专利名称：快速检测微囊藻毒素的方法和试纸的制作方法
技术领域：
本发明涉及水样检测方法和试剂，具体为一种快速检测微囊藻毒素的方法和试纸。
背景技术：
随着工业化、城市化的发展以及农业生产大量使用化肥，大量的营养物质注入水体，湖泊富营养化日益严重，导致藻类迅猛生长，蓝藻的过度繁殖，会造成水味腥臭、透明度下降、消耗水体溶解氧，其中的微囊藻属、颤藻属、鱼腥藻属、念珠藻属等藻类自身及其代谢产物有毒性和致癌作用，危害人体健康。调查显示，我国淡水湖泊中发生的水华80%是有毒的，在有毒蓝藻水华产生的毒素中，微囊藻毒素(Microcystin，MC)是分布最广、毒性最大的种类之一。微囊藻毒素(Microcystins)是一种环肽肝毒素，目前已发现MCs达70多种同分异构体，其中最为常见并且已经商业化提取的是MC-LR、MC-YR、MC-RR、MC-LF, MC-LW，L、R、 Y、F、W分别代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸。微囊藻毒素能够抑制丝氨酸和苏氨酸蛋白磷酸酶I(PPl)和2A(PP2A)的活性，在低浓度时对肝脏就有专有肝毒性和癌诱发活性，MCs的急性肝中毒症状表现为肝坏死，肝功能丧失和肝出血，对小鼠的腹腔注射的 LD50为40 8001a g/kg，MC-LR是目前研究的最详细且毒性最大。为了降低MCs对人和水生动物的毒性及潜在危害性，世界卫生组织推荐水中微囊藻毒素的安全指导值MC-LR是 1000ng/L。有关MCs的安全标准，各国所建议的安全浓度略有不同，1998年，世界卫生组织 (WHO)出版的《用水卫生基准》中建议饮用水中MCs标准为1. 0 μ g/L，暂定的MC临时可耐受的每日摄取量为0. 04 μ g/kg. dBff ；英、美等国限定天然水体及饮用水中的MCs为1. 0 μ g/L， 加拿大健康组织认为饮用水中可接受的MCs标准为0. 5 μ g/L。我国长期以来都未规定MCs 限量标准，直到2006年，在新颁布的《用水卫生标准》(GB5749-2006)才在毒理增加了微囊藻毒素-LR，同时颁布了《微囊藻毒素检测方法》(GB/T20466-2006)，规定其限值0. OOlmg/ Lmg/L。但鱼类等水产品中MC的限量还没有制定标准，有待进一步的研究。由于淡水是人类及动物的饮水源，淡水水华导致的微囊藻毒素严重危害人类的生命健康，MC也是我国三大肝癌的病因之一，因此MC已受到国内外学者、民众的重视。目前， 检测MC的方法主要是生物法(小鼠法)、高效液相色谱法(HPLC)和免疫检测技术。小鼠法简便易行，但缺点是不能区别毒素的种类和结构，受干扰较大，数据不精确；HPLC法可准确分析毒素的含量和种类，检测限可低至ng/g，但样品前处理过程复杂，且仪器昂贵，需要专门的分析技术人员；免疫层析法是出现于20世纪80年代初期的一种独特的免疫分析方式，由于它的快速简便、准确，具有高度特异性和高敏感性，结果直观可靠，而且试剂和样品用量极少，无需贵重仪器设备，简化了烦琐的常规操作过程，同时也减小了因操作引起的误差，因此已成为一种目前发展最快的复合型免疫技术，受到国内外研究人员的广泛关注。为促进微囊藻及其毒素研究，需要建立一种简单、快速、准确的、系统的检测方法。目前对MC的检测有很多方法，如高效液相色谱(HPLC)、薄层层析法(TLC)、质谱(MQ、酶联免疫吸附试验(ELISA)以及蛋白磷酸酶抑制试验等。此外还有免疫胶体金快速诊断技术是建立在酶联免疫吸附的基础上、以胶体金为作为示踪标志物标记物，通过直接观察就可以判定结果的新技术。该技术具有简单、快速、准确和无污染等优点，在临床医学检测、激素检测食品安全检测、药物残留和毒品快速检测，以及抗原抗体等诸多诊断领域迅速发展，是四大免疫标记技术之一。目前国际国内关于微囊藻毒素检测主要的酶联免疫检测技术(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，我国已有出售美国生产的ELISA检测MC-LR的试剂盒，国内也有几家研制ELISA检测试剂盒，但质量不太高。而关于MC-LR的胶体金检测试纸条技术尚少报道，我国市场也未见有销售。
发明内容
