一种基于电化学DNA生物传感器的Pb²⁺、Hg²⁺同时测定方法

专利名称：一种基于电化学DNA生物传感器的Pb²⁺、Hg²⁺同时测定方法
技术领域：
本发 明属于分析化学和化学传感器技术领域，涉及ー种基于汞离子、铅离子诱导DNA构型发生改变的电化学DNA传感器的制备方法，并将所制备的传感器应用于实际水体系两种离子低浓度时的同时检测及単独检测。该方法可有效分析重金属离子在环境中的污染特点，构建环境污染事故的应急监测系统。
背景技术：
近年来，采用电化学传感器方法对有毒重金属离子的检测已成为研究热点之一。与基于生物催化(酶、微生物等)和免疫原理的生物传感器相比，DNA除了能够特异性识别小分子，还具有识别层十分稳定，受环境干扰和限制少，并且易于合成或再生以供重复利用等优点，诸多优势使得电化学DNA传感器作为ー种新型的检测技术在环境监测领域有着广阔的应用前景。汞离子和铅离子作为“优先管理有害物质名単”上的两种重要金属离子，因能对人体及环境产生毒害影响而备受人们关注。如今发展迅速的电化学和光学传感技术，如基于荧光探针、金納米粒子、DNA酶、半导体量子点和碳纳米管等方法，因具有操作简单、灵敏度高、分析成本低等优点，逐渐被广泛应用于Hg2+和Pb2+的检测。Tang等基于Hg2+对T-T碱基对结构的特异性识别作用，通过观察嵌插剂插入到双链DNA前后电化学信号的改变情況，作为检测汞离子的依据。Chang等利用能与Pb2+特异结合的脱氧核酶和微制作电泳装置制造了一种简单、微型化和具有选择性的DNA传感器，对Pb2+的检测浓度达到了 llnM。尽管这些方法都可以实现对Hg2+和Pb2+的选择性检测，但绝大部分都针对单一金属离子进行研究，应用同一种DNA探针同时对两种离子进行测量的方法却鲜有报道。Liu等利用一条标记有荧光基团的DNA探针，基于汞离子和铅离子引起DNA构型发生改变引起的光化学信号的变化情況，成功对Hg2+和Pb2+实现了同时检測。但是该方法引入了有毒的NaCN掩蔽剂，并且存在较高的背景信号干扰和较低的灵敏度等缺点，因而在实际检测中受到多方面因素的限制。如上所述，目前在利用电化学DNA传感器对重金属离子的检测方面，仍缺乏对两种及其以上金属离子同时测定的研究，不利于实现多目标物的分析检测，因而开发出ー种能同时检测多种离子的传感检测技术，在完善我国现有检测技术手段，构建污染事故应急监测系统方面具有现实意义。

发明内容
本发明的内容就是提供ー种基于电化学DNA传感器的Pb2+、Hg2+同时测定方法，并通过弓I入掩蔽剂可以有效实现对两种离子的检测。本发明的技术方案如下基于电化学DNA传感器的Pb2+、Hg2+同时测定方法，包括以下步骤I电极的预处理与活化
将金电极在鹿皮抛光布上用Al2O3粉末抛光至镜面，依次在こ醇和去离子水中超声，然后在H2SO4溶液中进行活化处理，用去离子水冲洗干净，用氮气吹干，即可得到表面干净的金电极。2 DNA修饰电极的制备将活化的金电极浸泡在一定浓度的DNA杂化溶液中，室温下静置4-5天。巯基修饰的DNA通过Au-S键作用自组装于金电极表面，得到DNA修饰电极。3 DNA生物传感器对不同単一金属离子体系的检测将DNA修饰电极在K3 [Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN) 6]溶液中进行电化学阻抗测量，测完后用缓冲溶液淋洗，并分别放置在一定浓度的Hg2+、Pb2+、Co2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Cd2+、Zn2+等溶液中作用，然后再进行电化学阻抗测量，比较作用前后阻抗值的变化。
