专利名称：一种感染细菌的鉴定技术和检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及细菌鉴定技术领域，具体涉及一种利用锁定核酸荧光定量PCR法进行感染细菌的鉴定技术和检测试剂盒。
背景技术：
感染性疾病目前仍是危害人类健康的最主要的一种疾病，各种感染性疾病许多都是由病原微生物引起的，其中由细菌和病毒引起的疾病是临床最常见的疾病形式。鉴定感染源和致病因子可为疾病提供明确的诊断，并指导临床用药。准确及时的细菌学报告，可以减少病人的住院时间，降低病死率及病人经济负担。目前细菌学检测主要是通过基于培养的菌种鉴定实验，包括自动化细菌鉴定仪及各种生理生化实验。但由于目前的方法一般是基于培养技术，因此耗时较长，约2-3天才能获得结果，而且灵敏度较差，因此，临床亟需快速灵敏的实验方法来进行细菌鉴定，特别是对于危重疾病，例如菌血症等，快速准确灵敏的方法可指导临床治疗方案，以控制细菌的传播和扩散。
发明内容
本发明的目的是提供一种临床常见感染细菌的鉴定技术和检测试剂盒，它鉴定快速准确，灵敏度好，可指导临床快速控制细菌的传播和扩散，提高临床医师用药水平并保证病人的安全。为了解决背景技术所存在的问题，本发明采取以下技术方案感染细菌的鉴定方法为利用特异引物对进行实时荧光PCR，扩增待测细菌特异基因，扩增产物与锁定核酸探针进行杂交，检测荧光信号，确定待测细菌特异基因。所述的扩增待测细菌特异基因的引物对的正向引物和反向引物的大小均为15-50 个核苷酸。所述的鉴定细菌锁定核酸探针的大小均为8-20个核苷酸。所述探针序列5’端连接上荧光素，3’端连接上萃灭剂。所述的荧光素为一种荧光报告基团，包括FAM、TET、J0E、VIC、HEX、R0X、TAMPA、CY3、 CY5、CY5. 5、Red 640、CAL RecUFITC。所述的萃灭剂是可以萃灭荧光的基团，包括TAMRA、DABCYL、NFQ。所述的检测试剂盒包括扩增细菌特异基因及特异基因的正反向引物对、与细菌特异基因及特异基因的扩增产物杂交的锁定核酸探针、进行PCR反应和分子杂交的反应液。本发明具有以下有益效果它鉴定快速准确，灵敏度好，可指导临床快速控制细菌的传播和扩散，提高临床医师用药水平并保证病人的安全。
图1为本发明的细菌鉴定试剂盒包括的引物的结构示意图2为本发明的细菌鉴定试剂盒包括的锁定核酸探针的结构示意图；图3为多重不对称PCR扩增热循环程序的结构示意图；图4为实施例中不同浓度大肠杆菌扩增标准曲线图；图5为实施例中大肠杆菌扩增曲线图。
具体实施例方式参照图1-3，本具体实施方式
采取以下技术方案它的鉴定方法为利用特异引物对进行实时荧光PCR，扩增待测细菌特异基因，扩增产物与锁定核酸探针进行杂交，检测荧光信号，确定待测细菌特异基因。所述的扩增待测细菌特异基因的引物对的正向引物和反向引物的大小均为15-50 个核苷酸。所述的鉴定细菌锁定核酸探针的大小均为8-20个核苷酸。所述探针序列5’端连接上荧光素，3’端连接上萃灭剂。所述的荧光素为一种荧光报告基团，包括FAM、TET、J0E、VIC、HEX、R0X、TAMPA、CY3、 CY5、CY5. 5、Red 640、CAL RecUFITC。所述的萃灭剂是可以萃灭荧光的基团，包括TAMPA、DABCYL、NFQ。所述的检测试剂盒包括扩增细菌特异基因及特异基因的正反向引物对、与细菌特异基因及特异基因的扩增产物杂交的锁定核酸探针、进行PCR反应和分子杂交的反应液。本具体实施方式
