专利名称：一种测量细胞内pH的微电极及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种电极材料，尤其是涉及一种测量细胞内PH的微电极及其制备方法。
背景技术：
pH值是细胞最基础、最重要的生理参数之一。细胞周围环境PH值的变化，对细胞状态影响十分重要。通过检测细胞及其周围环境的PH值，可了解pH与细胞的不同生理状态之间的关系。目前使用最广泛的PH检测电极为玻璃pH电极，它一般采用玻璃膜作为氢离子的敏感膜，极为脆弱。此外玻璃PH电极的尺寸较大，难以微型化，使用寿命较短的特点也限制它在生命科学领域的应用。金属/金属氧化物电极机械强度高，可塑性强，可用于极端环境下测试，并且易于微型化的特点，越来越受到人们关注而成为研究的热点。许多金属都可以作为基材用以制备金属/金属氧化物电极，其中W/W0x电极具有良好的pH响应、良好的生物相容性，同时相对于其他贵金属氧化物PH电极，ff/W0x电极价格低廉，易于制备。因此W/W03电极是一种比较理想的用于生物体系pH值测量的材料。制备测量细胞内pH的微电极的关键是电极的微型化和氢离子敏感氧化物膜的形成。对于金属电极，微型化的主要方法主要是化学刻蚀法。它的设备要求低，操作简单，易于控制，是获得小尺寸电极尖端的成熟技术。而在表面形成对氢离子敏感的氧化物膜，目前常用的方法包括灼烧法(参见文献1.苗方文，郭义，张艳军等，复合针型钨/氧化钨微PH 传感器的研制，传感器技术，1995，4 33-36 ；)、溅射法(参见文献2. K. Aguir, C. Lemire, D.B. B. Lollman. Electrical Properties of Reactively Sputtered W03 Thin Films as Ozone Gas Sensor. Sensors and Actuators，2002，B84 :1-5 ；)、溶胶-凝胶法(参见文献3.陈东初，赖阅腾，李文芳，氧化钨pH电化学传感器的H+响应行为研究，微纳电子技术，2007 (Zl) :397-399 ；)、电化学循环伏安法(参见文献4. Katsunobu Yamamoto, Guoyue Shi, Tianshu Zhou et al, Solid-state pH ultramicrosensor based on a tungstic oxide film fabricated on a tungsten nanoelectrode and its application to the study of endothelial cells, Analytica Chimica Acta 2003,480 :109-117)。
学循环伏安法制备氢离子敏感氧化物膜未见报道，与其它对氢离子敏感的氧化物膜的制备方法相比，电化学循环伏安法具有以下优点1)设备简单，操作方便，条件参数精确可控；2)可以在形貌复杂的表面制备对氢离子敏感的氧化物膜；
发明内容
本发明的目的是提供一种制备工艺简单，成本低廉，操作简单，实验参数精确可控，可以在任何形状的表面制备对氢离子敏感的活性氧化钨膜，获得的PH电极体积小，响应速度较快，检测灵敏度较高，特别适用于对生物系统进行PH检测的测量细胞内pH的微电极及其制备方法。
所述测量细胞内pH的微电极设有金属基底，所述金属基底表面覆盖有一层对氢离子敏感的活性氧化钨膜，所述活性氧化钨膜是前驱体经过电化学循环伏安法形成的 WOx (X = 1 3)活性氧化钨膜。所述测量细胞内pH的微电极的制备方法包括以下步骤1)将钨丝清洗，以除去表面的有机杂质，晾干后在NaOH中以石墨为对电极进行刻蚀，获得尖端尺寸在1 μ m以下的钨丝；2)使用热熔胶包封钨丝，得pH电极，电极的尖端部分裸露；3)在H2SO4中，以包封后的pH电极为工作电极，钼丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，进行循环伏安活化表面氧化物^^层，其中X = 1 3，获得对氢离子敏感的氧化物膜；4)将活化之后的钨丝pH电极尖端部分悬空浸泡在中，以稳定表面活性氧化物膜对氢离子的吸脱附速率，得测量细胞内PH的微电极。在步骤1)中，所述钨丝的直径可为0. 1 0. 3mm，所述清洗可将钨丝分别在丙酮、 无水乙醇、去离子水中超声清洗5 30min ；所述NaOH可采用1 IOM NaOH ；所述刻蚀的条件可控制交流电位5 50V，刻蚀20 120s。