专利名称：一种肝素的检测方法
技术领域：
本发明涉及肝素检测，具体地说是一种快速、准确、灵敏的检测肝素的方法。
背景技术：
目前，肝素检测的分析方法主要有全血激活凝血时间法、分子光度法、荧光法以及高效液相色谱法。然而，全血激活凝血时间法需采用全血进行测定，而且血小板的存在会对实验结果产生影响；分子光谱法难以实现在线、原位、实时、多组分同时测定，且该法检测灵敏度较低；荧光法存在监测速度慢、连续性差、分析成本高、存在二次污染和无法在线监测等缺陷；高效液相色谱法对研究人员的技术要求较高，另外血液中的复杂成分会影响测定结果的准确性。
发明内容
本发明的目的在于针对上述不足之处提供一种快速、准确、灵敏的检测肝素的方法。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为一种肝素的检测方法利用离子选择性电极黏附的聚合物敏感膜相中鱼精蛋白与水相中肝素的特异性结合，通过电位测定仪测定加入不同浓度肝素后的电位变化，根据电位变化速率测定待测样品中肝素的浓度。利用离子选择性电极黏附的聚合物敏感膜中鱼精蛋白与待测溶液中的肝素形成络合物进入水相，同时膜相中氯离子也随着鱼精蛋白进入水相，引起电位的变化，根据电位的初始变化速率即得到待测样品中肝素的浓度。所述聚合物敏感膜中加入亲脂性的惰性盐以增加聚合物膜的导电性。所述离子选择性电极头上黏附的聚合物敏感膜是由聚合物基体材料、增塑剂、离子载体和亲脂性的惰性盐组成，按重量份数比为20-40 40-80 0.1-10 0. 1_10混合，混合后融入到四氢呋喃溶液中，搅拌使之成为均勻溶液，然后室温下放置12-24h，即得到有弹性的聚合物敏感膜，所述聚合物基体材料为聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亚胺、橡胶或溶胶凝胶膜；增塑剂为邻-硝基苯辛醚(O-NP0E)、二 -2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；离子载体为鱼精蛋白；亲脂性的惰性盐为四(十二烷基)-四(4-氯苯基)硼酸铵(ΕΤΗ 500)。检测过程具体为a.将未经活化的离子选择性电极直接插入盛有缓冲溶液的测量池中，待电极稳定后得到基线电位；b.将标准肝素加入测量池中，肝素与电极膜表面的鱼精蛋白作用，电位下降，所述离子选择性电极内插有内参比电极，同时TriS-HCl缓冲溶液和0. 12M NaCl作为内充液注入离子选择性电极内，电极底部黏附聚合物敏感膜；c.根据加入肝素后初始电位变化速率对肝素浓度绘制标准曲线；
d.将未经活化的离子选择性电极直接插入盛有待测样品的测量池中，产生样品信号，通过样品溶液的初始电位变化速率与标准工作曲线对照得到待测肝素的浓度。作用原理在缓冲溶液中，电极膜相中的鱼精蛋白和氯离子能够稳定存在，得到稳定电位，当加入肝素后，由于肝素和鱼精蛋白之间强烈的相互作用，膜相中的鱼精蛋白和肝素形成络合物进入水相，同时氯离子也随着鱼精蛋白进入水相，从而引起电位的变化。本发明的优点在于1.本发明电极膜中直接嵌入鱼精蛋白，无需手工加入底物，因此该法操作简便，误
差较小。2.本发明采用鱼精蛋白作为一种识别元件制备聚合物膜离子选择性电极，由于鱼精蛋白和肝素的结合常数比较大，对肝素的选择性较好，血样中亲脂性较强的硫氰根和水杨酸根离子产生的干扰较小，因而本法可以直接用于血样中肝素。3.本发明电极制备简单，无需活化，大大缩短了电极的制作周期。此外，本发明采用电位变化的初始斜率和待测物浓度关系进行定量，因而大大缩短了检测时间。
图1为本发明电极的示意图(其中1为内参比电极，2为内充液，3为聚合物敏感膜，4离子选择性电极)。图2为本发明电极的示意图(其中1为内参比电极，2为内充液，3为聚合物敏感膜，4离子选择性电极，5为外参比电极)。图3A为本发明电极和传统的聚合物膜肝素选择性电极对IO-3M硫氰根和IO-3M水杨酸根离子响应对照图。 图;3B为本发明电极在IO-4M硫氰根和IO-4M水杨酸根离子存在下对0. 4U/mL肝素的响应图。图4为本发明电极测定不同浓度肝素标准信号响应曲线。图5为本发明电极测定不同浓度肝素的标准工作曲线。图6为本发明电极测定不同浓度胰岛素的标准信号响应曲线。图7为本发明电极不同浓度胰岛素的标准工作曲线。
