专利名称：一种胶乳颗粒增强型中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种胶乳颗粒增强型中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒。
背景技术：
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是1993年在中性粒细胞内首先被发现的，也叫lipoCalin2，是lipocalin家族的一个新成员，其结构和功能已经引起国内外的关注。NGAL蛋白广泛分布在人体组织细胞中，如支气管、胃、小肠、胰腺、肾、前列腺、胸腺等。 NGAL蛋白具有运输疏水性小分子、调节明胶酶B(MMP-9)活性等功能，并可能参与免疫炎症反应以及肿瘤的发生发展，特别是肿瘤的浸润转移等过程。研究表明，NGAL基因可能是人类的一种新的癌基因或促癌基因。通常50%以上重症监护的病人都有不同程度的肾损伤，同时，发生急性肾损伤也是急性病病患死亡率明显升高的原因之一。在过去的40年中，对急性肾衰竭的预测并没有得到明显发展，目前的诊断方法只能针对肾衰竭中后期。最近研究发现，在发生局部出血或肾损伤时，NGAL的含量水平会明显升高。通常在肾损伤发生后1-2小时内，就可检测到尿液和血液中NGAL水平升高。因此，使用NGAL ELISA检测试剂盒检测血清或尿液中NAGL的含量，可以在肾衰竭早期根据NAGL含量变化做出诊断，从而解决传统方法不能检测早期肾损伤的难题，将治疗时间提前。近年来国内外的研究表明，NGAL蛋白在多种疾病发病过程中具有特异性表达变化的特点，使得NGAL成为检测疾病的生物标志物。关于NGAL在临床上的应用，目前主要有丹麦Bioporto诊断公司开发了 NGAL快速诊断ELISA检测试剂盒，主要运用于急性肾功能衰竭(APF)的早期诊断。Bioporto诊断公司的NGAL试剂盒应用的是竞争酶联免疫法，相对本研究的胶乳增强免疫比浊检测法来说，耗时长，且不能实现自动化。而采用传统免疫比浊法检测NGAL含量时，为了使抗原抗体反应产生的复合物改变溶液的浊度以达到仪器的检测限，要求待检测样本中的NGAL需达到一定浓度。而尿液或血浆中NGAL浓度有限，导致了传统免疫比浊法检测结果的灵敏度和准确性不高。本项目的创新性在于将胶乳与NGAL的多克隆抗体在一定条件下偶联，形成抗体-胶乳的复合物，当偶联了胶乳的抗体与较低浓度的NGAL发生特异性的免疫反应时，能显著改变溶液的浊度，使得检测结果的灵敏度更高， 背景更低，且能在几分钟内完成检测。胶乳增强免疫透射比浊法的基本原理是样品中的NGAL与试剂盒中的胶乳颗粒增强的抗NGAL抗体试剂发生抗原-抗体反应，使反应液浊度增加，并在一定范围内反应液浊度与所加的抗原的量呈正相关，在M6nm波长处测定反应液吸光度变化，其变化程度与样本中的NGAL的含量呈正比
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种特异的高灵敏度的测定NGAL含量的胶乳颗粒增强型NGAL试剂盒。另外，本发明的目的还在于提供使用本发明胶乳颗粒增强型免疫测定试剂盒测定NGAL含量的方法。本发明提供以下的技术方案。根据权利要求1-5记载的胶乳颗粒增强型免疫测定试剂盒，其用于测定NGAL的含量，所述试剂盒包含试剂Rl和R2，而且任选地含有中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品。所述的试剂Rl为含有多聚物的缓冲液；所述的试剂R2为结合抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液，胶乳颗粒直径我们采用了 200nm胶乳进行抗体的交联，交联方法选择化学交联法。本发明的方法灵敏度高，能够检测较低水平(约 0. 00363mg/L)的NGAL，具有很高的临床实用价值。另外，本发明的试剂盒为液体双试剂，因此具有特异性好，灵敏度高，准确性好及抗干扰能力强等优点，可用于检测人尿液、血清或血浆中NGAL的浓度，适用于临床全自动生化分析仪。
图1显示6种不同含量的NGAL参考标准的标准曲线，每个点代表不同含量的NGAL 参考标准，其中，χ轴表示NGAL的含量，y轴表示吸光度。图2显示本发明的试剂和对照试剂(某国际知名公司NGAL试剂盒)的相关性。图中的X、Y轴均为测定值(NGAL含量mg/L)。
