地， c)检测在(a)的单个靶位点处的第一底物的离散沉积物，并使(a)的单个靶位点作为可视清晰点而可视化，从而使单个独自的靶单位可视化。在一些实施方式中，步骤(b)可以含有以下的分步骤(b’ )将(a)的样品在水溶液(ii)中孵育，所述水溶液(ii)含有过氧化物化合物，和与(a)的靶位点结合的酶的第一底物，其中所述第一底物是水溶性富电子有机化合物，所述富电子有机化合物(I)能够与所述酶反应时产生自由基，并且(2)能够在所述酶和过氧化物化合物存在的情况下交联所述第二底物的分子，从而产生所述第二底物的水不溶性聚合产物；其中过氧化物化合物的量少于2mM ;并且，然后，(b”)将样品(b’ )在水溶液⑴中(如上述)孵育。在一些实施方式中，步骤(C)可以含有以下分步骤c’)在(a)的单个靶位点处包含第二底物的离散沉积物的(b)样品与能够同沉积的第二底物的可检测标记物特异性结合的结合剂孵育，并形成含有沉积的第二底物的一个或更多个分子和所述结合剂的一个或多个分子的复合物，(c”)在样品(c’ )中检测与第二底物的离散沉积物结合的结合剂，从而检测到单个靶位点并从而检测到与所述单个靶位点结合的独自单个靶单位。本发明的方法(如上文和如下文所述)可以任选地包括一个或更多个额外步骤，例如，在步骤(a)、(b)或(C)之前的步骤，例如步骤(a)之前的用抑制样品的内源性或残余过氧化物酶活性的化合物猝灭样品的步骤，或在步骤(a)、(b)和/或(C)之间的一个或更多个步骤，或步骤(C)之后的步骤，例如在步骤(a)、(b)和(C)之前、之后或之间的一个或更多个洗涤步骤。在一个实施方式中，本方法可以包括至少一个自动步骤。在以下部分中讨论本方法的其它实施方式。星显术语“样品”意指来自较大整体或集合的代表性部分或单个单元(item)、某个量或部分的疑似包含待检测靶的物质或目标物，例如，某个部分或量的含有待分析靶分子、粒子、结构的生物、化学、环境材料，例如，活组织检查样品、食物样品、土壤样品等。常见的样品显示物质或目标物的其余部分是什么或应当是是什么。在一个实施方式中，本发明的样品可以是环境样品，例如，土壤样品或溢出物样品。在另一实施方式中，样品可以是食物样品。在另一实施方式中，样品可以是有机分子文库的一部分。在另一实施方式中，样品可以是战剂样品。在一个实施方式中本发明的样品是生物样品。
生物样品可由以下所示例I.含有悬浮细胞和/或细胞碎片的样品，例如血样、克隆细胞悬液、体组织均质物等;2.含有动物体的完整或受损细胞、 体组织、抹片或流体或肿瘤样品，例如活组织检查样品；它可以是新鲜组织样品或保存的组织样品，例如福尔马林固定石蜡包埋组织样品;3.含有活生物的样品，例如含有动物、植物、细菌、真菌等的培养基的样品；4.含有病毒颗粒、其碎片或病毒产物的样品，例如，含有病毒核酸、蛋白质、肽等的体抹片；5.含有细胞器的样品；6.含有天然或重组生物分子的样品，例如血浆样品、条件细胞培养基等。7.含有织物细胞或其碎片的样品。上述提及的生物样品的例子出于说明目的给出，但不限制本发明的实施方式。化学样品的例子可以由但不限于化学化合的文库的样品(例如肽文库)说明。环境样品的例子可由但不限于土壤样品、水样品或空气样品和食物样品说明。本发明涉及含有固定靶的样品(例如上述例子中的任一种)，即涉及其中根据本发明检测方法防止靶自由移动的样品，例如，其中通过机械或化学手段大幅度减少或消除靶运动的样品，例如，在样品或靶与特定支持物或介质或在其内部连接的情况下。因此，在一个实施方式中，含有目的靶的单个独自单位的样品在检测方法前可以固定到固体支持物之上，例如，固态体组织样品固定在玻璃载片上。含有本发明固定靶的样品的例子包括但不限于固定在玻璃或塑料载片上的体组织样品，或包括但不限于含有固定在膜或ELISA板上的生物分子或化学分子的样品等。在这些实施方式中，样品的靶可以固定在样品内部，例如在组织样品内部固定的蛋白质，或固定在表面上或特定材料内部，例如固体材料或凝胶(如硝化纤维素膜等)的一部分。在一个实施方式中，固体支持物可以是三维结构，例如胶原或琼脂块。在这个实施方式中，靶例如分子或粒子可以固定在该结构内部。在一个实施方式中，本发明涉及不含有祀的样品，例如，对照样品。在另一实施方式中，本发明涉及推测含有靶的样品，例如，具有未知内容物的样品。上文提到的术语“固体支持物”意指在本发明方法的条件下不溶解的任何材料片，例如，它可以是硝化纤维素膜、玻璃载片等。适合于固定样品和/或靶的支持物的例子包括但不限于合成聚合物支持物；如聚苯乙烯、聚丙烯、取代的聚苯乙烯等例如氨化或羧化的聚苯乙烯；聚丙烯酰胺；聚酰胺；聚氯乙烯；玻璃；琼脂糖；硝化纤维素；尼龙；聚偏二氟乙烯；表面改性尼龙等。本发明涉及在本文所述条件下为化学惰性的固体支持物，即所选择的支持物不会对本方法的检测结果产生任何显著影响。因此，可以选择适于固定符合所选择分析模式(例如，IHC、ELISA、印迹法(blotting)等)的样品或靶的任何这种惰性支持物。IE术语“靶”在本文中意指推测在样品中存在的可以通过特定物理和/或功能特性表征的目的目标物。应当理解，在本发明的语境下，术语“靶”涉及该目标物的基本上相同实体的整体库(pool)，而不涉及样品中该目标物的单个实体。本文中的术语“基本上相同”意指样品中靶的总库的全部或基本上全部单个实体具有使它们可识别为靶的一个或更多个特性。例如，靶是样品中的特定蛋白质，包括这种特定蛋白的全部分子；本发明靶的另一例子是特定的分子复合物或分子结构，包括样品中含有这种特定分子复合物或分子结构的基本上全部目标物；本发明的靶的另一例子是病毒颗粒或细菌，其中，样品的这种病毒颗粒或这种细菌的总群体是靶。与表征特定细胞类型、组织、细胞结构、生理条件相关的生物目标物，如分子、分子复合物、结构、粒子或生物经常称作这种特定细胞类型、组织、细胞结构或生理条件的“生物标记”。此类生物标记的非限定例子包括但不限于特定核苷酸序列、蛋白质或其它生物分子，例如糖类或脂类、染色体或膜结构、病毒、细菌、微生物等。在本发明的一些实施方式中，术语“靶”与术语“生物标记”互换使用，并涉及表征特定细胞类型、组织、生理条件等的分子、分子复合物、结构或粒子，其中，测试样品中后一类生物标记的任一者的总群体均视为靶。在一个实施方式中，靶可以是蛋白质，例如，细胞膜受体或胞质蛋白，在另一实施 方式中，靶可以是核酸，例如胞质核酸。任何稍后体到的靶的衍生物，例如靶蛋白或靶核酸等的片段、前体、突变体在本发明的一些实施方式中也可以是靶。因此，在本发明的不同实施方式中，靶可以是生物学或化学靶分子，或粒子，或分子复合物或细胞复合物，或分子结构或细胞结构，或病毒，或微生物，或所述靶分子、粒子、复合物、结构、病毒或微生物的片段。化学样品和环境样品中所包含的靶可以是不同的污染物、毒素、战剂、分子库成员、工业有毒废弃化合物等。特别地，本发明涉及可以由样品中多个独立的基本上相同单位代表的靶，特别地，本发明涉及单个独自的祀单位。术语“单位(unit) ”意指在计算时视作整体并且起到执行一项特定功能作用的靶的单个量。术语“独自的(individual)”意指某个单位与同类的其它单位或环境的其它成分可分开(通过功能的物理特性)并且可以单独地看待和和计数。术语“独自单位”与术语“单个单位”互换使用。术语“单个”在本文中意指靶单位由单独的整体构成，在数量方面仅由一个构成，由与众多相对或相反的一个构成。例如，靶蛋白的单个/独自单位意指该靶蛋白的单个独自的蛋白质分子，即同类多个分子的一个分子。术语“基本上相同单位”意指靶的多个单个单位具有使得这些单位被视作靶的一个或更多个特性。术语“独立的”意指单个靶单位作为独特实体存在，并且不依靠样品中同类其它独特实体的存在。本发明的一些实施方式涉及作为分子的单个部分的单个单位。