在步骤3)中，所述H2SO4可采用1 5M H2SO4 ；所述进行循环伏安活化表面氧化物 WOx层的条件可为相对开路电位的扫描电位范围为1. 0 2. 0V，扫描圈数为20 30，扫描速度为20 50mV/s。在步骤4)中，所述H2SO4可采用2M H2SO4 ；所述浸泡的时间可为12 72h。本发明利用刻蚀法获得尖端尺寸小于1 μ m，锥度小于1/10的钨丝，制备工艺简单，成本低廉；利用电化学循环伏安法制备对氢离子敏感的活性氧化钨膜，操作简单，实验参数精确可控，可以在任何形状的表面制备对氢离子敏感的活性氧化钨膜。获得的PH电极体积小，响应速度快，检测灵敏度高，特别适用于对生物系统进行PH检测。
图1为经过刻蚀、包封之后的钨丝的SEM照片。在图1中，标尺为lOOnm。图2为表面氧化物WOx(X= 1 3)膜层在2M H2SO4中的电化学循环伏安图。在图 2中，横坐标为电位/V，纵坐标为电流/pA ；循环数曲线a为2，曲线b为8，曲线c为20。图3为W/W0X pH微电极在磷酸缓冲溶液中的工作曲线。在图3中，横坐标为pH， 纵坐标为电位E/mV ；线性响应方程为E = -25. 95-60. 94XpH(R = -0. 995)。图4为pH微电极测量单个Hela细胞pH的光学显微镜照片。在图4中，标尺为 100 μ m0图5为pH微电极测量单个Hela细胞的pH_时间关系曲线，参比电极微Ag/AgCl。 在图5中，横坐标为时间time/s，纵坐标为pH。
具体实施例方式本发明使用的金属基材为化学性质稳定的钨丝。钨丝韧性好，硬度高，价格低廉， 易于取材和加工，在保证足够机械强度的前提下，选取直径小的钨丝，在加工时可以尽量降低能源消耗和节约操作时间，选取直径在0. 1 0. 3mm的钨丝最为合适。
将长度合适的钨丝截取后，分别在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗5 30min,以除去钨丝表面的有机杂质，晾干后，在5M NaOH，控制交流电位5 50V，刻蚀20 120s获得尖端尺寸在1 μ m以下的钨丝。本发明所测量的对象为尺寸在10 100 μ m的细胞，因此必须对刻蚀获得的钨丝进行包封，使其露出的尖端直径在Iym以下。具体做法是控制U型电烙铁温度在120 160°C，将热熔胶涂附在电烙铁上，等待3 ^保证热熔胶充分软化。保持钨丝尖端朝上，并且自下而上穿过软化的热熔胶，热熔胶自动包封钨丝，同时钨丝尖端露出(参见图1)。本发明的测量细胞内pH的微电极的关键在于金属基体上对氢离子敏感的活性氧化钨膜的制备。在1 5M H2SO4中，以包封后的pH电极为工作电极，钼丝为对电极，Ag/AgCl 电极为参比电极，进行循环伏安活化表面氧化物W0x(X = 1 ；3)层，获得对氢离子敏感的氧化物膜，扫描电位范围控制在1. 0 2. OV (相对开路电位)，扫描圈数为20 30，扫描速度为20 50mV/s。电化学活化表面氧化钨膜，是通过电场加速表面氧化钨膜与氢离子相互作用的过程，表面反应如下
WOx+nH++ne - HnWOx随着反应的进行，表面氧化钨膜与溶液界面的氢离子交换速率接近平衡状态，循环伏安的电流值逐渐减小(参见图2)。将活化之后的pH电极尖端部分，悬空浸泡在2M H2SO4 中12 72h，以稳定表面活性氧化物膜对氢离子的吸脱附速率。将制备的W/W0xpH微电极浸泡在系列磷酸缓冲溶液中，可以获得其工作曲线如图3，由图3可知，pH微电极对于氢离子有良好的线性响应E/mV = -25. 95-60. 94XpH(R =-0. 995)，证明该电极可以用于pH的检测。下面结合实施例对本发明的应用进一步详细说明。1)取直径为0. 3mm钨丝分别在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗5min，以除去表面的有机杂质，晾干后在5M NaOH中以石墨为对电极，控制交流电位45V，刻蚀30s获得尖端尺寸在Ιμπι以下的钨丝；2)控制U型电烙铁温度在120 160°C，将热熔胶涂附在电烙铁上，等待3 k 保证热熔胶充分软化。保持钨丝尖端朝上，并且自下而上穿过软化的热熔胶，热熔胶自动包封钨丝，同时钨丝尖端露出；3)在2M H2SO4中，以包封后的pH电极为工作电极，钼丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，进行循环伏安活化表面氧化物WOx(X = 1 ；3)层，获得对氢离子敏感的氧化物膜，扫描电位范围控制在1. 