专利名称：一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种纺锤体检验点抑制物，尤其是涉及一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法。
背景技术：
在真核生物中，纺锤体检验点(The spindle checkpoint)是保证细胞分裂过程中染色体正确分离的重要监控机制之一。细胞纺锤体检验点功能被削弱是肿瘤细胞的一个重要特征。然而现有研究表明，完全抑制细胞的纺锤体检验点却可以诱导细胞死亡。由于正常细胞与肿瘤细胞在纺锤体检验点功能上的差异使得纺锤体检验点成为目前抗肿瘤药物研发的靴点之一。国外有实验室([l]DeMoe JH,Santaguida S,Daum JR,Musacchio A,Gorbsky GJ :A high throughput, whole cell screen for small molecule inhibitors of the mitotic spindle checkpoint identifies 0M137, a novel Aurora kinase inhibitor. Cancer Res 2009 ；69 :1509-1516 ； [2]Stolz A, Vogel C, Schneider V,Ertych N, Kienitz A, Yu H, et al !Pharmacologic abrogation of the mitotic spindle checkpoint by an indolocarbazoIe discovered by cellular screening efficiently kills cancer cells. Cancer Res 2009 ；69 :3874-3883)建立了高通量的纺锤体检验点抑制物的筛选方法并正在进行相关化合物的筛选，但这些筛选方法存在着操作步骤繁琐、成本高及需要借助特殊仪器设备等缺点，限制了这些筛选方法的广泛应用，国内目前还未见有关建立纺锤体检验点抑制物筛选方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可供高通量的筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法。本发明包括以下步骤1)将Hela细胞置于细胞培养皿上在培养液中培养；在步骤1)中，所述培养液可采用DMEM细胞培养液，所述培养可在37°C，5% CO2的条件下培养。2)当细胞密度达到80% 90%时，加入诺考达唑(Nocodazole)处理，收集从培养板上脱落的有丝分裂细胞并将其转移到96孔板或384孔板上；在步骤2)中，所述处理的时间可为12 16h，所述加入诺考达唑的终浓度可为 50 200ng/ml ；所述96孔板或384孔板上的细胞密度为10，000 20，000个/孔。3)随后加入待测化合物，阴性对照组加入细胞培养液，培养；在步骤幻中，所述加入待测化合物的量，按体积比，培养液待测化合物为 1000 1 ；可根据化合物文库及实验目的自己设计化合物终浓度(根据具体药物种类选择具体浓度)，所述细胞培养液可为等量的DMEM细胞培养液，所述培养可在37°C下细胞培养箱中培养4 他。4)洗去未贴壁细胞，加入细胞培养液反应；
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在步骤4)中，所述洗去未贴壁细胞可用PBS洗去未贴壁细胞，最好重复2 3次； 所述细胞培养液可采用含 0. 5mg/ml MTT ((3- (4，5-cimethylthiazol_2-yl) -2，5-diphenyl tetrazolium Bromide ；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝) 的细胞培养液；所述细胞培养液的加入量可为待测化合物的10 20倍，所述反应的温度可为37°C，反应的时间可为2 4h。5)去掉细胞培养液，加入二甲基亚砜(DMS0)，溶解步骤4)中形成的甲瓒结晶，再检测0D570读值；在步骤幻中，所述加入二甲基亚砜的量可为每孔加入100μ 1 ；所述检测可采用酶标仪检测。6)当待测化合物所对应孔的0D570与阴性对照孔的0D570之间比值大于2时，该待测化合物可被认为是潜在的纺锤体检验点抑制物；7)进行第二轮筛选，以排除潜在的纺锤体检验点抑制物中的假阳性，其具体方法是重复上述步骤1)和2)，并在原步骤2)中多加入终浓度为10 20uM的MG132 ；8)加入从步骤6)中筛选出来的潜在纺锤体检验点抑制物，阴性对照孔加入等量的DMEM细胞培养液培养；在步骤8)中，所述加入从步骤6)中筛选出来的潜在纺锤体检验点抑制物的量可与步骤幻所加入的待测化合物的量相同；所述培养，可在37°C下细胞培养箱中培养4 6h。