专利名称：一种构建蔷薇属植物染色体物理图谱的方法
技术领域：
本发明涉及植物分子细胞遗传学领域，具体是一种利用激光共聚焦显微镜构建蔷薇属植物染色体物理图谱的方法。
背景技术：
构建植物染色体物理图谱主要采用染色体荧光原位杂交的方法。染色体荧光原位杂交(fluorescence in situ hybrisization，FISH)是指用携带经特殊修饰核苷酸标记的 DNA探针直接与染色体解链后的DNA单链杂交，再用偶联有荧光素分子的单克隆抗体与探针上标记物质的特异性免疫反应，来直观的检测DNA分子在染色体上的位置和分布，从而构建目的基因的染色体物理图谱。它是分子细胞遗传学研究及植物育种中供体基因渗入分析的最有效的方法之一。
常规的荧光原位杂交方法已可在很多植物中普遍应用。但由于蔷薇属中大多数植物种子萌发困难，生产中常用嫁接方法进行繁殖，植株根系实为砧木的根系，因此只能选用茎尖为制片材料。而蔷薇属茎尖相对于根尖其细胞内含物较多、细胞壁较厚，且蔷薇属植物的染色体为小型染色体(平均长度3 μ m)等这一系列问题，导致一般的荧光原位杂交方法应用于蔷薇属植物，无法稳定地构建清晰的染色体物理图谱，限制了分子细胞遗传学在蔷薇属植物研究中的应用。发明内容
本发明的目的是针对蔷薇属植物的特点，提供一种利用激光共聚焦显微镜构建蔷薇属植物染色体物理图谱的方法。
本发明中的蔷薇属植物指蔷薇科蔷薇属Ofesa Linnaeus)内的各野生分类种 (species)禾口栽培品种(cultivar)。
本发明的构建蔷薇属植物染色体物理图谱的方法是以改良的酶解去壁低渗法制备有丝分裂中期染色体制片；探针标记采用缺口平移法，用经地高辛 (Digoxigenin-11-dUTP)修饰的核苷酸标记携带目的基因的质粒DNA，使之成为杂交探针。 然后用DNA探针直接与染色体变性后的DNA单链杂交，再用偶联有罗丹明ahodamine)的抗地高辛抗体(Anti-digoxigenin)与探针上标记的地高辛(Digoxigenin-ll-dUTP)进行特异性免疫反应，检测目的基因在染色体上的位置和分布得到染色体物理图谱。具体方法如下1、染色体制备1)材料的采集、预处理与保存在天气晴朗的春季上午，选取刚萌发且无病虫害的月月粉营养芽，采集其茎尖2-3cm，用镊子剥去茎尖外部的幼叶，切取茎尖约l_2cm，将茎尖放于 1 1配置的0. 002mol/l的8-羟基喹啉和0. 02%的秋水仙素的预处理液中3_4小时，将茎尖从预处理液中取出后，用无菌水冲洗3次，然后放于0. 075mol/l的氯化钾溶液中30分钟，把茎尖从氯化钾溶液中取出后，用无菌水冲洗3次，然后放于卡诺固定液(无水乙醇冰乙酸=3v :lv)中，固定过夜，将茎尖从固定液中取出，用无菌水冲洗3次，然后放于70%的乙醇溶液中，置于4°C冰箱中，(可长期)保存备用；2)染色体制片将月月粉的茎尖从保存液中取出，用无菌水冲洗3次后，在体式解剖镜下，无菌环境条件中分离出茎尖生长点，切取l_2mm放于0. 25-0. lmol/1盐酸溶液中10-15 分钟，将酸解后的茎尖生长点用无菌水冲洗干净，放于2% -5%纤维素酶和-3%果胶酶的混合液中酶解，于37°C酶解3-4小时，把酶解完全的茎尖生长点用无菌水轻轻冲洗2次， 放于37°C的无菌水中，低渗90分钟；将低渗液去除，加入卡诺固定液(无水乙醇冰乙酸= 3v Iv)中，涡旋混勻，使之成为原生质体悬液，将悬液3000rpm离心，去除上清液，再次加入卡诺固定液重悬，涡旋混勻，吸取悬液，滴于事先清洗并冰冻的防脱载玻片上，将悬液均勻吹开，并迅速置于酒精灯外焰烘烤2-3秒，然后空气干燥，制备好的制片于普通光学显微镜下，用40X物镜观察，选取有较多分裂中期相且染色体分散较好的制片，放于玻片盒中，并置于-20°C冰箱中，(可长期)保存；2、探针标记1)探针纯度和浓度检测用吸收光谱核酸检测法——用双蒸水去除背景，然后把连接有45SrDNA片段的质粒稀释后，分别测出波长为260nm和280nm时的吸光值A26tl和A28tl, 根据双链DNA计算方法，算出质粒双链DNA的纯度和浓度，选取纯度大于1. 