0-2. 0V(相对开路电位)，扫描圈数为20，扫描速度为20mV/s ；4)将活化之后的pH电极尖端部分，悬空浸泡在2M H2SO4中Mh，以稳定表面活性氧化物膜对氢离子的吸脱附速率；5)将正常培养的Hela细胞的培养液吸走，首先使用0. OlM PBS润洗，再更换为 25 μ MPBS作为测量体系。使用微操作系统将pH微电极由缓冲液刺入单个Hela细胞如图 4，并且实时监测获得pH-时间关系曲线如图5，由图可知，当微电极刺入细胞(约IOOs时刻)后，测量的PH值由原先的逐渐增大向逐渐减小转变，证明Hela细胞内部有较多的偏酸性(pH < 5. 9)的物质。
权利要求
1.一种测量细胞内PH的微电极，其特征在于设有金属基底，所述金属基底表面覆盖有一层对氢离子敏感的活性氧化钨膜，所述活性氧化钨膜是前驱体经过电化学循环伏安法形成的WOx活性氧化钨膜，其中X = 1 3。
2.如权利要求1所述的一种测量细胞内PH的微电极的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)将钨丝清洗，以除去表面的有机杂质，晾干后在NaOH中以石墨为对电极进行刻蚀， 获得尖端尺寸在1 μ m以下的钨丝；2)使用热熔胶包封钨丝，得PH电极，电极的尖端部分裸露；3)在H2SO4中，以包封后的pH电极为工作电极，钼丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，进行循环伏安活化表面氧化物WOx层，其中X = 1 3，获得对氢离子敏感的氧化物膜；4)将活化之后的钨丝pH电极尖端部分悬空浸泡在中，以稳定表面活性氧化物膜对氢离子的吸脱附速率，得测量细胞内PH的微电极。
3.如权利要求2所述的一种测量细胞内pH的微电极的制备方法，其特征在于在步骤 1)中，所述钨丝的直径为0. 1 0. 3mm。
4.如权利要求2所述的一种测量细胞内pH的微电极的制备方法，其特征在于在步骤 1)中，所述清洗是将钨丝分别在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗5 30min。
5.如权利要求2所述的一种测量细胞内pH的微电极的制备方法，其特征在于在步骤 1)中，所述NaOH采用1 IOM NaOH0
6.如权利要求2所述的一种测量细胞内pH的微电极的制备方法，其特征在于在步骤 1)中，所述刻蚀的条件为控制交流电位5 50V，刻蚀20 120s。
7.如权利要求2所述的一种测量细胞内pH的微电极的制备方法，其特征在于在步骤 3)中，所述H2SO4采用1 5M H2SO4。
8.如权利要求2所述的一种测量细胞内pH的微电极的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述进行循环伏安活化表面氧化物WOx层的条件为相对开路电位的扫描电位范围为 1. 0 2. 0V,扫描圈数为20 30，扫描速度为20 50mV/s。
9.如权利要求2所述的一种测量细胞内pH的微电极的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述H2SO4 采用 2M H2SO4。
10.如权利要求2所述的一种测量细胞内PH的微电极的制备方法，其特征在于在步骤 4)中，所述浸泡的时间为12 72h。
全文摘要
一种测量细胞内pH的微电极及其制备方法，涉及一种电极材料。微电极设有金属基底，金属基底表面覆盖有一层对氢离子敏感的活性氧化钨膜。将钨丝清洗，晾干后在NaOH中以石墨为对电极进行刻蚀，得尖端尺寸在1μm以下的钨丝；使用热熔胶包封钨丝，得pH电极，电极的尖端部分裸露；在H2SO4中，以包封后的pH电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，进行循环伏安活化表面氧化物WOX层，X＝1～3，获得对氢离子敏感的氧化物膜；钨丝pH电极尖端悬空浸泡在H2SO4中，即得。工艺简单，成本低，操作简单，可在任何形状的表面制备对氢离子敏感的活性氧化钨膜，电极体积小，响应速度快，灵敏度高。
文档编号G01N27/333GK102539501SQ20111036223
公开日2012年7月4日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者林昌健, 林龙翔, 胡仁, 黄巧玲 申请人:厦门大学