9)重复上述步骤4)和5)；10)潜在的纺锤体检验点抑制物所对应孔的0D570与阴性对照孔的0D570之间比值在0. 6 12之间，该化合物可被认为是纺锤体检验点抑制物，可被用于做进一步的分析。本发明以Hela细胞为模型，根据纺锤体检验点在细胞分裂中的作用机制，并利用有丝分裂细胞与间期细胞有着不同粘着力的特性，充分利用MTT的实验原理，并借助一个已知的阳性纺锤体检验点抑制物(12W)验证这个筛选方法的可靠性，从而建立了一个灵敏、易于操作、低成本的可用于高通量筛选纺锤体检验点抑制物的方法。在本发明中，利用细胞处在细胞周期不同时期(有丝分裂期和间期)时细胞形态及与培养皿底部贴附能力的差异。很多体外培养的细胞在有丝分裂间期时牢固贴附在培养板上，而在有丝分裂期时形态变圆，使其与培养皿的贴附能力变弱，容易从培养皿上脱落。当完成有丝分裂后，细胞又将变得扁平并重新贴壁。一些微管药物如Nocodazole (诺考达唑)可以通过激活纺锤体检验点而将细胞阻滞在有丝分裂期，当轻轻摇晃培养皿时可以很容易地将这些细胞移去；而当这些细胞的纺锤体检验点被抑制后，它们将退出有丝分裂，重新变成扁平状并贴附在培养皿上。在本发明的模型中，首先将由于Nocodazole作用而处于有丝分裂期的细胞转移到 96孔板或384孔板上，随后测试一系列化合物诱导这些被阻滞在有丝分裂期的细胞退出该有丝分裂期的能力。阳性化合物能诱导细胞退出有丝分裂，细胞将重新牢固贴附在培养板上，而在阴性化合物作用的孔中，细胞仍处于有丝分裂期并且与培养板的贴附能力很弱，这些细胞在随后的洗涤过程中将被洗去。在去除未退出有丝分裂的细胞之后，留在每孔中的细胞数与化合物对纺锤体检验点的抑制活性呈正相关。这时我们利用MTT实验的原理，通过细胞活性与细胞数的相互关系来揭示留在96孔板上每孔所含细胞的相对数量。MTT实验具灵敏度强、方便操作、重复性高等优点，将MTT实验的原理运用于纺锤体检验点抑制物筛选方法，是本发明筛选模型的一大创新点。为了提高筛选方法的可靠性，尽可能排除假阳性化合物，在第一步筛选的基础上，本发明设计了第二步筛选。因为纺锤体检验点抑制物是通过激活APC/C(Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome)的泛素连接酶活性、以蛋白酶体-泛素化途径降解一些关键的有丝分裂相关蛋白从而诱导细胞退出有丝分裂，所以蛋白酶体活性对于纺锤体检验点抑制物发挥作用是至关重要的。基于这一理论，在第二步筛选中，将蛋白酶体抑制物MG132与第一步筛选出来的潜在纺锤体检验点抑制物一起作用于阻滞在有丝分裂期的细胞，在有MG132的情况下，纺锤体检验点抑制物将不能诱导细胞退出有丝分裂期，而大多数假阳性化合物是通过抑制CDK激酶等机制诱导细胞退出有丝分裂的，它们活性的发挥不依赖于蛋白酶体，因此，通过第二步筛选，这部分假阳性化合物可以被排除。利用文献已报道的阳性纺锤体检验点抑制物(12W)对本发明所阐述的方法进行检测，证明该方法能很好地反映所测试化合物对纺锤体检验点功能的抑制活性。本发明不仅有助于开发具有疗效显著且毒副作用低的纺锤体检验点抑制物，而且可产生一定的社会效益和经济效益，对提高我国在国际抗肿瘤药物市场的竞争力具有重要的战略意义。
图1为12W诱导细胞退出有丝分裂。在图1中，A为HeLa细胞用50_200ng/ml Nocodazole处理12 IMi后，用DMSO作用2 4h，随后将细胞固定并用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核；B为HeLa细胞用Nocodazole处理后，再用30 μ M 12W作用2 4h后固定细胞，然后DAPI染细胞核。图2为12W对细胞有丝分裂指数的影响。在图2中，横坐标为12W的浓度，纵坐标为有丝分裂指数(％)。图3为12W对有丝分裂指数的影响依赖于蛋白酶体活性。在图3中，横坐标为12W 浓度，纵坐标为有丝分裂指数(％ )。图4为用12W验证我们建立的纺锤体检验点抑制剂筛选方法。在图4中，横坐标为12W浓度(μ M)，纵坐标为光吸收值(OD 570)。图5为评估所建立的纺锤体检验点抑制剂筛选方法的有效性。在图5中，横坐标为光吸收值(0D 570)，纵坐标为有丝分裂指数(％ )。