8，浓度大于 62. 5 μ g/ml的质粒进行以下实验；2)探针标记采用缺口平移法，用地高辛(Digoxigenin-11-dUTP，罗氏Roche公司) 标记该质粒，即每个反应体系含1μ g质粒DNA和地高辛标记试剂(Digoxigenin Nick Translation)，于15°C下反应90分钟，终止反应后，于_20°C保存备用；3、染色体荧光原位杂交将步骤1保存的月月粉染色体制片于60°C烘干1-2小时，滴加10 μ g/ml胃蛋白酶溶液于制片上表面，放于37 °C恒温培养箱中20-40分钟；用2XSSC漂洗5分钟，用 75% -95% -100% (体积百分含量)乙醇依次脱水3次各5分钟，空气干燥；于70°C -80°C 下在70%甲酰胺(体积百分含量)中变性后，立即在75% -95% -100% (体积百分含量)冷乙醇依次脱水3次各5分钟，空气干燥，配置含50 %甲酰胺(体积百分含量)、10%硫酸葡聚糖、23% 2 X SSC,3%鲑鱼精DNA、14%地高辛标记探针的杂交液，将杂交液于80°C _90°C变性后，迅速放于冰水中10-20分钟，将杂交混合液均勻地滴加到染色体制片上，于37°C杂交过夜；4、信号检测在37°C下用2 X SSC洗脱2次，每次5分钟，然后在室温下分别用2 X SSC、1 XPBS各洗脱1次，每次5分钟，滴干载玻片，信号检测采用结合罗丹明ahodamine)的抗地高辛抗体(Anti-digoxigenin，罗氏Roche公司)试剂盒，与抗体结合完成后，用IX PBS洗脱3次， 每次5分钟，滴干载玻片，用DAPI (4，6-diamidino-2-phenylindole)浸染5分钟，再次用 1 χ PBS洗脱3次，每次5分钟，滴干载玻片，在载玻片上滴加抗荧光淬灭封片剂，挤出多余液体，封片，空气干燥，在激光共聚焦显微镜下先用普通光源找到染色体，再用激光扫描，去除背景后拍照得到染色体物理图谱。
本发明所述植物可为蔷薇属内的各野生分类种(species)和栽培品种 (Cultivar)0
本发明在一般荧光原位杂交方法的基础上，改良酶解去壁低渗法制备有丝分裂中期染色体制片，在制片时通过离心机和涡旋仪的机械力更好的分散出无细胞膜包裹的染色体，使染色体充分铺展在一个平面上。针对染色体为小型染色体且细胞内含物较多的蔷薇属植物染色体制片，能够稳定的获得足够细胞分裂中期相且染色体分散较好、无细胞膜包裹的优质染色体制片。然后，在探针标记前先检测质粒DNA的浓度和纯度，保证探针的质量；在杂交时使用适宜的胃蛋白酶处理，使探针更易穿透细胞膜并与靶染色体结合；在检测过程中，采用激光扫描的共聚焦显微镜，与一般荧光显微镜相比，其检测更灵敏，不需要3 个抗体进行信号放大，且可自动去除背景，并可检测信号之间的强弱，用于定量分析。利用本发明的方法具有如下优点针对染色体为小型染色体且细胞内含物较多的蔷薇属植物荧光原位杂交，能够稳定地获得清晰的染色体物理图谱。本发明对蔷薇属的植物具有普遍适用、易操作的特点。
图1为染色体荧光原位杂交前的月月粉Ofesa cAi/^asis ‘Pallida，，2n = 2x) 分裂间期染色体图。
图2为用45SrDNA探针进行染色体荧光原位杂交后的月月粉Ofesa chinensis ‘Pallida，，2n = 2x)分裂间期染色体图，红色点为杂交位点。45SrDNA基因定位于细胞核外侧。
图3为染色体荧光原位杂交前的月月粉Obm chinensis ‘Pallida，，2n = 2x) 分裂中期染色体图。