术语“分子的单个部分”意指分子的具有特殊特性的部分，所述特性允许将分子的这个部分与相同分子的其它部分区别看待，例如，靶蛋白的蛋白酶解片段、融合蛋白的部分、靶蛋白的特定结构域、核酸的特定结构、表位等。因此，在一个实施方式中，本发明涉及作为单个独自靶分子的单个/独自靶单位，即，涉及样品中存在的多个单个独自靶分子，在另一实施方式中，本发明涉及作为分子的单个独自部分的单个/独自靶单位，例如，在样品中多个靶分子中存在的特定分子结构，例如，表位。在另一实施方式中，本发明可以涉及构成样品中存在的病毒颗粒库的多个单个独自的病毒颗粒。在不同实施方式中，靶的多个单个单位可以由单个独自的生物分子或化学分子、单个独自的单个粒子、单个独自的分子复合物或细胞复合物、单个独自的分子结构或细胞结构、或单个独自的病毒或单个独自的微生物、或所述分子、粒子、复合物、结构、病毒或微生物单个独自的片段代表。在一个优选的实施方式中，靶是与癌相关的生物标记，例如激素和生长因子及其受体、细胞黏附分子、信号转导分子、细胞周期调控分子等的核酸和多肽，例如，包括生长因子PDGF、VEGF, TGF、HGF或EGF、它们的受体和与途径相关的分子的基因、RNA和蛋白、与信号转导途径(例如JAK/STAT途径或Akt 1/PKB细胞生存途径或5-FU途径)相关的基因及其产物、雌激素受体ER及其基因(ERSl)等。本发明的方法允许简单且快速地可视化和定量所述生物标记。 本发明的方法样品中可以允许可视化和定量以宽泛动态范围存在的单个独自的靶单位。在一个或同样的样品中，非常高数量的靶和非常低数量的靶均可以在一个和同样的品中可视化或定量，或它们可以在独立的样品中评价。两种或更多种不同的靶可以在一个或相同的样品中可视化，例如蛋白靶和核酸靶，或两种或更多种不同的蛋白靶，或两种或更多种不同的核酸靶等。
在一个实施方式中，单个靶单位可以基本上均匀地遍及整个样品分布，在其它实施方式中，单个靶单位可以在样品的一个部分中更丰富，而在其余部分中较不丰富。在后述全部实施方式中，单个靶单位可以通过使用本发明的方法，在一个和同样的样品中可视化和定量。在一些实施方式中，其中单个靶单位与另一个目的靶结合，例如存在于作为某个病理状况的生物标记的特定分子共生体(association)或结构中，所述的其它目的靶也可以通过可视化和定量该样品中的单个靶单位而可视化和定量。在一个实施方式中，本发明涉及样品中的单个靶单位的部分亚群体，如存在于样品中的单个独自祀单位的总数(total number)的多数(majority)或少数(minority)。术语“部分亚群体”本文中意指单个祀单位的总群体(population)的一部分,其等于或少于99%,例如等于或少于样品中单个祀单位的总量(total quantity)的90%,如少于85%,例如，样品中单个靶单位的总量的75-80%，如少于75%，例如，样品中单个靶单位的总量的1%至50%，如，样品中单个靶单位的总量的1%至25%等。根据本发明，将总群体的50%-99%所代表的单个靶单位的部分亚群体定义为样品中存在的单个靶单位的多数。将样品中由少于单个靶单位的总群体的50%所代表的部分亚群体定义为样品中存在的单个靶单位的少数。在一个实施方式中，独自单个靶单位的多数可以参与本发明的离散单个靶位点的形成；在另一实施方式中，独自单个靶单位的少数可以参与本发明的离散单个靶位点的形成。在一个实施方式中，当靶或单个靶单位以非常低的数量在样品中存在时，可以优选基本上全部独自单个单位参与本发明的离散单个结合位点的形成。结合剂本发明方法包含一个步骤，其中将推测含有靶的样品与一种或多种结合剂孵育，所述结合剂的至少一种能够识别并且特异性结合单个独自的靶单位。术语“结合剂”意指能够直接或间接与单个靶单位例如靶蛋白的独自分子特异性结合。术语“特异性地”意指结合剂对靶具有特殊亲合力，例如对靶分子的亲合力，或对结合至靶的试剂的特殊亲合力，例如对结合至靶蛋白的一级抗体的亲合力，对与一级抗体偶联的半抗原的亲合力等。术语“直接”意指对单个独自靶单位具有特异性亲合力的结合剂相互作用并且一旦相互作用时则与这个单个独自单位形成直接结合，例如，一级抗体与曾用作产生所述一级抗体的抗原的单个独自靶分子直接结合。术语“间接”在本文中涉及结合剂，其中所述结合剂对单个独自靶单位没有特异性亲合力，但所述结合剂对能够与这个单个独自单位特异性结合的另一种物质(例如一级抗体)具有特异性亲合力，或所述结合剂对与所述单个独自单位结合或连接的物质(例如对半抗原)具有特异性亲合力；所述结合剂与后一种物质直接相互作用并且与所述物质形成结合，从而该结合剂变得与单个靶单位间接
彡口口 在本文,能够与单个祀单位直接特异性结合的结合剂一般由第一结合剂表示。能够与单个靶单位间接特异性结合的结合剂一般由第二结合剂表示。然而，本发明的检测系统可进一步含有可以与单个靶单位间接结合的其它结合剂，例如第三、第四和其它结合剂。通常，第一结合剂，或在一些实施方式中，第二或第三结合剂，用来与样品接触以识别靶，与靶结合并且与其形成复合物。第二、第三和其它结合剂可以用于本发明方法的其它步骤中，例如用于在下述靶位点处识别可检测分子的沉积物。一些实施方式中，第二第三和其它结合剂用来放大与靶结合的信号。这些结合剂还用于增加检测系统的灵活性，例如 用来改变与靶结合的初始信号，例如将红色荧光信号改变为绿色等。本发明的结合剂可以是不同特异性结合对的成员。本领域中已知众多不同的特异性结合对，它们是能够相互特异性结合的成对的两种不同分子。适用于实施本发明的特异性结合对的成员可以是免疫型或非免疫型的。非免疫特异性结合对包括其中两种组分相互共有天然亲合力，但不是抗体的系统。示例的非免疫结合对是生物素-亲和素或生物素-链酶亲和素、叶酸-叶酸结合蛋白、互补性核酸、受体-配体等。本发明也包括彼此形成共价键的非免疫结合对。示例的共价结合对包括巯基反应基团(如马来酰亚胺)和卤乙酰基衍生物和胺反应基团如异硫氰酸酯、琥珀酸酯、磺酰卤，以及如3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)和3-( 二甲基-氨基)苯甲酸(DMAB)的偶合染料等。免疫特异性结合对可以例举为抗体-抗体系统或半抗原-抗半抗原系统。在一个实施方式中，本发明的免疫特异性结合对可以是含有彼此具有亲合力的两个或更多个抗体分子的抗体-抗体结合对，例如一级抗体和二级抗体对，其中一级抗体表示第一结合剂且二级抗体表示第二结合剂；含有3个或4个或更多个抗体成员的抗体系统可以用于另一实施方式中。在本发明的其它实施方式中，免疫结合对可以由半抗原-抗半抗原系统代表。在此类实施方式中，第一结合剂可以由含有对靶和半抗原具有亲合力的分子的偶联物(例如与半抗原连接的一级抗体或核酸序列)代表，并且第二结合剂可以由抗半抗原抗体代表。术语“半抗原”意指小分子，其中可以将所述小分子视作可以产生抗体的孤立表位，尽管如果注入动物中，半抗原单独不会引起免疫反应，它必须与载体(通常是蛋白质)偶联。由于半抗原是小分子，故半抗原的多个副本可以连接至大分子，例如聚合物分子，如蛋白质、核苷酸序列、葡聚糖等。在信号放大是必需或有利的情况下，半抗原可以充当测定模式的便利标记物分子。因此，结合的多个半抗原副本提供了增强的灵敏度，例如增加的信号强度。合适半抗原的非限定例子包括荧光素(FITC)、2，4- 二硝基酚(DNP)、myc洋地黄毒苷(DIG)、酪氨酸、硝基酪氨酸素、生物素和染料，例如四甲基罗丹明、得克萨斯红， 丹横酸、Alexa Fluor 488、BODIPY FL、萤光黄和 Alexa Fluor405/Cascade Blue 突光团。US20080305497中所述的半抗原也可以用于本发明的目的。如本文中所用，术语“抗体”意指免疫球蛋白或其部分，并且包括含有抗原结合位点的任何多肽，无论其来源、产生方法和其它特征是什么。