具体实施例方式以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。所述筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法包括以下步骤1)用IOml的DMEM细胞培养液将Hela细胞置于IOcm的细胞培养皿上，在37°C， 5% CO2的条件下培养。2)当细胞密度达到80 % 90 %时，加入终浓度为50 200ng/ml的 Nocodazole (诺考达唑)处理细胞12 16h，轻摇细胞培养板，收集从培养板上脱落的有丝分裂细胞并将其转移到96孔板上(也可用384孔板)，细胞密度为10，000 20，000个/孔。 3)随后加入10 μ 1待测化合物，根据化合物文库及实验目的自已设计化合物终浓度(根据具体药物种类选择具体浓度)。阴性对照组加入等量的DMEM细胞培养液。37°C下细胞培养箱中培养4 他。4)用PBS洗去未贴壁细胞，重复此洗涤步骤2-3次，去掉PBS洗涤液，然后加 Λ 100 200 μ 1 ^ 0. 5mg/ml MTT((3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium Bromide ；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝) 的细胞培养液，37°C下反应2 4h。5)去掉细胞培养液，每孔加入100 μ 1 二甲基亚砜(DMSO)去溶解步骤4)中形成的甲瓒结晶，再用酶标仪检测0D570读值。6)待测化合物所对应孔的0D570与阴性对照孔的0D570之间比值大于2时，该化合物可被认为是潜在的纺锤体检验点抑制物。7)开始进行第二轮筛选，以排除潜在的纺锤体检验点抑制物中的假阳性。重复上述步骤1)和2)，并在原步骤2)中多加入终浓度为10 20uM的MG132。8)加入IOul从步骤6)中筛选出来的潜在纺锤体检验点抑制物，阴性对照孔应加入等量的DMEM细胞培养液，37°C下细胞培养箱中培养4 他。9)重复上述步骤4)和5)。10)潜在的纺锤体检验点抑制物所对应孔的0D570与阴性对照孔的0D570之间比值在0. 6 12之间，该化合物可被认为是纺锤体检验点抑制物，可被用于做进一步的分析。纺锤体检验点抑制剂高通量筛选方法模型及相关验证结果参见图1 5。图1给出12W诱导细胞退出有丝分裂。在图1中，A为HeLa细胞用50-200ng/ mlNocodazole处理12 IMi后，用DMSO作用2 4h，随后将细胞固定并用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核；B为HeLa细胞用Nocodazole处理后，再用30 μ M 12W作用2 4h后固定细胞，然后DAPI染细胞核。由A显示，绝大多数的细胞被Nocodazole阻止在有丝分裂期，可清楚地看见染色体的发布；由B显示，绝大多数的细胞经12W的处理，已经从有丝分裂期退出，没有染色体的存在。图2给出12W对细胞有丝分裂指数的影响。由图2显示，HeLa细胞用50 200ng/ ml诺考达唑(Nocodazole)处理12 16h，再用0 30 μ M 12W作用2 4h后固定细胞， 然后DAPI染核，显微镜下计数有丝分裂指数(有丝分裂期的细胞占总细胞的百分比)，1 5分别表示12W的浓度为0、3. 75,7. 5,15,30 μ M ；图2中显示HeLa细胞的有丝分裂指数随着12W的浓度上升而下降。图3给出12W对有丝分裂指数的影响依赖于蛋白酶体活性。由图3显示，HeLa细胞用50 200ng/ml诺考达唑(Nocodazole)处理12 IMi后处理后，在加或不加蛋白酶体抑制物Μ6132(10μΜ)的情况下，用0或30 μ M 12W作用2 4h，随后将细胞固定，染核， 计算有丝分裂指数，1和2分别表示12W浓度为0、30 μ M。图4给出用12W验证我们建立的纺锤体检验点抑制剂筛选方法。由图4表明，按本发明给出的具体实施方式
，用12W验证该筛选方法，柱形图上方的1和2分别表示不加或加MG132(10yM)，其他每组柱形图与此类似，每组柱形图的左右图分别为不加或加MG132 ； 不存在MG132时，随着12W浓度的增加，运用筛选方法得到的最后读值0D570也相应增加， 但在有MG132的情况下，12W对0D570值无影响。图5给出评估所建立的纺锤体检验点抑制剂筛选方法的有效性。由图5表明，在不存在MG132的情况下，用12W验证该筛选方法，最后得到OD 570值(见图4)，将0D570值与同样浓度12W作用下得到的细胞有丝分裂指数(见图幻进行了相关性分析，相关指数R为-0. 982，表明这两者有很好的相关性；结果表明，本发明建立的筛选方法可以很好地反映化合物对细胞纺锤体检验点功能的抑制作用，从而证明本发明建立的筛选方法具可行性，可用于纺锤体检验点抑制剂高通量的筛选。 图1 3的结果表明在本发明中12W能诱导处于有丝分裂期的细胞退出有丝分裂，进一步证实了前人的报道。另外，12W可抑制细胞纺锤体检验点功能，因此可作为阳性化合物验证本发明建立的筛选方法。
