专利名称：荧光定量pcr对布鲁氏杆菌气溶胶的快速鉴定方法
技术领域：
本发明涉及荧光定量PCR对布鲁氏杆菌气溶胶的快速鉴定方法。背景技术：
布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种全世界广泛分布的人兽共患慢性细菌性传染病。布鲁氏菌可感染人类、多种家畜和野生动物，引起相似的临床症状与病理损伤，如发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害等，导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。本病流行于世界各地，1887年首次证实本病病原体，20世纪30 60年代布鲁氏菌病在世界范围内已有较流大行[1]，80年代全世界200多个国家和地区约170多个国家和地区有人、家畜、野生动物布鲁氏菌病的存在和流行[2-3]，约有全世界1/6 1/5的人口受到布鲁氏菌病的威胁，全世界现约有500万 600万人患布鲁菌病，每年新发病人约有 50万人，分布相当广泛，其中欧洲是一个布鲁氏菌病发病率最高的洲。在亚洲的发病率以伊朗最为严重，人间发病较高，在家畜中布鲁氏菌病流行也很严重，几乎各种家畜都有布病流行，老挝人间布鲁氏菌病也属于高发区，在牛、羊、猪中都有布鲁氏菌病流行，蒙古人民共和国人畜布鲁氏菌病都比较严重W-8]。我国也是布鲁氏菌病疫区，近几年来疫情回升。据1952年 1990年的资料统计，1952年 1982年间对总共3050万头羊、牛、猪和457万份人血清样品调查表明，布鲁氏菌感染阳性率家畜和人分别为41. 27%和8. 43%，而1982年 1990年间总共4920万头羊、牛、猪和788万人血清学调查表明，布鲁氏菌感染阳性率家畜和人分别骤降至0. 55%和 0.75%[9]。但自1993年后，我国布鲁氏菌病疫情又呈上升趋势，爆发点不断出现，1994年新发病人数为815人，到2003年新发病人数已达6000多人[10]，2006年报告病例20279 人，是我国发病人数最多的一年。布鲁氏菌病疫情回升的省区有黑龙江、吉林、辽宁、山东、 河北、河南、山西、陕西、新疆、西藏、内蒙古等。如陕西省缓德县，1995年新发病人286人，发病率高达84. 8/10万，血清效价最高达1 25600 [11]，河北省布鲁氏菌病发病率从1997年的 0.134/10万[12]，逐年上升为2001年的0.415/10万[13]。另外疫区不断蔓廷，老疫区发病增加，新疫区不断出现，以河北省为例，疫区从1997年的7市17县区发展到2001年的8 市33个县区[12-16]。并且，我国对人布鲁氏菌病疫情监测亦表明，80年代前牧民、兽医、屠宰场和皮毛场的工人、饲养员等职业人群的感染率在10. 00-20. 00%之间，其它非职业人群仅为 0. 50-4. 50%, 80年代后，上述职业人群感染率都低于5. 00% (个别除外)，而其它非职业人群如农民、干部、学生的布鲁氏菌病感染率上升为2. 30-4. 70%之间，说明非职业人群的布鲁氏菌病感染率呈上升趋势[17]。鉴于布鲁氏菌病有反弹的趋势，在未来一段很长的时间里，布鲁氏菌病仍将是世界性的公共卫生问题，我国的布鲁氏菌病防制也仍面临着巨大的挑战。因此，对布鲁氏菌病的流行及防控的研究势在必行。然而，病原的特殊性和复杂性导致了布鲁氏菌的基础研究严重滞后，国内外大部分研究仅仅对发病疫区布鲁氏菌进行分离鉴定和分型，对感染布鲁氏菌病的动物进行隔离或捕杀，对易感动物进行疫苗免疫。有关布鲁氏菌的传播机制的研究主要集中在接触性传播和垂直性传播上，对气源性传播的报道很少，理论上认为布鲁氏菌可以通过气源性传播， 但是迄今为止，尚未见到对布鲁氏菌进行气源性传播的相关研究。基于上述国际、国内研究现状的分析，本发明主要围绕布鲁氏菌气源性传播，首先对我国牛场进行布鲁氏菌的流行病学调查；然后在发病牛场及其上风向、下风向不同距离的地方采集空气样品，利用分子生物学技术(real-time PCR)检测布鲁氏菌的含量及分布情况。
发明内容
为了解决上述问题，本发明建立了灵敏度高、特异性强、重复性良好、操作简单、快速的 B. abortus的气源性传播的real-time PCR快速鉴定，该方法速度快、高通量，能大大缩短检测周期，为疾病的治疗和疫情的控制提供保障，并能避免检测过程中可能造成的生物污
^fe ο本发明的具体步骤是
1、引物设计