图4为用45SrDNA探针进行染色体荧光原位杂交后的月月粉Ofesa chinensis ‘Pallida，，2η = 2x)分裂中期染色体图，红色点为杂交位点。45SrDNA基因定位于染色体近端部。
具体实施方式
以下的实施为便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂供应商购买得到。以下百分含量，如无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例中所用的蔷薇属植物材料为栽培品种月月粉(Tfom chinensis ‘Pallida’，2n = 2x),由云南省农业科学院花卉研究所木本花卉中心收集，保存于云南省农业科学院花卉研究所实验基地内。
实施例1 1、染色体制备1)材料的采集、预处理与保存在天气晴朗的春季上午，选取刚萌发且无病虫害的月月粉营养芽，采集其茎尖2-3cm， 放于装有无菌水的采集袋中。将采集袋置于冰盒内，于1小时内运输至实验室进行预处理。 在实验室用镊子小心剥去茎尖外部的幼叶，切取茎尖约l-2cm。将茎尖放于0. 002mol/l的 8-羟基喹啉和0. 02%的秋水仙素的1 :1配置的预处理液中3-4小时。将茎尖从预处理液中取出后，用无菌水冲洗3次，然后放于0. 075mol/l的氯化钾溶液中30分钟。把茎尖从氯化钾溶液中取出后，用无菌水冲洗3次，然后放于卡诺固定液(无水乙醇冰乙酸=3v :lv) 中，固定过夜。将茎尖从固定液中取出，用无菌水冲洗3次，然后放于70%的乙醇溶液中，置于4°C冰箱中，可长期保存备用。
2)染色体制片将月月粉的茎尖从保存液中取出，用无菌水冲洗3次。然后，在体式解剖镜下，用镊子及解剖针在无菌环境条件中分离出茎尖生长点，用手术刀切取l_2mm。切取的茎尖生长点放于0. 25mol/l盐酸溶液中10分钟。将酸解后的茎尖生长点用无菌水冲洗干净，放于2%纤维素酶和果胶酶的混合液中酶解，于37°C酶解3-4小时。把酶解完全的茎尖生长点用无菌水轻轻冲洗2次，放于37°C的无菌水中，低渗90分钟。将低渗液去除，加入卡诺固定液(无水乙醇冰乙酸=3v :lv)中，涡旋混勻，使之成为原生质体悬液。将悬液3000rpm离心，去除上清液。再次加入卡诺固定液重悬，涡旋混勻。吸取悬液，滴于事先清洗并冰冻的防脱载玻片上，将悬液均勻吹开，并迅速置于酒精灯外焰烘烤2-3秒，然后空气干燥。制备好的制片于普通光学显微镜下，用40X物镜下观察。选取有较多分裂中期相且染色体分散较好的制片，放于玻片盒中，并置于-20°C冰箱中，可长期保存。
2、探针标记1)探针纯度和浓度检测用吸收光谱核酸检测法——用双蒸水去除背景，然后把连接有45SrDNA片段的质粒稀释后，分别测出波长为260nm和280nm时的吸光值A26tl和A28tl。 根据双链DNA计算方法，算出质粒双链DNA的纯度和浓度。选取纯度大于1. 8，浓度大于 62. 5 μ g/ml的质粒进行下述实验。
2)探针标记采用缺口平移法，用地高辛(Digoxigenin-11-dUTP，罗氏Roche公司)标记该质粒。即每个反应体系含1 μ g质粒DNA和地高辛标记试剂(Digoxigenin Nick Translation)，于15°C下反应90分钟。终止反应后，于_20°C保存备用。