4 DNA生物传感器对Hg2+和Pb2+共存体系中的单独检测将DNA修饰电极分别依次放置在Hg2++cysteine及Hg2++cysteine+Pb2+溶液中，Pb2++G-DNA及Pb2++G-DNA+Hg2+溶液中作用，并分别对作用后的DNA修饰电极进行电化学阻抗测量，分别比较作用前后阻抗值的变化。与现有技术相比本专利技术具有以下优点I.本发明所采用的DNA序列可特异性识别Hg2+和Pb2+，能排除其它常见ニ价金属离子对体系的干扰，对Hg2+和Pb2+的检测具有较好的选择性；2.本发明是通过Au-S键将DNA组装于金电极表面，该方法得到的DNA膜表面结构高度有序，稳定性好，受环境干扰和限制少；3.本发明所采用的电化学交流阻抗法是研究电极界面现象的ー种重要手段，可灵敏的表征电极表面DNA构型的变化情況，能实现对Hg2+和Pb2+的高灵敏度检测；4.本发明所米用的掩蔽剂-半胱氨酸和G-DNA均属于生物试剂,不具有毒性。


图I为裸电极(·)及DNA修饰电极(ロ)的阻抗谱图。图2为DNA膜与Hg2+(KT6M)和Pb2+(KT6M)作用前后的阻抗谱图DNA膜(□)，与Hg2+ 作用(▲ )，Pb2+ 作用(·)。图3为电荷传递电阻的变化值Λ Rct与Hg2+和Pb2+浓度对数关系曲线，(·)为空白对照。图4为DNA修饰电极对不同金属离子的Λ Rct响应情况。图5为DNA修饰电极与加入掩蔽剂的金属离子作用前后的阻抗谱图，(A)DNA 膜(□ )，Cys+Hg2+( · )，Cys+Hg2+Pb2+( ▲ ) ;(B)DNA 膜(□ )，G_DNA+Pb2+( ·)，G-DNA+Pb2++Hg2+( ▲)。
具体实施例方式以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述实施不构成对本发明的限制。实施例I :Hg2+单独的检测将制备的DNA修饰电极用缓冲溶液充分淋洗后，在K3 [Fe (CN)6]/K4 [Fe (CN)6]溶液中进行电化学阻抗测量。测完后洗净电极，然后分别放置在不同浓度的H2+溶液中作用，用Tris-ClO4缓冲溶液冲洗后再进行电化学測量。作用前后DNA修饰电极膜电容和膜电阻等的变化见表I。表IDNA修饰电极与Hg2+作用前后的阻抗数据拟合结果
权利要求
1.ー种基于电化学DNA生物传感器的Pb2+、Hg2+同时测定方法，其特征在于包括以下步骤 (A)电极的预处理与活化 将金电极在抛光布上用Al2O3粉末抛光至镜面，依次在こ醇和去离子水中超声，然后在H2SO4溶液中进行活化处理，用去离子水冲洗干净，用氮气吹干，即可得到表面干净的金电扱。
(B)DNA修饰电极的制备 将活化的金电极浸泡在一定浓度的杂化DNA溶液中，室温下静置4-5天。巯基修饰的DNA通过Au-S键作用自组装于金电极表面，得到DNA修饰电极。
(C)DNA生物传感器对不同単一金属离子体系的检测 将DNA修饰电极在K3 [Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN) 6]溶液中进行电化学阻抗测量，测完后用缓冲溶液淋洗，并分别放置在一定浓度的 Hg2+、Pb2+、Co2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Cd2+、Zn2+等溶液中作用，然后再进行电化学阻抗测量，比较作用前后阻抗值的变化。