权利要求
1.一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于包括以下步骤1)将Hela细胞置于细胞培养皿上在培养液中培养；2)当细胞密度达到80% 90%时，加入诺考达唑处理，收集从培养板上脱落的有丝分裂细胞并将其转移到96孔板或384孔板上；3)随后加入待测化合物，阴性对照组加入细胞培养液，培养；4)洗去未贴壁细胞，加入细胞培养液反应；5)去掉细胞培养液，加入二甲基亚砜，溶解步骤4)中形成的甲瓒结晶，再检测0D570读值；6)当待测化合物所对应孔的0D570与阴性对照孔的0D570之间比值大于2时，该待测化合物可被认为是潜在的纺锤体检验点抑制物；7)进行第二轮筛选，以排除潜在的纺锤体检验点抑制物中的假阳性，其具体方法是重复上述步骤1)和2)，并在原步骤2)中多加入终浓度为10 20uM的MG132 ；8)加入从步骤6)中筛选出来的潜在纺锤体检验点抑制物，阴性对照孔加入等量的 DMEM细胞培养液培养；9)重复上述步骤4)和5)；10)潜在的纺锤体检验点抑制物所对应孔的0D570与阴性对照孔的0D570之间比值在 0. 6 1. 2之间，该化合物可被认为是纺锤体检验点抑制物，可被用于做进一步的分析。
2.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养液采用DMEM细胞培养液，所述培养是在37°C，5%CO2的条件下培养。
3.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤2)中，所述处理的时间为12 16h。
4.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤2)中，所述加入诺考达唑的终浓度为50 200ng/ml。
5.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤3)中，所述加入待测化合物的量，按体积比，培养液待测化合物为1000 1。
6.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤3)中，所述细胞培养液为等量的DMEM细胞培养液，所述培养是在37°C下细胞培养箱中培养 4 6h。
7.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤4)中，所述洗去未贴壁细胞是用PBS洗去未贴壁细胞，最好重复2 3次。
8.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤4)中，所述细胞培养液采用含0. 5mg/ml 3-(4, 5-cimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium Bromide ；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐的细胞培养液；所述细胞培养液的加入量为待测化合物的10 20倍，所述反应的温度为37°C，反应的时间为 2 4h。
9.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤5)中，所述加入二甲基亚砜的量为每孔加入100μ 1。
10.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤8)中，所述加入从步骤6)中筛选出来的潜在纺锤体检验点抑制物的量与步骤幻所加入的待测化合物的量相同；所述培养，是在37°C下细胞培养箱中培养4 他。
全文摘要
一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，涉及一种纺锤体检验点抑制物。以Hela细胞为模型，根据纺锤体检验点在细胞分裂中的作用机制，利用有丝分裂细胞与间期细胞有着不同粘着力的特性，利用MTT的实验原理，借助一个已知的阳性纺锤体检验点抑制物(12W)验证这个筛选方法的可靠性，建立一个灵敏、易于操作、低成本的可用于高通量筛选纺锤体检验点抑制物的方法。有助于开发具有疗效显著且毒副作用低的纺锤体检验点抑制物。
文档编号G01N33/53GK102321724SQ201110223870
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者吴振华, 李晓彤 申请人:厦门大学