利用 Premier v. 5. 0 (PREMIER Biosoftware International, Palo Alto, CA, USA) I慨Brucella abortus strain 544基因组中IS711和AlkB基因的保守区域设计一对引物和探针，并由大连宝生物有限公司合成，预期扩增DNA产物148bp。上游引物5，—ATGCCTGCCTCATCAATCGTTA — 3，，其序列如 Seq ID No 1 所示； 下游引物:5，— GGGTCCGTCCGTTTCATTCC — 3，，其序列如 Seq ID No 2 所示； Taqman 探针5，-FAM-CGCTCCATCAGGACAAGGACGAACGG-ECLIPSE-3，，其序列如 kq ID
No 3所示；
2、病原DNA的提取
按试剂盒(AxyPi^p Multisource Genomic DNA Minipr印 Kit, AXYGEN Company, USA)说明提取B. abortus基因组DNA。3,B. abortus IS711 和 AlkB 基因的扩增
以提取的从abortus DNA作为模板，应用上游引物和下游引物进行扩增。在反应管中依次加入 IOXPCR buffer 2. 5μ1，dNTPl. 6μ1，上、下游引物分别为 1. 6μ1，Taq 酶 0. 2μ1，超纯水15. 5μ1，DNA提取液2. Ομ ，总体积25μ1。在PCR仪上置94°C 5分钟，随后94°C 30秒， 30秒，72°C 30秒，共35个循环，结束循环后72°C 10分钟。对PCR产物进行琼脂凝胶电泳鉴定。然后按照通用型DNA纯化回收试剂盒(天根生物技术有限公司，中国北京)的说明进行切胶回收。4、质粒标准阳性模板的制备
①确定阳性质粒PCR产物于1%琼脂凝胶中电泳后，用胶回收试剂盒提取DNA，按照常规方法将目的片段与PMD18-T载体连接，并转化DH5 α感受态细胞中，于氨苄青霉素培养基37°C培养过夜，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，菌液PCR鉴定挑取的阳性质粒，并通过序列测定进行分析，测定的序列与Genebank上的标准菌株序列对比分析，确定阳性质粒。所述的荧光定量标准品为从abortus IS711和AlkB基因，序列大小为148bp，其序列如 Seq ID No 4 所示；②阳性质粒浓度的测定将质粒提取物用超纯水IOX稀释后，在沈0 11111与观0 nm波长下测定液体中质粒的含量，并根据公式计算每微升液体中质粒DNA的拷贝数。质粒DNA拷贝数=.质粒浓度χ6.023χ IO23
质粒ΓΜ4分子量^
注每个碱基的平均分子量为660 5、Real-time PCR标准曲线的绘制
提取上述阳性质粒DNA做荧光定量标准品，倍比稀释(IO6 IO1 copies/PL)用于荧光定量PCR标准曲线绘制，扩增反应体系10 yl 每个反应管中加入探针0.25μ1，上下游引物分别为 0. 45μ1，模板 2 μ 1，超纯水 1. 85μ1,Τ0Υ0Β0 Master mix (2X ) 5μ1,总体积 10μ1。 反应条件为先置50°C 2分钟，接着置95°C 10分钟，随后95°C 15秒，60°C 1分钟，共40个循环，数据的收集和标准曲线的生成由仪器自带软件SDSV1. 9. 1完成。根据待测样品中目的基因的拷贝数，便可以推导出奶牛舍环境中气载从Morto1S的浓度(Copies/m3 air)。本发明利用荧光定量PCR技术来检测空气样品中的布鲁氏菌，其原理为TaqMan探针的5’端标以荧光发射集团FAM(6-carb0Xyflu0rescein)，3’端标以荧光淬灭集团TAMR A (6-Carboxy-tetrameth-yl-rhodamine),当探针单独存在时，由于荧光共振能量转移的发生，FAM的荧光受到TAMRA的淬灭，在PCR的过程中，由于TaqMan探针的5’ -3’外切酶活性的作用，使探针5’端的FAM被切断，加大了与TAMRA的距离使荧光恢复。其优点在于它的全程封闭操作，没有普通PCR的后处理过程，因此污染率降低，假阳性率降低，又由于其标准曲线的动力学范围广，为精确定量提供了较大的可信空间。本发明的有益效果主要体现在
⑴灵敏度高通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测可知检测到最低浓度为 3. 57 X IO1Copies/μ L0⑵特异性强取牛种、羊种、猪种布鲁氏菌，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠结肠炎耶氏菌(0 9型)制备的模板DNA，在相同反应条件下，与a Morim标准品分别扩增， 结果表明无交叉反应(结果未标出)。⑶重复性好对3个不同浓度的阳性标准品进行了批内检测和批间检测，计算出批内变异系数和批间变异系数，其批内误差为1. 8% 6. 5%，批间误差为2. 6% 9. 1%。 批内和批间重复试验Ct值的统计学分析表明相同稀释度标准质粒Ct值之间差异均不显著(尸 > 0. 05)。本发明的主要意义在于第一、了解我国布鲁氏菌病流行菌种的特点和发展态势， 为制定布鲁氏菌病综合性防治措施提供重要的理论依据，也为掌控我国布鲁氏菌病的发展态势提供重要的参考数据。第二、确定布鲁氏菌能否通过气源性传播，有利于更好地控制布鲁氏菌在人与动物间的相互感染，具有重要的公共卫生学意义。第三、完善对布鲁氏菌特性的认识，为更深层次的研究提供理论基础。