具体实施例方式实施例1一种胶乳颗粒增强型中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制备方法。1.本发明试剂Rl的制备试剂Rl为IOOmM Tris缓冲液(PH7. 2)，向该缓冲液中分别添加TritonxlOO, PEG6000，终浓度为 0. 5%。2.本发明试剂R2的制备采用化学交联法进行抗体和胶乳的连接。步骤如下(1) EDC 和硫代 NHS 活化 15min (PB Buffer)，振荡，20000rpm 离心 30min ；(2)弃上清后用PB复溶，加抗体室温振荡反应2小时；(3)加等量0. IM PH = 8. 0的甘氨酸缓冲液和10 % BSA使终浓度为1 %，反应半小时，OOOOrpm 离心 30min ；(4)用Rl试剂的缓冲液复溶。实施例2工作曲线测定本发明的用量本发明试剂Rl和R2用量分别为200 μ 1和50 μ 1，样本用量为 3μ 1。本发明采用终点法进行测定200 μ 1 Rl加入3μ 1样本，于37°C 5min后加入 5(^1试剂1 2即开始读点，5min后再次读点，然后计算吸光度算差值。试剂盒测定使用迈瑞BS300全自动生化仪，检测主波长为546nm，副波长为670nm。
制作本发明的标准曲线采用本发明的标准品(选择6点校准，校准品NGAL含量分别为0. 0,0. 05,0. 1,0. 2,0. 4,0. 8mg/ml)，按照上述测定步骤测得本发明NGAL标准品的标准曲线(如图1所示)。图1中曲线上的每个点代表一个含量的标准品。其中χ轴表示 NGAL的含量，y轴表示吸光度。实施例3准确性测定相关性实验使用本发明的试剂和对照试剂(某国际知名公司NGAL试剂盒)。采用迈瑞BS300全自动生化分析仪对30份人血清进行测定，对测定值进行相关性分析。测定结果见图2，图中的X、Y轴均为测定值(NGAL含量mg/L)。结果显示本发明和对照试剂的相关性很高。实施例4灵敏度测定检测20次生理盐水和0. lmg/L的样本，记录吸光度数值，计算平均值和标准偏差， 算出最低检出限(LLD) = l+3xS。分析灵敏度=样本浓度X最低检出限/吸光度变化均值。测定的灵敏度实验数据如表1所示，Δ A表示吸光度的差值。结果显示使用200nm 粒径胶乳为材料的试剂盒分析灵敏度达到0. 00363mg/Lo表 权利要求
1.一种胶乳颗粒增强型中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒。
2.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，它包含试剂Rl和R2，而且任选地含有中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白标准品，所述的试剂Rl为含有多聚物的缓冲液；所述的试剂R2为结合抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液，胶乳颗粒直径为30-220nm。
3.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，它是基于免疫比浊法定量检测样本中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量的试剂品.ο
4.根据权利要求1和2所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂Rl，R2的缓冲液是Tris缓冲液，缓冲液PH值为7. 0-8. 5 ；所述的多聚物包括TritonX，PEG6000等多聚物，其含量按体积比为0. 2-2. 0%。
5.据权利要求1和2所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，在试剂R2中，结合有抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的苯聚乙烯胶乳溶液的含量为0. 2-2. Omg/ml。
6.根据权利要求1和2所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，试剂R2中胶乳与抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的包被实验采用物理吸附法或化学交联法制备。
7.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒具有特异性高、灵敏度高及抗干扰力强等优异性能。
全文摘要
本发明提供一种胶乳颗粒增强型中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒及其制备方法。使用本发明的试剂盒能检测人尿液、血清或血浆中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量。所述的胶乳颗粒增强型中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其胶乳颗粒直径为30-220nm。本发明的试剂盒具有特异性好，灵敏度高，及抗干扰能力强等优点。
文档编号G01N21/31GK102253217SQ201110086369
公开日2011年11月23日 申请日期2011年4月7日 优先权日2011年4月7日
发明者华权高, 周*, 沈鹤霄, 许可 申请人:武汉生之源生物科技有限公司