具体实施例方式实施例1以本电极测试缓冲溶液中肝素为例。其测定步骤如下a.以离子选择性电极作为工作电极，Ag/AgCl (3M KCl)电极为参比电极， PXSJ-216L离子计测定电位值，离子选择性电极、Ag/AgCl (3M KCl)与PXSJ-216L离子计相连(参见图幻。将未经活化的离子选择性电极直接插入盛有缓冲溶液的测量池中，记录初始电位。所述离子选择性电极(参见图1)内插有Ag/AgCl内参比电极，同时将50mM Tris-HCl (pH = 7. 4)缓冲溶液和0. 12M NaCl混合液作内充液注入离子选择性电极内，电极底部黏附聚合物敏感膜。电极的制备过程取200mg聚合物膜材料，其中包括0. 5wt %鱼精蛋白，3wt %四 (十二烷基)_四(4-氯苯基)硼酸铵(ETH500)，54. 5wt%聚氯乙烯和43wt%邻-硝基苯辛
4醚，融入到2mL四氢呋喃溶液中，室温下于称量瓶(直径3. 6cm)中放置12h，即得到富有弹性的聚合物敏感膜，厚度约为200 μ m。利用打孔器将敏感膜切割成0. 6cm直径大小的均勻圆形切片，用四氢呋喃将敏感膜黏附到聚四氟乙烯管顶管。b.将离子选择性电极插入盛有缓冲溶液的测量池中得到基线电位，向测量池中加入已知浓度的肝素，产生标准信号(如图4)，根据加入肝素后电位的初始变化速率和肝素浓度绘制标准曲线(如图5)。检测装置离子选择性电极(参见图1)内插有Ag/AgCl内参比电极，同时50mM Tris-HCl (pH = 7. 4)缓冲溶液和0. 12M NaCl混合溶液作为内充液注入离子选择性电极内， 电极底部黏附聚合物敏感膜，离子选择性电极为工作电极(正极)，Ag/AgCl (3M KCl)电极为参比电极(负极)，正极与负极通过导线与PXSJ-216L离子计相连(参见图2)。电极性能的测试测定电极对硫氰根和水杨酸根离子的响应。电极在10_3mOl/L硫氰酸根和水杨酸根离子的溶液中响应很小(< 5mV)，电极在10_4mOl/L硫氰酸根和水杨酸根离子存在下测定0. 4U/mL肝素的电位响应，从图:3B可以看出10_4mol/L硫氰酸根和水杨酸根离子不会对肝素检测产生影响，说明该电极对亲脂性较强的硫氰酸根和水杨酸根离子具有较好的选择性，因此本法有望应用于抽烟者以及服用阿司匹林后的患者体内血样中肝素的直接检测(参照图3)。实施例2首先取0. 12M NaCl溶液配置了两个加标试样，浓度分别为0. 05U/ml和0. 2U/ml， 依照实例1测定电位的初始值，根据电位初始值，计算电位的初始变化速率，对照标准工作曲线(如图5)计算出相应的浓度。实施例3以本电极测试羊血中的肝素。其测定步骤如下a.将新鲜羊血中加入柠檬酸钠，防止其凝固，用此血样为背景电解质配置不同浓度的已知浓度的肝素样品，b.以离子选择性电极作为工作电极，Ag/AgCl (3M KCl)电极为参比电极， PXSJ-216L离子计测定电位值。离子选择性电极、Ag/AgCl(3M KCl)与PXSJ-216L离子计相连(参见图幻。将未经活化的离子选择性电极直接插入盛有羊血的测量池中，记录初始电位，根据电位的初始值，计算得到电位的初始变化速率，作为对照信号，将对照信号参照标准工作曲线即可得样品中肝素的含量。所述离子选择性电极(参见图1)内插有Ag/AgCl 内参比电极，同时将50mM Tris-HCl (pH = 7. 4)缓冲溶液和0. 12M NaCl混合溶液作为内充液注入离子选择性电极内，电极底部黏附聚合物敏感膜。电极的制备为取200mg聚合物膜材料包含0. 5wt%鱼精蛋白，3wt%离子液体， 54. 5wt%聚氯乙烯以及43wt%邻-硝基苯辛醚，融入到2mL四氢呋喃溶液中，室温下于称量瓶(直径3. 6cm)中放置12h，即得到富有弹性的聚合物敏感膜，膜厚为200μπι。利用打孔器将敏感膜切割成0. 6cm直径大小的均勻圆形切片，用四氢呋喃将敏感膜黏附到聚四氟乙
烯管顶管。检测装置离子选择性电极(参见图1)内插有Ag/AgCl内参比电极，同时50mM Tris-HCl (pH = 7. 4)缓冲溶液和0. 12M NaCl混合溶液作为内充液注入离子选择性电极内， 电极底部黏附聚合物敏感膜，离子选择性电极为工作电极(正极)，Ag/AgCl (3M KCl)电极为参比电极(负极)，正极与负极通过导线与PXSJ-216L离子计相连(参见图2)。
