专利名称：一种测定痕量曲普瑞林的方法
技术领域：
本发明涉及一种采用液相色谱与质谱联用技术测定痕量曲普瑞林的方法。
背景技术：
曲普瑞林是人工合成的十肽，为促性腺激素释放激素(GnRH)的类似物。其结构的改良是将天然分子结构中的第六个左旋氨基酸(甘氨酸)，以右旋色氨酸取代。曲普瑞林作用与GnRH相同，但其血浆半衰期延长且对GnRH受体的亲和力更强，因此曲普瑞林成为GnRH受体的强力激动剂。曲普瑞林注射后，最初会刺激垂体分泌促性腺激素(Gn)，即黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)。当垂体经过长期的刺激后会进入不应期，促性腺激素的释放会减少，因而使性类固醇(睾丸酮或雌激素)降低至去势水平。上述作用是可逆转的。临床上曲普瑞林被用于治疗各种激素依赖性疾病如前列腺癌、子宫内膜异位、子宫肌瘤和性早熟。曲普瑞林已上市的产品主要有注射剂和长效缓释微球制剂，曲普瑞林临床常用剂量:每天一次皮下注射0.5毫克，连续七天，然后每天一次皮下注射0.1毫克，作为维持剂量；体外授精术(IVF)每天一次皮下注射0.5毫克，七至十天，然后每天一次皮下注射0.1毫克。曲普瑞林临床应用的不良反应是由于激素的产生被抑制而可能引起的药理副作用，因此临床治疗时应密切监测性类固醇血浆水平。曲普瑞林临床极低的用量，就可能引起极强的临床不良反应，这些情况都迫切需要建立一种操作简单，特异性好及高灵敏的痕量曲普瑞林检测技术，目前血浆及排泄物等生物样品中痕量曲普瑞林的检测是利用放射免疫法进行测定，由于它测定的是蛋白多肽的特异性片段，样品中其他有抗原决定簇的代谢片段或者曲普瑞林的自身降解产物也能和免疫试剂反应，增加结果误差，并且其具有放射性，对检测人员有潜在的伤害可能；且其试剂盒非常昂贵，必须配备高级仪器设备，不适合临床及科研使用。
发明内容
针对现有技术存在的上述缺陷，本发明人进行深入研究，提供一种操作简单、结果准确、特异性好、灵敏度高的痕量曲普瑞林的测定方法。所述方法采用液相色谱与质谱联用技术，其高效液相的流动相采用含酸的水溶液-甲醇体系进行梯度洗脱，所述酸为乙酸或丙酸，优选为乙酸；酸的体积百分浓度0.01-0.1%，优选为0.01-0.05%，更优选为0.02%。所述体积百分浓度为IOOml水中所含酸的体积(ml)数。在液质联用方法中，液相色谱流动相的选择具有非常重要的作用。本发明所述流动相的有机相选择甲醇，相比乙腈等其他有机溶剂，甲醇在测定痕量曲普瑞林时有更高的响应值和较好的色谱行为；流动相的水相中添加酸可明显提高方法的灵敏度，其中添加乙酸或丙酸比甲酸等其他酸，可以显著提高检测限近十倍。所述检测限是指在样品中能检出的被测组分的最低浓度(量)，即产生信号(峰高)为基线噪音标准差k倍时的样品浓度，一般将检测限定义为信噪比(S/N) 3: I时的浓度。所述梯度洗脱含酸水溶液和甲醇的体积比具体如下表，其中第三时间段可省略，但优选含有第三时间段，可减少连续进样后柱压升高和噪音。
权利要求
1.一种测定痕量曲普瑞林的方法，其特征在于采用液相色谱与质谱联用技术，高效液相的流动相采用含酸的水溶液-甲醇体系进行梯度洗脱，所述酸为乙酸或丙酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于酸的体积百分浓度为0.01-0.1 %。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于酸的体积百分浓度为0.01% -0.05%。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于酸的体积百分浓度为0.02%。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在酸为乙酸。
6.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于高效液相色谱梯度洗脱为，第一时间段含酸的水溶液A与甲醇B的体积比为75-95: 25-5;第二时间段A与B的体积比为30-50: 70-50 ;第三时间段A与B体积比为0_10: 100-90 ;第四时间段A与B的体积比为 75-95: 25-5。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于省略第三时间段。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于第一时间段A与B的体积比为90: 10;第二时间段A与B的体积比为40: 60;第三时间段A与B的体积比为2: 98;第四时间段A与B的体积比为90: 10。
9.根据权利要求1-4任一所述的方法，用于哺乳动物在使用曲普瑞林制剂后，检测体内曲普瑞林的含量变化及代谢研究的用途。
全文摘要
本发明涉及一种测定痕量曲普瑞林的方法，采用液相色谱与质谱联用技术对样品中痕量曲普瑞林进行测定，该方法操作简单、结果准确、特异性好、灵敏度高。本发明还涉及所述测定方法用于定性或定量检测生物样品中的曲普瑞林的含量及其曲普瑞林制剂药代动力学研究的用途。
文档编号G01N30/06GK103163258SQ201110409108
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者韩江彬, 沙春洁, 宋涛, 王涛, 孙考祥, 刘万卉 申请人:山东绿叶制药有限公司