该术语包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、人性化抗体、单链、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体和CDR-移植抗体。抗体的部分可以包括仍结合抗原的任何片段，例如Fab、F(ab’)2、Fv、SCFv。抗体的起源由基因组序列限定，无论产生方法是什么。在本发明的文字中，一级抗体意指特异性与靶结合，尤其与样品的单个靶单位特异性结合上，例如与单个靶分子结合的抗体结合剂，例如完整抗体分子、所述分子的片段或衍生物，例如含有抗体的偶联物或聚合抗体。在一些实施方式中，一级抗体可以是能够与不同靶的两个(或更多)单个独自单位结合的二价抗体，例如能够与受体二聚物例如Her2/Her3 二聚物结合的抗体。在这个实施方式中，本发明的单个靶单位是单个Her2/Her3 二聚物，并且该靶是样品中的Her2/her3 二聚物的群体，其包括该样品的全部所述二聚物。一级抗体可以源自任何温血物种,例如哺乳动物、鸟类。在本发明的语境中，二级抗体意指具有下述抗原结合结构域的抗体结合剂，例如整个抗体分子、所述分子的片段或衍生物，例如，含有抗体的偶联物或聚合抗体，其中所述 抗原结合结构域与一级抗体或在靶位点处沉积的半抗原，或与一级抗体或其它结合剂直接或间接连接的半抗原特异性结合。在本发明的语境中，三级抗体意指具有下述抗原结合结构域的抗体结合剂，例如整个抗体分子、所述分子的片段或衍生物，例如，含有抗体的偶联物或聚合抗体，其中所述抗原结合结构域与二级抗体或连接至二级抗体的半抗原或连接至聚合物(其与二级抗体偶联)的半抗原或在靶位点处沉积的半抗原特异性结合。有时，抗体可以同时充当二级抗体和三级抗体。本发明中使用的抗体，包括一级抗体二级抗体和三级抗体，可以可以源自任何温血物种，例如大鼠、小鼠、山羊、豚鼠、驴、兔、马、羊驼(Iama)、骆驼或任何鸟类物种,例如鸡、鸭。如本文中所用，源自任何温血物种或鸟类物种，意指编码源自特定哺乳动物(例如大鼠、小鼠、山羊或兔)或特定鸟(例如鸡、鸭)的基因组序列中的特定抗体的核酸序列的至少部分。抗体可以是任意同种型(isotype),例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE或任何亚类,例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。在某些实施方式中，一级抗体包含能够与生物标记特异性结合，尤其与所述生物标记的单个独自单位结合的抗原结合区，其中所述生物标记由生物样品的细胞表达。所述标记可以表达在细胞表面上或细胞膜内部，即在细胞内部，例如细胞质内部、内质网内部等。在一些实施方式中，生物标记可以从细胞提取，并且它因此存在于无细胞的介质中，例如水溶液中，或它是存在于细胞培养基、血浆、脑脊液等中的可溶性分子。相应样品的例子如上所述。在某些实施方式中，二级抗体包含与一级抗体(例如与一级抗体的恒定区结合)特异性结合的抗原结合区。在某些实施方式中，二级抗体可以偶联至聚合物。在一些实施方式中，2-20个二级抗体，如5-15个二级抗体可以与聚合物偶联。在其它实施方式中，聚合物可以与1-10个二级抗体偶联，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个二级抗体。在某些实施方式中，三级抗体可包含与二级抗体的抗原结合区(例如与二级抗体的恒定区)或与连接到二级抗体的半抗原或与偶联于二级抗体的聚合物特异性结合。在某些实施方式中，三级抗体与聚合物偶联。在一些实施方式中，1-20个三级抗体可以与聚合物偶联。在其它实施方式中，1-5个三级抗体，如1、2、3、4或5个三级抗体可以与聚合物偶联。在一些实施方式中，可以优选含有结合剂的单个结合单位的聚合物，例如与一个分子的一级、二级或三级抗体偶联的聚合物。可以用于本发明目的的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体、工程化抗体(包括嵌合抗体、CDR移植抗体和使用噬菌体展示法或替代技术产生的人工选择抗体。本发明的抗体结合剂可以通过本领域公知的多种方法中任一种方法产生，例如，根据Harlow和Lane,Antibodies a Laboratory Manual (抗体实验室手册)，(1988) (ColdSpring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)。用于产生重组抗体分子的技术在上述文献和许多其它文献中描述，例如EP 0623679、EP 0368684和EP 0436597。编码抗体的核酸可以从cDNA库分离。编码抗体的核酸可以从噬菌体文库分离(参见例如McCafferty等人 1990，Nature 348 :552，Kang 等人 1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :4363 ；EP 0 589 877B1)，编码抗体的核酸可以通过已知序列的基因改组来获得(Mark等人1992，Bio/Technol. 10 :779)。编码抗体的核酸可以通过体内重组来分离(Waterhouse等人1993, Nucl. Acid. Res. 21 :2265)。本发明方法中所用的抗体包括人源化免疫球蛋白(参见U. S. 5，585，089，Jones等人1986，Nature 332 :323)。本发明的抗体可以以任何可能方式改变，只要它们仍保持结合亲合力，例如它们可以与效应蛋白、毒素、标记物等融合。将抗体与不同试剂偶联的方法是本领域公知的并且在本发明下文的示例性实施方式中描述。在本发明的一个实施方式中，抗体结合剂由Fab区代表。在一个实施方式中，抗体结合剂可以是含有两种或多种不同抗体结合剂的组合物，例如是含有第一抗体结合剂和第二抗体结合剂的组合物，其中两种或多种不同的抗体试剂是不同的免疫结合对。在一个实施方式中，组合物中的至少两种或多种不同抗体结合剂是一种能够与靶特异性结合的抗体并且至少一种另外的抗体是含有酶的抗体。在另一实施方式中，本发明涉及作为非免疫特异性结合对(如互补性核苷酸序列或核酸类似物分子)的成员的结合剂。含有核酸或核酸类似物分子(例如DNA分子、RNA分子、PNA分子)的结合剂，可以用于可视化和定量核酸靶的单个独自单位。可以化学地合成或在重组细胞中产生用作本发明目的的结合剂的核酸序列。两种产生模式均是本领域公知的(参见例如Sambrook等(1989), Molecular Cloning ALaboratory Manual (分子克隆实验室手册,第二版)，Cold Spring Harbor Press)。在一些实施方式中，核酸结合剂可以含有肽核酸(PNA)。肽核酸是其中通常存在于DNA和RNA中的脱氧核糖或核糖主链被肽主链替换的核酸分子。产生PNA的方法是本领域已知的(参见例如 Nielson, 2001, Current Opinion in Biotechnology 12 :16)(因而通过引用的方式并入)。在其它实施方式中，结合剂可以含有锁核酸(LNA) (Sorenson等2003，Chem.Commun.7 (17) :2130)。 在一些实施方式中，核酸结合剂可以含有在特定严格性条件下与生物样品中靶序列的单个单位(例如单个mRNA序列)特异性杂交的至少一个寡核苷酸序列或至少一个多核苷酸序列。术语“在严格条件下杂交”在本文中用来描述杂交条件，在所述杂交条件下，彼此明显互补,如至少70%、至少80%、至少85-90%互补的核苷酸序列仍维持彼此结合。