实施例4采用本发明电极测定人血中的肝素以新鲜的血液为背景电解质，配置不同已知浓度的肝素样品，参照实例3，对照标准工作曲线(如图5)计算出相应的浓度。实施例5采用本发明电极测定不同浓度胰岛素的电极响应；a.以离子选择性电极作为工作电极，Ag/AgCl (3M KCl)电极为参比电极， PXSJ-216L离子计测定电位值。将50mM Tris-HCl (pH = 7. 4)和0. 12M的氯化钠混合溶液作为内充液注入离子选择性电极内，测定电极在50mMTris-HCl (pH = 7. 4)和0. 12M氯化钠缓冲溶液中电位响应。b.以离子选择性电极作为工作电极，Ag/AgCl (3M KCl)电极为参比电极， PXSJ-216L离子计测定电位值。将50mM Tris-HCl (pH = 7. 4)和0. 12M的氯化钠混合溶液作为内充液注入离子选择性电极内，测定电极在50mMTris-HCl (pH = 7. 4)和0. 12M氯化钠缓冲溶液以及0. l-4UmL-1的胰岛素中的初始电位，根据初始电位值，计算得到电位的初始变化速率，根据加入胰岛素后电位的初始变化速率和胰岛素浓度绘制标准曲线。(参照图 6，7)。c.取0. 12M NaCl溶液配置了两个未知浓度的加标试样，依照步骤a和b，分别计算得到两个加标试样的电位的初始变化速率，对照标准工作曲线，得到样品中胰岛素的含量。
权利要求
1.一种肝素的检测方法，其特征在于利用离子选择性电极黏附的聚合物敏感膜相中鱼精蛋白与水相中肝素的特异性结合，通过电位测定仪测定加入不同浓度肝素后的电位变化，根据引起的电位变化速率测定待测样品中肝素的浓度。
2.按权利要求1所述的肝素的检测方法，其特征在于利用离子选择性电极黏附的聚合物敏感膜中鱼精蛋白与待测溶液中的肝素形成络合物进入水相，同时膜相中氯离子也随着鱼精蛋白进入水相，引起电位的变化，根据电位的初始变化速率即得到待测样品中肝素的浓度。
3.按权利要求1或2所述的肝素的检测方法，其特征在于所述聚合物敏感膜中加入亲脂性的惰性盐增加聚合物膜的导电性。
4.按权利要求1或2所述肝素的检测方法，其特征在于所述离子选择性电极头上黏附的聚合物敏感膜是由聚合物基体材料、增塑剂、离子载体和亲脂性的惰性盐组成，按重量份数比为20-40 40-80 0.1-10 0. 1_10混合，混合后融入到过量四氢呋喃溶液中，搅拌使之成为均勻溶液，然后室温下放置1214h，即得到有弹性的聚合物敏感膜；所述聚合物基体材料为聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亚胺、橡胶或溶胶凝胶膜； 增塑剂为邻-硝基苯辛醚(O-NP0E)、二 -2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯； 离子载体为鱼精蛋白，亲脂性的惰性盐为四(十二烷基)_四(4-氯苯基)硼酸铵(ETH500)。
5.按权利要求1所述的肝素的检测方法，其特征在于检测过程具体为a.将未经活化的离子选择性电极直接插入盛有缓冲溶液的测量池中，待电极稳定后得到基线电位；b.将标准肝素加入测量池中，肝素与电极膜表面的鱼精蛋白作用，电位下降；所述离子选择性电极内插有内参比电极，同时Tris-HCl缓冲溶液和0. 12M NaCl为内充液注入离子选择性电极内，并且底部黏附聚合物敏感膜；c.根据加入肝素后初始电位变化速率对肝素浓度绘制标准曲线；d.将未经活化的离子选择性电极直接插入盛有待测样品的测量池中，产生样品信号； 通过样品溶液的初始电位变化速率与标准工作曲线对照得到待测肝素的浓度。
全文摘要
本发明涉及肝素的检测，具体地说是一种快速、准确、灵敏的检测肝素的方法。利用聚合物敏感膜相中鱼精蛋白与水相中肝素的特异性结合，通过电位测定仪测定加入不同浓度肝素后的电位变化，根据初始电位变化速率，绘制标准工作曲线，对照标准工作曲线即得未知样品中肝素的浓度。本发明聚合物膜内添加鱼精蛋白，因此无需手工加入鱼精蛋白；电极无需活化可以直接用于样品检测，从而该发明具有操作简便、检测时间短，操作成本低以及适宜现场检测等优点。
文档编号G01N27/333GK102445483SQ20111030286
公开日2012年5月9日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者秦伟, 陈燕 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所