专利名称：荧光强度校正方法和荧光强度计算装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及荧光强度校正方法和荧光强度计算装置。更具体地说，本发明涉及用于精确计算从对微粒进行多重标记的多个荧光染料中的每一种发出的荧光的强度的荧光强度校正方法等。
背景技术：
已存在根据测定微粒特性的现有技术的装置(例如，流式细胞仪)，该装置通过使用荧光染料标记微粒(例如细胞等)、通过激光束照射激发这些荧光染料、并且测定从这些荧光染料发出的荧光强度和图案，来测定微粒的特性。近年来，已经开始进行多色测定以更加细致地分析细胞等的特性，在该多色测定中，使用多个荧光染料标记微粒，并且使用具有不同的输入波段的多种光检测器(PD、PMT等)测定从各荧光染料发出的光。利用多色测定，通过根据使用的荧光染料的荧光波长选择在光检测器侧的滤光器进行荧光的检测。另一方面，目前使用的荧光染料(例如FITC、PE(藻红蛋白)、APC(别藻蓝蛋白) 等)在荧光光谱内具有相互重叠的波段。因此，如果将这些荧光染料组合进行多色测定，那么即使通过滤光器将从荧光染料发出的荧光分成各波段，从非目标荧光染料发出的荧光也可能泄漏进光检测器。如果发生荧光的泄漏，在检测器处测定的荧光强度和来自目标荧光染料的真实荧光强度之间将存在差异，导致测定误差。进行荧光校正，其中，从在光检测器处测定的荧光强度减去与泄漏相等的荧光强度，以校正测定误差。荧光校正涉及对脉冲施加电或数学校正，以使得在光检测器处测定的荧光强度是来自目标荧光染料的真实荧光强度。正使用这样的技术作为数学地执行荧光校正的方法，其中，通过将在光检测器处测定的荧光强度(检测值)表示为矢量、并且将预设的泄漏矩阵的逆矩阵应用至这些矢量， 计算来自目标荧光染料的真实荧光强度(参见
图12和图13，以及日本未审专利申请公开第2003-83894号)。通过分析利用荧光染料单独标记的微粒的荧光波长分布建立该泄漏矩阵，其中，荧光染料的荧光波长排列成列向量。泄漏矩阵的逆矩阵也被称为“校正矩阵”。 图12和图13示出了使用五个荧光染料(FITC、ΡΕ、E⑶、PC5、PC7)和五个光检测器进行五色测定的实例。
发明内容
对于利用校正矩阵的荧光校正方法，存在校正后的荧光强度是负值的情况。这是由于包括在各个光检测器的检测值中的噪声影响矩阵计算导致的。然而，在实际中，荧光染料产生的荧光强度是负值是不可能的。此外，同时，被计算成负值的来自特定荧光染料的荧光强度意味着在其他的荧光染料的荧光强度的计算值中在正方向上存在误差。如果在要分析的微粒群内存在子群(关于该子群，特定的荧光染料的荧光强度表现为负值)，该子群没有被绘制在二维相关图(细胞直方图，cytogram)上，其中该荧光染料的荧光强度被沿着对数轴绘制(对数标度)。因此，用户可能收到在二维相关图上绘制的群的数目小于实际的错觉。已经发现，在使用多个光检测器对通过多个荧光染料标记的微粒进行的多色测定的情况下，期望提供一种准确计算荧光染料产生的荧光强度并且将这些呈现给用户的技术。根据本发明的实施方式，一种荧光强度校正方法包括利用具有不同输入波段的光检测器，接收通过对微粒照射光而被激发的荧光染料所发出的荧光，这些微粒被具有重叠荧光波长的多个荧光染料多重标记；收集光检测器的检测值，得到测定光谱；并且通过从各荧光染料单独标记的微粒得到的单染色光谱的线性和对测定光谱进行近似；其中，使用受限最小二乘法进行利用单染色光谱的线性和的测定光谱的近似。可通过求出使下面的表达式(1)中所示的评价函数满足下面的表达式( 并且为最小值的参数= 1至Μ)来计算各荧光染料发出的荧光强度。通过进行提供有表达式 (2)的约束条件的校正计算，可以解决由于荧光染料产生的荧光强度被计算为负值导致的测定误差，以及在二维相关图(细胞直方图)上的群减少的问题。
权利要求
1.一种荧光强度校正方法，包括利用具有不同输入波段的光检测器，接收通过对微粒照射光而被激发的荧光染料所发出的荧光，所述微粒被具有重叠荧光波长的多个荧光染料多重标记； 收集所述光检测器的检测值，得到测定光谱；以及通过从各荧光染料单独标记的微粒得到的单染色光谱的线性和对所述测定光谱进行近似；其中，使用受限最小二乘法进行利用所述单染色光谱的线性和的所述测定光谱的近似。
2.根据权利要求1所述的荧光强度校正方法，其中，通过求出使下面的表达式(1)所示的评价函数满足下面的表达式O)并且为最小值的参数\而计算出各荧光染料发出的荧光强度，其中j = 1至M， 其中，Sij表示在第j个荧光染料的单染色光谱中的第i个光检测器的检测值，Pi表示测定光谱中第i个光检测器的检测值，σ i表示关于第i个光检测器的检测值的权数的倒数，并且Uj表示要计算的各荧光染料的荧光强度的下限值。