互补百分比如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res，25 :3389-3402 (因而通过引用的方式并入)所述那样确定。指定的严格性条件是本领域已知的并且可以在Current Protocolsin Molecular Biology, John ffiley&Sons, Inc. (Ausubel 等人 1995 编著)的第 2、4 和 6部分(因而通过引用的方式并入)中找到。此外，指定的严格性条件在ambrook等(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 2 版 Cold Spring Harbor Press,第 7、9和11章(因而通过引用的方式并入)中描述。在一些实施方式中，杂交条件是高严格性条件。高严格性杂交条件的一个例子是在65-70°C在4X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交或在42-50°C在4X SSC加50%甲酰胺中杂交，然后在at 65_70°C在IX SSC中洗涤一次或多次。可以将其它试剂添加至杂交缓冲液和/或洗涤缓冲液中，例如封闭剂(BSA或鲑鱼精DNA)、去垢剂(SDS)、螯合剂(EDTA)、FicolI、PVP 等。在一些实施方式中，结合剂可以在中等严格性条件下与样品中的靶序列杂交。如本文中所用，中等严格性包括可以由本领域普通技术人员基于例如DNA的长度轻易确定的条件。例举的条件在 Sambrook 等 Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 2 版第 I卷，第 I. 101-104 页，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)(因而通过引用的方 式并入)中描述，并包括使用5XSSC、0. 5%SDS、1.0mM EDTA (pH 8.0)的预洗涤溶液，杂交条件为50%甲酰胺、6X SSC,420C (或其它类似的杂交溶液，如Stark' s溶液，42°C，在50%甲酰胺中)，并且洗涤条件为60°C、0. 5X SSC、0. 1% SDS0在一些实施方式中，结合剂在低严格性条件下与样品中的靶序列杂交。如本文中所用，低严格条件包括可以由本领域普通技术人员基于例如DNA的长度轻易确定的条件。低严格条件可包括，例如，将DNA在40°C在包含35%甲酰胺、5x SSC、50mM Tris-HCl (pH7. 5)、5mM EDTA、0. 1%PVP、0. l%Ficoll、1%BSA和 500 u g/ml 变性鲑鱼精 DNA 的溶液中预处理6小时。杂交在相同的溶液中进行，同时作出如下改变0. 02%PVP、0. 02%Ficoll、0. 2%BSA、100 u g/ml鲑鱼精DNA、10%(Wt/vol)硫酸葡聚糖，并使用5_20xl06CPM结合剂。样品在40°C在杂交混合液中孵育18-20小时，然后在55°C于含有2x SSC、25mM Tris-HCl (pH 7.4)、5mMEDTA和0. 1%SDS的溶液中洗涤I. 5小时。将洗涤溶液更换为新鲜溶液并且在60°C孵育额外I. 5小时。在其它实施方式中，本发明可以涉及作为肽序列或含有肽序列的结合剂，其中所述肽序列源自非抗体蛋白质，例如，源自不同蛋白的核酸结合结构域、不同细胞受体和核受体的配体及其衍生物中的肽序列。此类结合剂的一些非限定例子可以是补体级联经典途径的clq蛋白(其可以与抗体恒定区结合)、MHC分子(例如，MHC I类、MHC II类和非传统MHC)、具有特异性结合配体的分子(如参与胞内信号转导途径的分子，如具有亮氨酸拉链结构域的分子，例如，fos/jun,myc,GCN4)、具有SHl或SH2结构域的分子(如Src或Grb_2)、免疫球蛋白受体(例如Fe受体)、嵌合蛋白(即经工程化以组合两种或多种特异性结合配偶物之特性的蛋白质，例如，可以将亮氨酸拉链工程化至抗体的Fe区中，可以将SH2结构域工程化以在抗体的Fe区中表达)。在其它实施方式中，可以工程化融合蛋白，其包含带有置换的可变结构域的抗体Fe部分。结合剂也可以是可以与大生物分子的特定结构单位特异性结合的小分子。在一些实施方式中，结合剂可以含有可检测标记物，例如荧光物质、半抗原、酶等。在一个实施方式中，本发明涉及能够与沉积的可检测分子特异性结合并且并用于可视化本发明靶位点的标记的结合剂，即标记的第三或其它结合剂。在一个实施方式中，本发明涉及含有酶标记物的结合剂。适合的酶标记物的非限定例子可以是辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、^ -半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、^ -N-乙酰葡糖胺糖苷酶、3 -葡萄糖醛酸酶、蔗糖酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫萤光素酶、葡萄糖氧化酶(GO)。在一个实施方式中，结合剂可以含有HRP作为标记物。在另一实施方式中，结合剂可以含有AP作为标记物。对于形成本发明靶位点所必需的结合剂的量可以取决于其它因素，例如样品种类、靶种类、结合剂种类、结合剂的结合亲合力等。使用公知常识，本领域技术人员可以选择合适的结合剂并且确定每一特定实施方式所需要的量。在一些实施方式中，可以优选的是，调节形成靶位点的结合剂的量，从而并非全部存在于样品中的单个靶单位而是其部分亚群体参与本发明靶位点的形成，例如在样品以丰沛量含有靶或靶以宽泛动态浓度范围存在时的实施方式中。在其它实施方式中，可以优选全部靶或基本上全部的单个单位参与本发明靶位点的形成，例如在具有十分低的靶或单个靶单位表达的样品情况下。在以下实施方式中，可以优选以这样的量使用结合剂，其中所述的量将确保用样品的的基本上多数的独自单个单位形成结合位点，即，基本上多数的存在的单个靶单位将参与靶位点的形成。
塵根据本发明，样品含有一个或更多个独自靶单位。根据本发明，包含酶的至少一种结合剂直接或间接结合单个靶单位并且与所述单位形成的复合物。根据本发明的酶是具有氧化还原酶活性的酶(在本文中互换称作“氧化还原酶”或“本发明的酶”)。术语“具有氧化还原酶活性的酶”意指按EC(酶分类编号)分类为ECI的酶，所述酶催化电子从一个分子(还原剂，也称为氢或电子供体)转移至另一分子(氧化剂，也称为氢或电子受体)。在一些优选的实施方式中，本发明涉及分类为E 1.10.(酚氧化酶)和E 1.11.(过氧化物酶)的氧化还原酶。在一个优选的实施方式中，本发明涉及酚氧化酶，特别涉及含铜氧化酶漆酶(Laccase) (E I. 10. 3. 2)家族。漆酶作用于酚和类似分子，进行单电子氧化。漆酶在木质素的形成中通过促进木质醇(一个天然存在的酚类家族)的氧化偶联发挥作用。适合于本发明目的的漆酶可以是例如在Phillips LE和Leonard TJ(联苯胺作为测量裂褶菌粗制无细胞提取物中酚氧化酶活性的底物(Benzidineas a Substrate for Measuring Phenoloxidase Activity in Crude Cell-FreeExtracts of Schizophyllum commune), Mycologia 1976,68 :277-285),或 Kunamneni A,Plou FJ, Ballesteros A, Alcalde M.(漆酶及其应用专利综述(Laccases and theirapplications a patent review), Recent Pat Biotechnol. 2008,2(I) :10-24),或Rodriguez Couto S, Toca Herrera JL(漆酶的工业和生物技术应用综述(Industrialand biotechnological applications of laccases a review), Biotechnol Adv. 2006,24(5) :500-13.)中描述的酶。本文中，术语“漆酶”用来指本发明的具有酚氧化酶活性的酶，然而，应当理解，漆酶只是适合于本发明目的的酚氧化酶的许多实施方式中的一种。在另一优选实施方式中，本发明涉及催化以下形式反应的过氧化物酶酶活R00R' + 电子供体(2e)+2H+— R0H+R' OH在本发明的一个优选的实施方式中，具有过氧化物酶活性的酶是辣根过氧化物酶(HRP)。在本发明的另一实施方式中，具有过氧化物酶活性的酶是大豆过氧化物酶(SP)。