说明书附图
图1 Real-time PCR检测召.iortos标准品扩增曲线(荧光定量PCR仪自动生成)， 图中自左侧到右侧的扩增曲线，代表7. 04X 106copies/reaction—7. 04X IO0Copies/ reaction的标准品的扩增曲线。
图2 Real-time PCR检测召.dories标准曲线(荧光定量PCR仪自动生成)，由图得知，标准品的模板浓度与可检测到荧光信号的循环数呈显著的线性关系，其相关系数R2 =0. 998888，线性方程为 y = _f=_3. 217790x+41. 8502；35。
具体实施例方式
参照GenBank中公开发表的^raceWa abortus strain 544基因组中IS711和AlkB 基因的保守区域设计一对引物和探针
上游引物5，— ATGCCTGCCTCATCAATCGTTA — 3，其序列如 Seq ID No 1 所示； 下游引物5，— GGGTCCGTCCGTTTCATTCC — 3，其序列如 Seq ID No 2 所示； Taqman 探针5，-FAM-CGCTCCATCAGGACAAGGACGAACGG-ECLIPSE-3，其序列如 kq ID No 3所示·
实施例一以已知召.Morto1S标准菌株为检测材料，并以超纯水为阴性对照。Y、B. a/wrtos DNA 的提取
按试剂盒(AxyPi^p Multisource Genomic DNA Minipr印 Kit, AXYGEN Company, USA)说明提取B. abortus基因组DNA。2、B. abortus IS711 和 AlkB 基因的扩增
以提取的从abortus DNA作为模板，应用上游引物和下游引物进行扩增。在反应管中依次加入 IOXPCR buffer 2. 5μ1，dNTPl. 6μ1，上、下游引物分别为 1. 6μ1，Taq 酶 0. 2μ1，超纯水15. 5μ1，DNA提取液2. Ομ ，总体积25μ1。在PCR仪上置94°C 5分钟，随后94°C 30秒， 30秒，72°C 30秒，共35个循环，结束循环后72°C 10分钟。对PCR产物进行琼脂凝胶电泳鉴定。然后按照通用型DNA纯化回收试剂盒(天根生物技术有限公司，中国北京)的说明进行切胶回收。3、连接、转化和阳性菌的鉴定
按照pMDlS-T克隆试剂盒(天根生物技术有限公司，北京，中国)进行连接。然后转化 (按照PMD18-T克隆试剂盒说明进行)到DH5 α感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素的平板上， 37°C培养18小时。再选取阳性菌落委托大连宝生物有限公司进行测序鉴定。4、质粒的倍比稀释
序列验证后，进行质粒的大量制备，然后提取质粒，进行核酸含量测定。再对质粒进行 10倍比稀释，共稀释6个梯度(IO1C0Pies IO6c0PiesAa),用作标准品。5、制作标准曲线
每一个标准品和待测样品各取2. Ομ ，进行荧光定量PCR，同时做无模板空白对照。每个反应管中加入探针0. 25μ1，上下游引物分别为0. 45μ1，超纯水1. 85μ1，Τ0Υ0Β0 Master πι χ(2Χ)5μ1,总体积10μ1。在PCR仪(ΑΒΙ 7500型荧光定量PCR仪，美国)上先置50°C 2 分钟，接着置95°C 10分钟，随后95°C 15秒，60°C 1分钟，共40个循环，数据的收集和标准曲线的生成由仪器自带软件SDSV1. 9. 1完成。根据待测样品中目的基因的拷贝数，便可以推导出奶牛舍环境中气载从a力oritts的浓度(Copies/m3 air)。结果说明本方法能有效地检测从Morto1S的浓度。实施例二 待检空气样品中气载从abortus的荧光定量PCR检测。1、样品制备
将国际标准的AGI-30 (All Glass Impinger) [12]空气采样器置于奶牛舍内以及奶牛舍外上风向10m、20m、50m和下风向50m、100m、200m、500m处，离地面1. 5m，以50mL的灭菌蒸馏水为采样介质，采样时气流速度为12. 5 L/min，驱动时间为30 min[13]，每一采集点重复三次。将采集的样品置于离心管中，15000g离心30min，作为待测样品。2、DNA 的提取