3、染色体荧光原位杂交将步骤1保存的月月粉染色体制片于60°C烘干1-2小时，滴加10 μ g/ml胃蛋白酶溶液于制片上表面，放于37 °C恒温培养箱中20-40分钟；用2XSSC漂洗5分钟，用 75% -95% -100% (体积百分含量)乙醇依次脱水3次各5分钟，空气干燥。于70°C -80°C 下在70%甲酰胺(体积百分含量)中变性后，立即在75% -95% -100% (体积百分含量)冷乙醇依次脱水3次各5分钟，空气干燥；配置含50%甲酰胺(体积百分含量)、10%硫酸葡聚糖、23% 2 X SSC,3%鲑鱼精DNA、14%地高辛标记探针的杂交液，将杂交液于80°C _90°C变性后，迅速放于冰水中10-20分钟。将杂交混合液均勻地滴加到染色体制片上，于37°C杂交过夜。4、信号检测在37°C下用2 X SSC洗脱2次，每次5分钟，然后在室温下分别用2 X SSC、1 X PBS各洗脱1次，每次5分钟，滴干载玻片。信号检测采用结合罗丹明ahodamine)的抗地高辛抗体 (Anti-digoxigenin，罗氏Roche公司)试剂盒。与抗体结合完成后，用IXPBS洗脱3次， 每次5分钟。滴干载玻片，用DAPI (4，6-diamidino-2-phenylindole)浸染5分钟，再次用 IXPBS洗脱3次，每次5分钟。滴干载玻片，在载玻片上滴加抗荧光淬灭封片剂，挤出多余液体，封片，空气干燥。在激光共聚焦显微镜下先用普通光源找到染色体，再用激光扫描，去除背景后拍照得到染色体物理图谱。
实施例2 1、染色体制备1)材料的采集、预处理与保存在天气晴朗的春季上午，选取刚萌发且无病虫害的月月粉营养芽，采集其茎尖2-3cm， 放于装有无菌水的采集袋中。将采集袋置于冰盒内，于1小时内运输至实验室进行预处理。 在实验室用镊子小心剥去茎尖外部的幼叶，切取茎尖约l-2cm。将茎尖放于0. 002mol/l的 8-羟基喹啉和0. 02%的秋水仙素的1 :1配置的预处理液中3-4小时。将茎尖从预处理液中取出后，用无菌水冲洗3次，然后放于0.075mol/l的氯化钾溶液中30分钟。把茎尖从氯化钾溶液中取出后，用无菌水冲洗3次，然后放于卡诺固定液(无水乙醇冰乙酸=3v:lv) 中，固定过夜。将茎尖从固定液中取出，用无菌水冲洗3次，然后放于70%的乙醇溶液中，置于4°C冰箱中，可长期保存备用。
2)染色体制片将月月粉的茎尖从保存液中取出，用无菌水冲洗3次。然后，在体式解剖镜下，用镊子及解剖针在无菌环境条件中分离出茎尖生长点，用手术刀切取l_2mm。切取的茎尖生长点放于0. lmol/1盐酸溶液中15分钟。将酸解后的茎尖生长点用无菌水冲洗干净，放于5%纤维素酶和3%果胶酶的混合液中酶解，于37°C酶解3-4小时。把酶解完全的茎尖生长点用无菌水轻轻冲洗2次，放于37°C的无菌水中，低渗90分钟。将低渗液去除，加入卡诺固定液(无水乙醇冰乙酸=3v :lv)中，涡旋混勻，使之成为原生质体悬液。将悬液3000rpm离心，去除上清液。再次加入卡诺固定液重悬，涡旋混勻。吸取悬液，滴于事先清洗并冰冻的防脱载玻片上，将悬液均勻吹开，并迅速置于酒精灯外焰烘烤2-3秒，然后空气干燥。制备好的制片于普通光学显微镜下，用40X物镜下观察。选取有较多分裂中期相且染色体分散较好的制片，放于玻片盒中，并置于-20°C冰箱中，可长期保存。
2、3、4步骤与实施例1相同。
权利要求
1. 一种构建蔷薇属植物染色体物理图谱的方法，其特征在于按以下步骤进行1)染色体制备(1)材料的采集、预处理与保存在天气晴朗的春季上午，选取刚萌发且无病虫害的月月粉营养芽，采集其茎尖2-3cm，用镊子剥去茎尖外部的幼叶，切取茎尖约l-2cm，将茎尖放于1 :1配置的0. 002mol/l的8-羟基喹啉和0. 02%的秋水仙素的预处理液中3_4小时，将茎尖从预处理液中取出后，用无菌水冲洗3次，然后放于0. 075mol/l的氯化钾溶液中30分钟，把茎尖从氯化钾溶液中取出后，用无菌水冲洗3次，然后放于由无水乙醇冰乙酸=3v Iv配制的卡诺固定液中，固定过夜，将茎尖从固定液中取出，用无菌水冲洗3次，然后放于 70%的乙醇溶液中，置于4°C冰箱中，保存备用；(2)染色体制片将月月粉的茎尖从保存液中取出，用无菌水冲洗3次后，在体式解剖镜下，无菌环境条件中分离出茎尖生长点，切取l_2mm放于0. 