对于一些过氧化物酶，最佳底物是过氧化氢，其它过氧化物酶在采用有机过氧化氢(如有机过氧化物)时更活跃。电子供体的性质十分依赖于酶的结构，例如辣根过氧化物酶(HRP)可以使用多种有机化合物既作为电子供体，又作为受体。HRP具有可接触的活性部位，并且许多化合物可以抵达这个反应位点。酶活性，即氧化还原酶活性，例如酚氧化酶或过氧化物酶活性，可以由与结合剂分子直接或间接连接的酶的全长分子或合并有酶活性的酶片段(例如酶分子的全尺寸的51%至99. 9%,或少于51%，例如40%，30%或更少)代表。本发明的结合剂可以直接或间接与一个或更多个酶部分偶联(本文中的术语“部分(moiety) ”意指具有氧化还原酶活性的酶分子的部分，它包括完整或基本上完整的酶分子以及所述分子的具有氧化还原酶活性的部分)。第一和/或第二结合剂中二者或任一的分子可以与氧化还原酶的一个或几个功能活性部分偶联。在一个实施方式中，第一结合剂 的至少一个分子可以与具有氧化还原酶活性的一个或更多个酶促部分偶联；在另一实施方式中，第二结合剂的至少一个分子可以与一个或更多个这样的部分偶联。第三和其它结合剂的分子也可以与氧化还原酶偶联。术语“直接偶联”意指酶部分通过化学键连接到结合剂分子上。术语“间接偶联”意指酶的部分通过连接分子连接到结合剂分子上，其中所述连接分子具有与结合的一个化学键以及与酶结合的另一化学键。偶联生物分子和交联剂分子的方法是本领域熟知的并且在下文例示。在一个实施方式中，氧化还原酶部分是HRP的部分，例如完整HRP分子、其具有HRP酶活性的片段，也可以是含有具有酶活性的HRP部分的重组蛋白等。在另一实施方式中氧化还原酶的部分可以是大豆过氧化物酶(SP)的部分。在另一实施方式中，氧化还原酶的部分可以是漆酶的部分。含有具有氧化还原酶活性的酶的结合剂的非限定例子可以是与一个或更多个HRP部分偶联的抗体分子或其衍生物，例如Fab，以及与HRP偶联的核酸结合剂。此类结合剂直接或间接与单个靶单位(例如单个靶分子)结合并且因而形成复合物，其中单个这样的复合物含有单个独自的靶单位以及一个或更多个结合剂(其中所结合剂的一个或更多个含有具有氧化还原酶活性的酶)。在一个实施方式中，结合剂是含有一个、两个或更多个过氧化物酶部分的偶联物，其中所述部分直接连接于结合剂，例如直接与一个或更多个HRP部分偶联的抗体分子。在另一实施方式中，结合剂可以是含有间接连接于结合剂的具有过氧化物酶活性的两种或更多种酶(例如两个或更多个HRP部分)的偶联物，例如，这样的偶联物，其中一个或更多个抗体分子与和一个或更多个HRP部分独立地连接于主链聚合物，即具有过氧化物酶活性的酶间接与结合剂即与到抗体连接。每个结合剂分子的HRP数目可以变动，从每个结合剂I个酶部分至每个结合剂20-50个酶部分或甚至更高。在一些实施方式中，优选使用这样的结合剂，其中HRP部分的数目是每个结合剂至少2个，优选地2-25个酶部分，例如在3和20个之间，如4、5、6、7、8、9、10个等。已经惊奇地发现，使用的结合剂中，每个结合剂的酶部分的数量超过1，每个结合剂优选超过2，优选每个结合剂超过3。在一些实施方式中，优选使用这样的结合剂，其含有每个结合剂超过4个酶部分，优选5和20个之间，例如从5到15个酶部分。具有超过4个酶部分的结合剂有利于形成这样的靶位点，其可以可视化为大小上基本上相同的点。在一些实施方式中，甚至可以优选的是，含有此类结合分子库的酶的每个结合剂分子含有大约相同数目的酶部分，例如库中的每个结合剂含有4-6个，每个结合剂分子5-7、6-8、7-9、8-10个等酶部分，例如每个抗体分子(例如每个一级抗体分子或每个二级抗体分子)5-6或6-7个HRP部分。含有多个HRP部分的下述结合剂架构建体是示例性的。为了获得所提到的效果，结合剂可以含有上文讨论的具有氧化还原酶活性的本发明任何酶的多个部分。结合剂还可以含有不同氧化还原酶的多个部分的组合。在一些其它实施方式中，可以优选结合剂的相对小的偶联物分子，例如，与酶(例如HRP)的一个或两个或更多部分偶联的单个抗体分子或抗体的分离Fab区。此类结合剂是相对紧凑的分子并且这可能有利于检测在靶或样品中被“隐藏”或掩蔽的独自靶单位，例如独自的单个靶分子可能被被周围的其它分子掩蔽，单个靶结构可能隐藏在靶分子内，或单个病毒颗粒能在含有细胞的复杂生物样品中难以接触。 在一些其它实施方式中，可以优选含有一个结合剂和数十至数百个酶部 分的巨大偶联物。此类结合剂可能例如在关注于非常快速的靶检测或或需要获得每个独自靶位点巨大沉积物的情况下是有利的。与包含具有氧化还原酶活性(例如过氧化物酶活性)的酶的结合剂(直接或间接)结合的单个靶单位构成本发明的单个靶位点。在一个实施方式中，本发明的单个靶位点含有靶的单个靶单位、至少一个一级抗体或其衍生物以及至少一个二级抗体或其衍生物，其与一个、两个或更多个具有过氧化物酶活性的酶(例如HRP)偶联。在另一实施方式中，单个靶位点可以含有单个靶单位、与半抗原偶联的至少一个一级抗体分子和与一个、两个或更多个具有过氧化物酶活性的酶(例如HRP)偶联的针对所述半抗原的抗体。在另一实施方式中，靶位点可以含有单个靶单位、一个或多个对该靶特异的第一核酸/核酸类似物结合剂以及一个或多个对第一核酸/核酸类似物结合剂特异的第二核酸/核酸类似物结合剂结合剂。上述实施方式是非限性的。在其它实施方式中，本发明可以涉及上述讨论的单个任意靶单位与上述讨论的任意结合剂的任意组合，其形成本发明的靶位点。在一个实施方式中，本发明的单个靶位点可以是固体支持物的单个位点，其含有用本发明的酶活性标记、即与具有氧化还原酶活性的酶直接或间接偶联的单个靶单位，或是含有具有氧化还原酶活性的酶的重组融合分子的单个单位。在一个实施方式中，氧化还原酶可以是靶本身。相应地，该实施方式中的靶位点可以仅含有氧化还原酶酶的一个单个单位，如固定的氧化还原酶部分，例如固定在固体支持物之上或内部的HRP或漆酶。酶底物在与一种或多种结合剂孵育并形成上述的本发明靶位点之后，含有一个或更多个本发明单个靶位点的样品在水溶液(i)中孵育。本发明的水溶液(i)含有与本发明的单个靶位点结合的酶的第一底物，其中所述第一底物是水溶性富电子有机化合物，其(I)能够与该酶反应时产生稳定自由基，并且(2)能够在所述酶和过氧化物化合物存在的情况下交联所述酶的第二底物分子，从而产生所述第二底物的水不溶性聚合产物。本发明的水溶液(i)也含有与本发明的单个靶位点结合的酶的第二底物，其中所述第二底物是偶联物分子，该分子含有能够作为所述酶的底物的至少两种化合物和可检测标记物，其中所述可检测标记物选自荧光性、发光性、放射性或生色性物质或特异性结合对的成员。第一底物与本发明的单个靶位点结合的酶的第一底物(以后也称为“第一底物”)是具有氧化还原酶活性的酶的底物。