(D)DNA生物传感器对Hg2+和Pb2+共存体系中的单独检测 将DNA修饰电极分别依次放置在Hg2++cy steine及Hg2++cysteine+Pb2+溶液中，Pb2++G-DNA及Pb2++G-DNA+Hg2+溶液中作用，并分别对作用后的DNA修饰电极进行电化学阻抗测量，分别比较作用前后阻抗值的变化。
2.根据权利要求I所述ー种基于电化学DNA传感器的Pb2+、Hg2+同时测定方法,其特征在于步骤(A)所述抛光布为鹿皮抛光布，Al2O3粉末粒径为O. 05 μ m, H2SO4浓度为1M。
3.根据权利要求I所述ー种基于电化学DNA传感器的Pb2+、Hg2+同时测定方法,其特征在于步骤(A)所述依次在こ醇、去离子水中超声，超声时间分别为3min。
4.根据权利要求I所述ー种基于电化学DNA传感器的Pb2+、Hg2+同时测定方法,其特征在于步骤(A)所述电极用去离子水冲洗后，用高纯N2吹干。
5.根据权利要求I所述ー种基于电化学DNA传感器的Pb2+、Hg2+同时测定方法,其特征在于步骤(B)所述杂化DNA包含三部分巯基修饰的DNA片段，Pb2+特异性识别酶DNAzyme, Hg2+ 特异性识别 DNA 片段 substrate DNA。
6.根据权利要求I所述ー种基于电化学DNA传感器的Pb2+、Hg2+同时测定方法,其特征在于步骤(B)所述杂化DNA溶液的浓度为10/3 μ Μ，溶液为高离子強度的Tris-ClO4缓冲溶液，pH = 7. 4。
7.根据权利要求I所述ー种基于电化学DNA传感器的Pb2+、Hg2+同时测定方法,其特征在于步骤(B)所述DNA杂化的温度为常温，杂化时间为一天。
8.根据权利要求I所述ー种基于电化学DNA传感器的Pb2+、Hg2+同时测定方法,其特征在于步骤(B)所述杂化后DNA与金电极作用时间为4-5天，温度为室温。
9.根据权利要求I所述ー种基于电化学DNA传感器的Pb2+、Hg2+同时测定方法,其特征在于步骤(C)所述电化学阻抗测量在封闭的法拉第箱中进行，电化学阻抗测量采用三电极系统，其中Ag/AgCl (饱和KCl溶液)为參比电极，钼丝为对电极。
10.根据权利要求I一种所述基于电化学DNA传感器的Pb2+、Hg2+同时测定方法,其特征在于步骤(C)所述K3 [Fe (CN)6]/K4 [Fe (CN)6]溶液的浓度为4mM。
11.根据权利要求I所述ー种基于电化学DNA传感器的Pb2+、Hg2+同时测定方法,其特征在于步骤(C)所述该传感器只对Pb2+、Hg2+有选择性，而对其它金属离子无选择性作用。
12.根据权利要求I所述ー种基于电化学DNA传感器的Pb2+、Hg2+同时测定方法,其特征在于步骤Φ)所述G-DNA为Pb2+特异性识别DNA片段，浓度为10 μ Μ。
全文摘要
本发明涉及基于汞离子、铅离子诱导DNA构型发生改变的电化学DNA传感器的制备及其应用，属于分析化学和化学传感器技术领域。本发明通过设计含有两部分功能区——能够特异性识别汞、铅两种离子的DNA序列，并将其组装于金电极表面制成电化学DNA生物传感器。本发明所制备的传感器既可应用于实际水体中汞离子和铅离子单一体系的检测，亦可通过引入掩蔽剂实现混合体系中两种离子的单独检测。该DNA传感器制备方法条件温和，简单方便，稳定性好，此外，该传感器具有有高特异性、高灵敏度和高选择性的优点，且操作简单、检测时无需标记。
文档编号G01N27/02GK102721728SQ201110362079
公开日2012年10月10日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者刘新会, 成登苗, 李晓宏, 梁刚, 石柳 申请人:北京师范大学