按试剂盒(AxyPi^p Multisource Genomic DNA Minipr印 Kit, AXYGEN Company, USA)说明提取B. abortus基因组DNA。3、荧光定量PCR检测
每一个标准品和待测样品各取2. Ομ ，进行荧光定量PCR，同时做无模板空白对照。每个反应管中加入探针0. 25μ1，上、下游引物分别为0. 45μ1，模板2. Ομ ,超纯水1. 85μ1， Τ0Υ0Β0 Master mix (2X )5μ1,总体积 10μ1。在 PCR 仪(ΑΒΙ 7500 型荧光定量 PCR 仪，美国)上先置50°C 2分钟，接着置95°C 10分钟，随后95°C 15秒，60°C 1分钟，共40个循环， 数据的收集和标准曲线的生成由仪器自带软件SDSV1. 9. 1完成。根据待测样品中目的基因的拷贝数，便可以推导出奶牛舍环境中气载从Morto1S的浓度(Copies/m3 air)。结果说明本方法能敏感地检测出奶牛舍内外不同距离的气载B. abortus的浓度 (Copies/m3 air)。
权利要求
1. 一种荧光定量PCR对布鲁氏杆菌气溶胶的快速鉴定方法，包括引物设计、病原DNA 的提取、从abortus IS711和AlkB基因的扩增、制备质粒标准阳性模板和绘制Real-time PCR标准曲线；其特征在于包括以下步骤1)引物设计利用 Premier v. 5. 0 (PREMIER Biosoftware International, Palo Alto, CA, USA) I慨Brucella abortus strain 544基因组中IS711和AlkB基因的保守区域设计一对引物和探针，扩增DNA产物148bp ；上游引物5，— ATGCCTGCCTCATCAATCGTTA — 3，其序列如 Seq ID No 1 所示；下游引物:5，— GGGTCCGTCCGTTTCATTCC — 3，其序列如 Seq ID No 2 所示；Taqman probe :5’ -FAM-CGCTCCATCAGGACAAGGACGAACGG-ECLIPSE-3’ 其序列如 kq ID No 3所示；2)取备检样品提取召.abortus基因组DNA；3)扩增苁abortusIS711和AlkB基因以提取的从abortus DNA作为模板，应用引物进行扩增；在反应管中依次加入IOXPCR buffer 2. 5μ1，(1ΝΤΡ1. 6μ1，上、下游引物分别为 1. 6μ1，Taq 酶 0. 2μ1，超纯水 15. 5μ1， ΝΑ 提取液2. Ομ ，总体积25μ1 ；在PCR仪上置94°C 5分钟，随后94°C 30秒，54°C 30秒，72°C 30 秒，共35个循环，结束循环后72°C 10分钟；对PCR产物进行琼脂凝胶电泳鉴定；然后按照通用型DNA纯化回收试剂盒的说明进行切胶回收；4)制备质粒标准阳性模板①确定阳性质粒PCR产物于1%琼脂凝胶中电泳后，用胶回收试剂盒提取DNA，按照常规方法将目的片段与PMD18-T载体连接，并转化DH5 α感受态细胞中，于氨苄青霉素酶培养基37°C培养过夜，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，菌液PCR鉴定挑取的阳性质粒，并通过序列测定进行分析，测定的序列与Genebank上的标准菌株序列对比分析，确定阳性质粒；所述的荧光定量标准品为从abortus IS711和AlkB基因，序列大小为148bp，其序列如 Seq ID No 4 所示；②阳性质粒浓度的测定将阳性质粒提取物用超纯水IOX稀释后，在沈0nm与280 nm波长下测定液体中质粒的含量，并根据公式计算每微升液体中质粒DNA的拷贝数；
全文摘要
本发明涉及一种荧光定量PCR对布鲁氏杆菌气溶胶的快速鉴定方法，是采用荧光探针技术，设计一对仅在流产布氏杆菌基因组中IS711和AlkB基因的保守区域的引物和一条特异性的荧光双标记探针，具体包括以下步骤(1)参照Brucellaabortusstrain544基因组中IS711和AlkB基因的保守区域设计一对引物和探针；(2)取备检样品提取DNA；(3)PCR扩增；(4)质粒标准阳性模板的制备；(5)对收集的荧光曲线进行结果分析。该方法灵敏度高、特异性强，并具有良好的重复性，操作简单快速，能大大缩短检测周期，并能避免检测过程中可能造成的生物污染。
文档编号G01N21/64GK102329879SQ20111031300
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者刘敬博, 柴同杰 申请人:山东农业大学