该底物(I)是水溶性富电子有机化合物，(2)能够与所述酶反应时产生自由基，(3)能够交联所述酶的第二底物的水溶性分子(在所述酶和过氧化物化合物存下)，从而产生所述第二底物的水不溶性聚合产物。术语“水溶性”意指第一底物的分子能够在水中和含水溶液中溶解。术语“富电子化合物”本文中意指含有连接的P-轨道的共轭系统的有机化合物，包括具有交替单键和多键的化合物。孤对电子和自由基可以是该系统的部分。该化合物可以是环状、非环状或二者。“共轭”意指一个P-轨道与另一个穿过居间性O键重叠(在较大的原子中可能涉及d-轨道)。一个共轭系统具有桥接居间单键的重叠P-轨道区域。这些P-轨道造成电 子跨越相邻对齐的P-轨道离域，这通常可以降低分子的整体能量并提高稳定性。共轭系统的n电子不属于单键或原子，而属于一组原子。具有氧化还原酶活性的本发明酶包括可以利用巨大数目底物的多样酶。在这些底物中，本发明的底物是这样的化合物，它们是含有偶联n系统的水溶性有机富电子有机化合物，所述水溶性有机富电子有机化合物能够与具有氧化还原酶活性的本发明酶反应时产生自由基，优选地是稳定的自由基。术语“稳定的自由基”在本文中意指在本发明的条件下，例如在水溶液(i)中，第一底物的自由基具有至少20秒、优选约I分钟至约15分钟，或长于例如2、3、4或5分钟，在5和10分钟之间等的寿命。另外，构成本发明第一底物组的化合物的自由基能够交联本发明的第二底物的水溶性分子，从而将所述水溶性分子转化成水不溶性聚合产物。特别地，在一个实施方式中，本发明涉及由水溶性有机富电子化合物、含有一系列至少三个(C-C=)重复的化合物或含有芳香环结构的化合物代表的第一底物，其中所述水溶性有机富电子化合物具有一种相互连接的碳原子，其中每隔两个键优选地是双键。在一个实施方式中，第一底物可以有含有式(I)结构的化合物代表
Rl_\^R3 R4 ,其中Rl是芳基或乙烯基，R2、R3和R4独立地为H、N- (X) 2、0_ (X) 2，其中X是烷基、乙烯基或芳基或H，其中R2、R3和R4不同时为H，其中，H 是氢；0 是氧。具有如具有氧化还原酶活性的本发明酶的第一底物那样能力的上述式的化合物的非限定例子可以是3’ 3’ - 二氨基联苯胺、阿魏酸、a-氰基-4-羟基-肉桂酸及其衍生物。在一个优选的实施方式中，本发明涉及作为第一底物的3’ 3’ - 二氨基联苯胺(DAB)。本发明利用DAB形成稳定自由基的能力，所述稳定自由基可以在具有氧化还原酶活性的酶(即辣根过氧化物酶(HRP))和过氧化物化合物(即过氧化氢)存在下交联第二底物的分子，并在单个祀位点处尚散地沉积交联的第二底物分子。在另一优选实施方式中，本发明涉及作为第一底物的阿魏酸。阿魏酸也能够在具有氧化还原酶活性的酶(即辣根过氧化物酶(HRP))和过氧化物化合物(即过氧化氢)存在下交联第二底物的分子，并在单个靶位点处离散地沉积所述第二底物。
在一些其它实施方式中，本发明涉及3’ 3’ - 二氨基联苯胺、阿魏酸的衍生物。在本文中，术语“衍生物”意指衍生自3’ 3’ - 二氨基联苯胺、阿魏酸的化合物或意指如果阿魏酸分子中的一个原子被另一原子或原子团替换，可以设想从3’ 3’ - 二氨基联苯胺、阿魏酸产生的化合物。本发明涉及了满足上述所讨论的本发明第一底物条件的3’ 3’ - 二氨基联苯胺、阿魏酸的衍生物。第一底物在水介质(i)和/或水介质(ii)中的量可以是约0. 05mM至约2mM，取决于代表第一底物的化合物的结构。通常，Rl为乙烯基或乙烯基衍生物的式(I)化合物比其中Rl是芳基或其衍生物的化合物以更高的量使用。因此，当DAB在水溶液(ii)中的量少于ImM，优选地在0. 05mM至ImM的范围内，如0. 05mM和0. 08mM之间，例如约0. 07mM,即从 0. 066mM 至 0. 074mM，或 0. 08mM 至 0. ImM 之间，例如约 0. 09mM，或 0. ImM 和 0. 3mM，例如约0. 15mM,约 0. 2mM,约 0. 25mM,或 0. 3mM 和 0. 6mM 之间，例如约 0. 35mM,约 0. 4mM,约 0. 45mM,约 0. 5mM,约 0. 55mM,或 0. 6mM 和 ImM 之间，例如约 0. 7mM,约 0. 75mM,约 0. 8mM, 0. 8mM 和 ImM之间时，DAB作为本发明的第一底物。惊奇地发现，当DAB以靠后的量存在时，可以形成第二底物的离散圆形沉积物，其直径大于0. 4微米，约I微米、I. 5微米、2微米或更大，例如约3或4微米。为了产生这样的第二底物沉积物，作为第一底物的阿魏酸可以在水介质(ii)中以约ImM和约2mM之间，如例如约I. 5mM的量存在。第二底物根据本发明，本发明酶的第二底物(这里也称为“第二底物”)是偶联物分子，其含有能够作为所述酶的底物的至少两种化合物和可检测标记物，其中所述可检测标记物选自荧光性、发光性、放射性或生色性物质或特异性结合对的成员。在一些优选的实施方式中，本发明涉及一大组偶联物分子作为第二底物，它们共有以下特性I.所述偶联物分子是水溶性分子，其含有能够作为本发明的酶的底物的两种或更多物质，优选地作为HRP的底物，和一种或多种标记物，其中所述底物和标记物通过水溶性交联剂化合物(以后称为“交联剂”)连接到一起；2.酶底物部分“浓集”在所述分子的一部分中的所述偶联物分子内，并且标记物“浓集”在所述分子的另一部分中，其中该标记物与底物相距大约30个或更多个连续互连的原子，即分隔大约2. 5nm或更多，优选多于3nm ；
3.酶底物彼此以少于2. 5nm的距离分隔，例如在偶联物分子中以少于30个或更少互连的碳或杂原子(如碳、氮、硫和/或氧原子)，优选地不超过5-20个原子分隔；4.交联剂是含有至少30个连续互连原子的化合物；5.在环境中不存在具有氧化还原酶活性的酶时，偶联物不从包含过氧化物化合物和本发明第一底物的水溶液(ii)中沉淀；6.在环境中存在具有氧化还原酶活性的酶但不含有所述酶的第一底物时，偶联物不从包含过氧化物化合物的水溶液(ii)中沉淀；7.在环境中存在所述酶的情况下，偶联物从包含过氧化物化合物和具有氧化还原酶活性的本发明酶的第一底物的水溶液Qi)沉淀。第二底物的沉积物可以通过目视手段可直接检测，因为在一些实施方式中，它们可以含有生色性、荧光性或发光性标记物。在其它实施方式中，沉淀的第二底物可以在沉积 可可见到之后的步骤中“染色”。在两种情况下，第二底物的沉积物将向观察者“报告”本发明的单个靶位点存在于环境中。本发明的第二底物的分子因此可互换地称为“报告子”。下文以及实施例中将详细说明第二底物分子的非限定性实施方式。在一个实施方式中，本发明涉及第二底物，其是含有以下物质的水溶性偶联物分子(i) 一种或多种可检测物质(可互换地称为“标记物”)(ii)能够作为本发明的酶的底物的至少两种物质，以及(iii)交联剂其中所述交联剂是含有至少一条由至少30个连续互连原子组成的直链的化合物，所述直链含有至少两个分支点，其中所述分支点分隔至少30个连续相接原子的分子距离；其中标记物(i)和氧化还原酶底物的部分(ii)与交联剂在其两个分支点处连接，其中所述所述分支点分隔至少30个连续相接原子的距离，并且其中任何两个相邻的酶底物彼此分隔少于30个连续互连原子的分子距离。术语“可检测物质”意指该物质能够释放待通过视觉手段检测的可检测生色、荧光、发光或放射信号，或它可以利用其特异性结合配偶物检测，例如抗体、核酸序列、核序列类似物序列、半抗原、抗原、受体、受体配体、酶等。在一些实施方式中，本发明的水溶性偶联物分子可以另外含有可增强其特性的部分，例如改善其作为标记物或酶底物的能力，或提高/降低其水溶解性。在一个实施方式中，本发明的偶联物分子可以选自一组式(II)的化合物(Y) n-L- (Z) m,其中Y是能够作为具有氧化还原酶活性的酶的底物的部分；Z是可检测标记物；L是交联剂化合物；其中，