鉴定快速准确，灵敏度好，可指导临床快速控制细菌的传播和扩散，提高临床医师用药水平并保证病人的安全。实施例1、本试剂盒检测细菌的目标包括大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、粪肠球菌及屎肠球菌，(引物和探针的详细信息如图1，图2)2、细菌培养与核酸提取，使用大肠杆菌标准菌株ATCC 25922进行试验，在超净工作台内将细菌划线接种于LB培养基平板以分离单菌落，将平板在孵箱中倒置，35°C孵育 Mh，从培养细菌的LB平板上沾取一单菌落，加到100 μ 1 IXTE中。然后将离心管95°C水浴5min，置-20°C备用。3、核酸扩增，荧光PCR反应体系的组成如下=IXMasterMix(Roche)；用图1中引物1-16和图2中锁定核酸探针17-M分别配制8个反应体系，引物对的浓度分别为 0.41111101/1，探针的浓度为0.21111101/1;加入1111^菌液作为模板。反应总体积为10 μ L。 同时，将菌液10倍梯度稀释后作为模板进行大肠杆菌特异基因phoA的扩增反应，确定检测灵敏度，PCR在7900ΗΤ (ABI)热循环仪上进行，采用图3的PCR扩增热循环程序。结果表明，只有大肠杆菌特异基因PhoA产生特异扩增曲线，Ct值为27. 3，其他细菌的特异基因均没有扩增，因此将ATCC 25922鉴定为大肠杆菌，与实际结果相符合。(见图 4-5)。
权利要求
1.一种感染细菌的鉴定技术和检测试剂盒，其特征在于感染细菌的鉴定方法为利用特异引物对进行实时荧光PCR，扩增待测细菌特异基因，扩增产物与锁定核酸探针进行杂交，检测荧光信号，确定待测细菌特异基因。
2.根据权利要求1所述的一种感染细菌的鉴定技术和检测试剂盒，其特征在于所述的检测试剂盒包括扩增细菌特异基因及特异基因的正反向引物对、与细菌特异基因及特异基因的扩增产物杂交的锁定核酸探针、进行PCR反应和分子杂交的反应液。
3.根据权利要求1所述的一种感染细菌的鉴定技术和检测试剂盒，其特征在于所述的扩增待测细菌特异基因的引物对的正向引物和反向引物的大小均为15-50个核苷酸。
4.根据权利要求1所述的一种感染细菌的鉴定技术和检测试剂盒，其特征在于所述的鉴定细菌锁定核酸探针的大小均为8-20个核苷酸。
5.根据权利要求1所述的一种感染细菌的鉴定技术和检测试剂盒，其特征在于所述的探针序列5’端连接上荧光素，3’端连接上萃灭剂。
6.根据权利要求5所述的一种感染细菌的鉴定技术和检测试剂盒，其特征在于所述的荧光素为一种荧光报告基团，包括 FAM、ΤΕΤ、JOE、VIC、HEX、ROX, TAMRA, CY3、CY5、CY5. 5、Red 640、CAL Red,FITCo
7.根据权利要求5所述的一种感染细菌的鉴定技术和检测试剂盒，其特征在于所述的萃灭剂是萃灭荧光的基团，包括TAMRA、DABCYL、NFQ。
全文摘要
一种感染细菌的鉴定技术和检测试剂盒，它涉及细菌鉴定技术领域，它的感染细菌的鉴定方法为利用特异引物对进行实时荧光PCR，扩增待测细菌特异基因，扩增产物与锁定核酸探针进行杂交，检测荧光信号，确定待测细菌特异基因。它鉴定的快速准确，灵敏度好，可快速控制细菌的传播和扩散，保证病人的安全。
文档编号G01N21/64GK102321740SQ20111022063
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月3日 优先权日2011年8月3日
发明者李全贞, 祝令香 申请人:河北省健海生物芯片技术有限责任公司