25-0. lmol/1盐酸溶液中 10-15分钟，将酸解后的茎尖生长点用无菌水冲洗干净，放于2% -5%纤维素酶和-3% 果胶酶的混合液中酶解，于37°C酶解3-4小时，把酶解完全的茎尖生长点用无菌水轻轻冲洗2次，放于37°C的无菌水中，低渗90分钟；将低渗液去除，加入由无水乙醇冰乙酸=3v Iv配制的卡诺固定液中，涡旋混勻，使之成为原生质体悬液，将悬液3000rpm离心，去除上清液，再次加入卡诺固定液重悬，涡旋混勻，吸取悬液，滴于事先清洗并冰冻的防脱载玻片上，将悬液均勻吹开，并迅速置于酒精灯外焰烘烤2-3秒，然后空气干燥，制备好的制片于普通光学显微镜下，用40X物镜观察，选取有较多分裂中期相且染色体分散较好的制片， 放于玻片盒中，并置于-20°C冰箱中，保存；2)探针标记(1)探针纯度和浓度检测用双蒸水去除背景，然后把连接有45SrDNA片段的质粒稀释后，分别测出波长为260nm和^Onm时的吸光值A26tl和A28tl,根据双链DNA计算方法，算出质粒双链DNA的纯度和浓度，选取纯度大于1. 8，浓度大于62. 5 μ g/ml的质粒进行以下实验；(2)探针标记采用缺口平移法，用地高辛标记该质粒，即每个反应体系含1μ g质粒 DNA和地高辛标记试剂，于15°C下反应90分钟，终止反应后，于-20°C保存备用；3)染色体荧光原位杂交将步骤1)保存的月月粉染色体制片于60°C烘干1-2小时，滴加10 μ g/ml胃蛋白酶溶液于制片上表面，放于37°C恒温培养箱中20-40分钟；用2XSSC漂洗5分钟，用体积百分含量75% -95% -100%乙醇依次脱水3次各5分钟，空气干燥；于70°C _80°C下在体积百分含量70%甲酰胺中变性后，立即在体积百分含量75% -95% -100%冷乙醇依次脱水3次各5分钟，空气干燥，配置含体积百分含量50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、23% 2XSSC、3%鲑鱼精DNA、14%地高辛标记探针的杂交液，将杂交液于80°C -90°C变性后，迅速放于冰水中 10-20分钟，将杂交混合液均勻地滴加到染色体制片上，于37°C杂交过夜；4)信号检测在37°C下用2XSSC洗脱2次，每次5分钟，然后在室温下分别用2XSSC、1XPBS 各洗脱1次，每次5分钟，滴干载玻片，信号检测采用结合罗丹明的抗地高辛抗体试剂盒，与抗体结合完成后，用IXPBS洗脱3次，每次5分钟，滴干载玻片，用DAPI (4，6-diamidino-2-phenylindole)浸染5分钟，再次用1 XPBS洗脱3次，每次5分钟，滴干载玻片，在载玻片上滴加抗荧光淬灭封片剂，挤出多余液体，封片，空气干燥，在激光共聚焦显微镜下先用普通光源找到染色体，再用激光扫描，去除背景后拍照得到染色体物理图谱。
全文摘要
本发明是一种构建蔷薇属植物染色体物理图谱的方法。以改良的酶解去壁低渗法制备有丝分裂中期染色体制片；探针标记采用缺口平移法，用经地高辛修饰的核苷酸标记携带目的基因的质粒DNA，使之成为杂交探针。然后用DNA探针直接与染色体变性后的DNA单链杂交，再用偶联有罗丹明的抗地高辛抗体与探针上标记的地高辛进行特异性免疫反应，检测目的基因在染色体上的位置和分布得到染色体物理图谱。本发明的优点针对染色体为小型染色体且细胞内含物较多的蔷薇属植物荧光原位杂交，能够稳定地获得清晰的染色体物理图谱，对蔷薇属的植物具有普遍适用、易操作。
文档编号G01N21/64GK102492771SQ201110390460
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月1日 优先权日2011年12月1日
发明者唐开学, 张婷, 张颢, 王其刚, 田敏, 蹇洪英 申请人:云南省农业科学院花卉研究所