n是从2至150的整数，m是从I至150的整数。在一个优选的实施方式中，Y选自以下式(II)的化合物
权利要求
1.一种用于使样品中单个独自靶单位可视化的方法，其中所述靶被固定，包括 a)将含有独自靶单位的群体的样品与ー种或多种结合剂孵育，其中 (1)所述结合剂的至少ー种含有酶； (2)所述结合剂的至少ー种能够与独自单个祀单位直接结合， 并且，用独自单个靶単位的部分亚群体形成一个或更多个离散的单个靶位点，其中每一单个的离散单个靶位点含有所述部分亚群体的ー个独自单个单位与ー种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少ー种含有该酶； c)将(a)的样品在水溶液(i)中孵育，所述水溶液(i)含有量少于2mM的过氧化物化合物， 与(a)的离散单个靶位点结合的所述酶的第一底物，以及， 所述酶的第二底物， 其中所述第一底物是水溶性富电子化合物，其 (3)能够与所述酶反应时产生自由基；并且 (4)能够在所述酶和过氧化物化合物存在时交联所述第二底物分子,从而产生所述第ニ底物的水不溶性聚合产物， 其中，所述第二底物是偶联物分子，其含有适合作为所述酶的底物的至少两种化合物和可检测标记物，其中所述可检测标记物选自荧光性、发光性、放射性或生色性物质以及特异性结合对的成员， 从而在(a)的离散单个靶位点处形成第二底物的离散沉积物，并且使所述(a)的单个靶位点可视化。
2.根据权利要求I所述的方法，其中一种或多种结合剂是特异性结合对的成员。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中所述靶位点用样品中存在的少数单个独自靶单位形成。
4.根据权利要求I或2所述的方法，其中所述靶位点用样品中存在的多数单个独自靶单位形成。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的方法，其中所述酶是具有氧化还原酶活性的酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述酶具有过氧化物酶或酚氧化酶活性。
7.根据权利要求6所述的方法，其中酶是辣根过氧化物酶、大豆过氧化物酶或漆酶，或所述酶的功能性类似物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中具有氧化还原酶活性的酶的第一底物是含有式(I)结构的化合物式⑴
9.根据权利要求I或7所述的方法，其中化合物是3，3’ニ氨基联苯胺或其衍生物。
10.根据权利要求I或7所述的方法，其中化合物是阿魏酸或其衍生物。
11.根据权利要求9所述的方法，其中3，3’ニ氨基联苯胺或其衍生物的量少于ImM。
12.根据上述权利要求中任何一项所述的方法，其中所述偶联物分子含有至少ー种化合物作为具有氧化还原酶活性的酶的底物，所述化合物由式(II)定义
13.根据权利要求12所述的方法，其中至少两种化合物由式(II)所定义。
14.根据权利要求13所述的方法，其中由式(II)所定义的至少两种化合物是相同的化合物。
15.根据权利要求13所述的方法，其中由式(II)所定义的至少两种化合物是不同的化合物。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的方法，其中化合物选自肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、氨基肉桂酸或芥子酸或它们的衍生物。
17.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中偶联物含有至少ー个酪氨酸残基作为酶的底物。
18.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中偶联物中，能够作为与单个靶位点结合的酶的底物的至少两种化合物中，每ー种彼此在偶联物分子中由30个或少于30个连续链接的原子分隔，并且可检测标记物被由30个或多于30个连续连接的原子与任何所述底物分隔。
19.根据权利要求18所述的方法，其中在偶联物分子中将标记物与具有氧化还原酶活性的酶的任何底物分隔的至少30个连续连接的原子含有下式(III)的2到10个重复
20.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中第二底物由相同偶联物分子的群体或不同偶联物分子的群体表示，其中所述偶联物分子是根据权利要求12-19任ー项中所定义的任ー种。
21.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括在步骤(b)前的步骤(b’)，其中将样品在水溶液(ii)中孵育，所述水溶液(ii)是不含有第二底物的水溶液(i)。
22.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括至少ー个洗涤步骤。
23.根据上述权利要求中任ー项的方法，进ー步包括步骤(C)，其中检测(b)的单个靶位点。
24.根据权利要求23的方法，其中步骤(c)包括分步骤 c’)将在(a)的离散单个靶位点处含有第二底物的离散沉积物的(b)的样品与能够特异性结合沉积的第二底物的可检测标记物的结合剂孵育，并形成含有沉积的第二底物的一个或更多个分子和所述结合剂的ー个或多个分子的复合物， (c”)检测在样品(ど)中与第二底物的离散沉积物结合的结合剂，并且从而检测与所述单个靶位点结合的独自单个靶単位。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述结合剂含有酶。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述结合剂含有可检测标记物，可检测标记物选自生色性、荧光性、发光性或放射性物质或特异性结合对的成员。
27.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中在单个靶位点处的第二底物的单个离散沉积物具有圆形，并且在ニ维视野中鉴定为可视清晰点。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述清晰点是直径约为或大于O.4微米的点。
29.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶选自生物学或化学靶分子、粒子、分子复合物或细胞复合物、分子结构或细胞结构、病毒或微生物、或所述靶分子、粒子、复合物、结构、病毒或微生物的片段。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述靶是生物标记。
31.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中独自的靶单位选自独自的单个生物学分子或化学分子、独自的单个粒子、独自的单个分子复合物或细胞复合物、独自的单个分子结构或细胞结构、或独自的单个病毒或微生物，或所述分子、粒子、复合物、结构、病毒或微生物的独自单个片段。
32.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是生物、化学或环境的样品O
33.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是组织学样品。
34.根据权利要求29-33中任一项所述的方法，其中所述靶是蛋白或核酸分子，或其片段或衍生物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述蛋白是细胞膜受体或胞质蛋白或胞质核酸。