3.根据权利要求2所述的荧光强度校正方法，其中，通过解下面的表达式C3)到(5)的二次规划问题求出所述参数 其中j = 1至M， 最小化Il Sx-P Il 2…(3) 其中满足Ax彡b…^) χ 彡 0 ... (5)其中，S表示以Sij作为元素的NXM阶矩阵，χ表示以\作为元素的M阶矩阵，ρ表示以Pi作为元素的N阶矢量，A被设置为MXM阶矩阵，b被设置为MX 1阶矩阵，并且U1到仏表示所述下限值。
4.根据权利要求3所述的荧光强度校正方法，其中，在所述表达式O)中，从通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照得到的各个所述光检测器的检测值的平均值得到的第j个荧光染料的无染色平均值\被用作所述下限值Uj。
5.根据权利要求3所述的荧光强度校正方法，其中，在所述表达式O)中，根据第j个荧光染料的无染色概率密度函数Fj(Uj)产生的随机数被用作所述下限值化，所述无染色概率密度函数h (Uj)从通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照得到的各个所述光检测器的检测值的概率密度函数得到。
6.根据权利要求3所述的荧光强度校正方法，其中，在所述表达式O)中，从通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照射得到的各个所述光检测器的检测值的平均值和离散度求出第j个荧光染料的无染色平均值、和无染色标准差Ρ ρ并且根据表达式(9) 的无染色概率密度函数。(Uj)产生的随机数被用作所述下限值
7.根据权利要求2所述的荧光强度校正方法，其中，通过解下面的表达式(10)和(11) 的二次规划问题求出所述参数\，其中j = 1至Μ，最小化 Il Sx-P Il 2 …(10) 其中满足χ彡0 - (11)其中，S表示以Sij作为元素的NXM阶矩阵，χ表示以\作为元素的M阶矩阵，并且ρ 表示以Pi作为元素的N阶矢量。
8.根据权利要求2所述的荧光强度校正方法，其中，通过解下面的表达式(1 和(13) 的二次规划问题，并且执行下面的表达式(14)来求出所述参数\，其中j = 1至M，最小化 Il -(P-U) Il2 - (12) 其中满足χ' ^O - (13) x = x' +U ...(14)其中，S表示以Sij作为元素的NXM阶矩阵，χ表示以\作为元素的M阶矩阵，ρ表示以Pi作为元素的N阶矢量，u表示将通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照射得到的第i个光检测器的检测值的平均值Vi作为元素的N阶矢量，以及U表示将从平均值 Vi得到的第j个荧光染料的无染色平均值\作为元素的M阶矢量。
9.根据权利要求2所述的荧光强度校正方法，其中，通过解下面的表达式(1 和(16) 的二次规划问题，并且执行下面的表达式(17)来求出所述参数\，其中j = 1至M，最小化 Il -(P-U) Il2 - (15) 其中满足χ' ^O - (16) x = x' +U ...(17)其中，S表示以Sij作为元素的NXM阶矩阵，χ表示以\作为元素的M阶矩阵，ρ表示以Pi作为元素的N阶矢量，u表示将根据通过对未使用第j个荧光染料标记的微粒进行光照得到的第i个光检测器的检测值的概率密度函数fi (Ui)而产生的随机数Ui作为元素的N 阶矢量，以及U表示将根据从概率密度函数(Ui)得到的第j个荧光染料的无染色概率密度函数Fi (Ui)而产生的随机数Uj作为元素的M阶矢量。
10.根据权利要求2所述的荧光强度校正方法，其中，通过解下面的表达式00)和 (21)的二次规划问题，并且执行下面的表达式0 求出所述参数\，其中j = 1至M，最
11. 一种荧光强度计算装置，包括 测定单元，被配置为利用具有不同输入波段的光检测器，接收通过对微粒照射光而被激发的荧光染料所发出的荧光，所述微粒被具有重叠荧光波长的多个荧光染料多重标记， 收集所述光检测器的检测值，并且得到测定光谱；以及计算单元，被配置为通过从各荧光染料单独标记的微粒得到的单染色光谱的线性和对所述测定光谱进行近似；其中，所述计算单元使用受限最小二乘法进行利用所述单染色光谱的线性和的所述测定光谱的近似。
全文摘要
本发明提供了荧光强度校正方法和荧光强度计算装置，该荧光强度校正方法包括利用具有不同输入波段的光检测器，接收通过对微粒照射光而被激发的荧光染料所发出的荧光，这些微粒被具有重叠荧光波长的多个荧光染料多重标记；收集光检测器的检测值，得到测定光谱；并且通过从各荧光染料单独标记的微粒得到的单染色光谱的线性和对测定光谱进行近似；其中，使用受限最小二乘法进行利用单染色光谱的线性和的测定光谱的近似。
文档编号G01N21/64GK102313724SQ20111018532
公开日2012年1月11日 申请日期2011年7月1日 优先权日2010年7月9日
发明者加藤泰信, 酒井启嗣 申请人:索尼公司