36.一种用于检测样品中固定靶的独自单个单位的方法，其中所述靶以宽泛的动态浓度范围存在于样品中，包括 a)将所述样品与ー种或多种结合剂孵育，其中 (1)所述结合剂的至少ー种含有酶； (2)所述结合剂的至少ー种能够与所述独自单个祀单位直接结合， 并且，用独自单个靶単位的第一部分亚群体形成一个或更多个离散的第一靶位点，其中每ー单个离散的第一靶位点含有独自单个单位的所述第一部分亚群体的ー个独自单个単位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少ー种含有具有氧化还原酶活性的酶； b)将(a)的样品与结合于(a)的第一靶位点的酶的第一底物、所述酶的第二底物分子的第一群体和根据权利要求I所述的步骤(b)的过氧化物化合物进行孵育，从而在(a)的第一靶位点处形成第一群体的第二底物分子的离散沉积物； c)将(b)的样品与一定量过氧化氢溶液孵育，所述量足以猝灭与(a)的第一单个靶位点结合的酶的残余活性； d)将样品(C)与ー种或多种结合剂孵育，其中 (1)所述结合剂的至少ー种含有酶； (2)所述结合剂的至少ー种能够与所述独自的靶单位直接結合， 从而，用独自单个靶単位的第二部分亚群体形成一个或更多个离散的第二靶位点，其中每ー单个离散的第二靶位点含有独自单个单位的所述第二部分亚群体的ー个独自単位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少ー种含有该酶； e)将(d)的样品与结合于第二单个靶位点的酶的第一底物、所述酶的第二底物分子的第二群体和根据权利要求I的步骤(b)所述的过氧化物化合物进行孵育，从而在(d)的第ニ靶位点形成第二群体的第二底物分子的离散沉积物； f)检测样品中第一靶位点处的第一群体的第二底物分子的离散沉积物作为第一可视清晰点，从而检测到所述靶的第一群体的ー个或更多个独自单个单位； g)检测样品中第二靶位点处的第二群体的第二底物分子的离散沉积物作为第二可视清晰点，从而检测到所述靶的第二群体的ー个或更多个独自单个单位。
37.根据权利要求36所述的方法，其中步骤(a)和步骤(d)的结合剂是相同的结合剤。
38.根据权利要求36所述的方法，其中步骤(a)和步骤(d)的结合剂是不同的结合剤。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的方法，其中第一群体的第二底物的分子和第ニ群体的第二底物的分子是不同的偶联物分子。
40.一种用于样品中至少两种不同的固定靶的独自单个单位的可视化和检测方法，包括a)将所述样品与一种或多种能够与第一祀结合的结合剂孵育，其中 (1)所述结合剂的至少ー种含有酶； (2)所述结合剂的至少ー种能够与第一独自单个靶単位直接結合， 从而，用第一独自单个靶単位形成一个或更多个离散的第一单个靶位点，其中每ー单个离散的第一靶位点含有第一靶的ー个独自单个单位与一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少ー种含有该酶； b)将(a)的样品与结合于第一单个靶位点的酶的第一底物、所述酶的第二底物分子的第一群体和根据权利要求的步骤(b)所述的过氧化物化合物进行孵育，从而在(a)的第一单个靶位点处形成第一群体的第二底物分子的离散沉积物； c)将(b)的样品与一定量过氧化氢溶液孵育，所述量足以猝灭与(a)的第一单个结合位点结合的酶的残余活性； d)样品(C)与ー种或多能够与第二靶种结合的结合剂孵育，其中 (1)所述结合剂的至少ー种含有酶； (2)所述结合剂的至少ー种能够与第二独自的靶单位直接与结合， 从而，用第二独自单个靶単位形成一个或更多个离散的第二单个靶位点，其中每ー单个离散的第二靶位点含有第二靶的ー个独自単位和一种或多种结合剂的复合物，所述结合剂的至少ー种含有该酶； e)将(d)的样品与结合于第二单个结合位点结合的酶的第一底物、具有氧化还原酶活性的酶的第二底物分子的第二群体和根据权利要求I的步骤(b)所述的过氧化物化合物孵育，从而在(d)的第二靶位点形成第二群体的第二底物分子的离散沉积物； f)检测样品中第一靶位点处的第一群体的第二底物分子的离散沉积物作为第一可视清晰点，从而检测到第一靶的ー个或更多个独自单个单位； g)检测样品中第二靶位点处的第二群体的第二底物分子的离散沉积物作为第二可视清晰点，从而检测到第二靶的ー个或更多个独自单个单位。
41.根据权利要求40所述的方法，其中至少两种靶是不同的生物分子。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述靶的至少两者是不同的核酸序列或不同的蛋白质。
43.根据权利要求40所述的方法，其中所述靶的至少ー种是核酸并且至少另ー种是蛋白质。
44.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中第一群体的第二底物分子和第二群体的第二底物是不同的第二底物分子。
45.根据权利要求36-44中任一项所述的方法,其中第二底物分子选自权利要求12-19中任ー项所定义的化合物，且第一底物分子选自权利要求8-10中任ー项所定义的化合物。
46.根据权利要求36-44中任一项所述的方法，其中所述方法包括至少ー个额外步骤。
47.根据权利要求36-46中任一项所述的方法，其中样品是组织学样品。
48.根据上述权利要求中任ー项的方法，在所限定的任何步骤前含有一个或更多步骤。
49.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法在所限定的任何步骤之后含有一个或更多步骤。
50.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中至少ー个步骤是自动的，或其中该方法进ー步包括至少ー个自动步骤。
51.一种用于定量评价样品中固定靶的方法，包括 a)根据上述权利要求中任一项所述的方法处理样品； b)定量样品中的可视清晰点；以及 c)评价样品中靶的量。
52.根据权利要求51所述的方法，其中手工或或自动定量所述清晰点。
53.根据权利要求51或52所述的方法，其中将所述靶的量相对地评价为每一參照标记、样品体积或样品面积的靶量。
54.ー种用于诊断患者中疾病的方法，包括根据权利要求1-53中任一项所述的方法处理从所述患者获取的生物样品的步骤。
55.一种用于在患者中评估治疗性方法的功效的方法，包括根据权利要求1-53中任一项所述的方法处理从患者获取的生物样品的步骤。
56.ー种用于预测患者中疾病发展风险、或从疾病中康复的可能性或不可能性的方法，包括根据权利要求1-53中任一项所述的方法处理从患者获取的生物样品的步骤。
57.ー种测定法，包括根据权利要求1-53中任ー项的方法检测单个靶单位的步骤。
全文摘要
本发明涉及免疫化学地可视化和定量样品中的单个靶实体，如单个分子、单个分子结构、单个粒子等，其中所述单个实体被固定。具体而言，本发明涉及了用于可视化和定量生物靶或化学靶的单个单元的方法，尤其涉及免疫化学可视化组织学样品中的生物靶的单个分子。本发明的方法包括由具有氧化还原酶活性的酶所介导在样品的单个靶位点处形成可检测分子的离散沉积物的步骤，其中单个靶位点包含单个靶单位。本发明还涉及包括本发明可视化和定量方法的测定法。该方法应用报道分子沉积技术(卡)和至少两种不同的底物，其中一种是水溶性偶联物，其包含能够作为酶的底物的两种化合物和可检测标记物。
文档编号G01N33/543GK102713626SQ201080058058
公开日2012年10月3日 申请日期2010年10月15日 优先权日2009年10月20日
发明者J·洛泽 申请人:丹麦达科有限公司