本发明旨在提供一种用于快速检测微囊藻毒素的方法。本发明还提供了快速检测微囊藻毒素的试纸。本发明建立了微囊藻毒素MC-LR的快速胶体金免疫层析检测方法。首先制备了平均粒径30nm左右的胶体金，用以标记抗微囊藻毒素MC-LR单克隆抗体；将微囊藻毒素 MC-LR半抗原与钥孔蓝蛋白的偶联物包被在硝酸纤维素膜上作为检测带，羊抗鼠二抗作为控制带，依据免疫竞争法原理，建立快速检测微囊藻毒素MC-LR的免疫层析试纸条方法。该方法灵敏度可达到3ng/mL，只需3 5min即可目测判断结果，具有快速、直观、操作简单、便于使用等特点，可以作为现场大量筛查淡水及淡水产品是否感染微囊藻毒素MC-LR的有效手段。技术方案为，一种用于快速检测微囊藻毒素的试纸，依次包括点样孔、检测带(T 线)和控制带(C线)；点样孔上喷涂胶体金标记的鼠抗MC-LR单克隆抗体-BSA复合物，检测带为微囊藻毒素MC-LR半抗原与钥孔蓝蛋白的偶联物，控制带上喷涂羊抗鼠二抗。试纸的基材为硝酸纤维素膜或定性滤纸。胶体金标记的鼠抗MC-LR单克隆抗体-BSA复合物的制备方法为(1)将胶体金与鼠抗MC-LR单克隆抗体溶液混合搅拌0. 5 池！·，加入小牛血清BSA继续搅拌20 45min， 其中胶体金与鼠抗MC-LR单克隆抗体和BSA的用量比Iml 5 40 μ g 8 12mg，优选为Iml 20 μ g IOmg ；所述的胶体金粒径在28 3&im ；(2)取沉淀溶解于pH = 7. 3 7. 45缓冲液，鼠抗MC-LR单克隆抗体与缓冲液用量比100 600 μ g/ml，优选为400 μ g/ml，再加入BSA至BSA浓度为8 12mg/ml。胶体金制备方法为将浓度为0. 005% 0. 015%的氯酸金溶液加热至沸腾，加入柠檬酸混勻继续煮沸4 Smin ；氯酸金与柠檬酸的用量比为1 0. 012 0. 0016。鼠抗MC-LR单克隆抗体的制备方法为，取MC-LR半抗原与钥孔蓝蛋白的偶联物与完全福氏佐剂混合孵化后免疫小鼠；10 15天后取MC-LR半抗原与钥孔蓝蛋白的偶联物与不完全福氏佐剂混合孵化后，每10 15天免疫小鼠，共三次。MC-LR半抗原与钥孔蓝蛋白的偶联物制备方法为微囊藻毒素活化后与钥孔蓝蛋白(KLH)混合反应制备，两者重量比为1 6 1 7 ；并用磷酸盐缓冲液PBS透析，取上清液。胶体金标记的鼠抗MC-LR单克隆抗体-BSA复合物中的单抗、MC-LR半抗原与钥孔蓝蛋白的偶联物及羊抗鼠二抗的重量比为1 1.8 2 2 3;优选为1 18.75 2. 5。检测方法为，将待测水样滴加在点样孔内，3 5min内观察显色结果。待测水样与胶体金标记的鼠抗MC-LR单克隆抗体-BSA复合物用量比100 μ 1 0. 25 1. 5 μ g，优选为为 100 μ 1 1 μ g。MC-LR是多肽，无特殊的基团，对于制备单克隆抗体有一定的困难。本研究在成功合成MC-LR完全抗原的基础上获得了高质量的MC-LR单克隆抗体，为成功制备MC-LR胶体金检测试纸条打下了基础。随着人们对MCs危害认识的不断深入，我国卫生部新颁布的《生活饮用水卫生规范》将MC-LR的标准值的列入，快速、简便、经济的微囊藻毒素的检测方法的建立已成为一项刻不容缓的工作。最近，不同国家和地区的31个实验室采用不同方法如高效液相色谱法、 酶联免疫学方法以及蛋白磷酸酶方法测定同一种样品中微囊藻毒素，结果显示在以商业化 MCLR作为标准品来进行定量测定微囊藻毒素时其测定值有明显差异。目前，带有二极管阵列检测器或者连接有质谱的高效液相色谱仪仍是最广泛采用的微囊藻毒素检测手段。高效液相色谱法是一种很有效的检测方法，它不仅能将毒素定性，而且还能够提供准确定量。但是，其所需设备昂贵，对操作人员的专业技术要求高，方法的建立依赖于一系列的标准品， 检测过程往往还需要复杂的前处理，比较消耗时间。以生物学为基础的方法代表了快速、简单的MCs的检测方法。酶联免疫法对样品前处理要求低、设备操作简单、检测灵敏度和选择性高，但是商业化MC S的试剂盒交叉反应变化比较大，一般只能以MCLR当量的形式来定量毒素。免疫金技术将待检物与金标记抗体的结合物又与之发生特异性结合而被截留，可通过肉眼观察到显色结果。具有体积小、携带方便、不需要仪器设备、操作简单、可现场检测、 3 5min出结果及结果可由肉眼根据T线颜色深浅判断等诸多优点，非常适合对大批量样品进行现场初筛，在兽药残留快速检测中颇受关注。本研究在建立了微囊藻毒素的免疫胶体金试纸条检测方法的基础上，对其技术参数和检测指标进行了评定，并初步应用于实际样本检测中，其灵敏度、重复性、批次间的稳定性均很好；目前国内外尚无同类产品销售，只有ELISA检测试纸盒出世，与ELISA试剂盒相比较，我们研制的试纸条价格低廉，操作简单， 检测时间3-5分钟，对使用人员无任何技术要求，在我国专业知识普遍不足的国情下，本产品具有很大的推广价值，有助于提供我国水产品的安全检测。本发明的检测限为2 3ng/ml，与我国饮用水标准1. Ong/ml尚有一定距离，不能检测水样是否符合国家标准，但可以用于大量水样的初步筛查；也可以用于鱼类等水产品的大量筛查。由于胶体金试纸条检测方法简单、结果直观、价格便宜、便于携带，因此，在水样及水产品的大量筛查中有一定的使用价值，与其他复杂的检测方法结合使用，必能降低很多的工作量和节省大量的费用。预计将在检验检疫、食品安全部门及卫生监控部门具有较广的应用前景，有一定的经济和社会效益。同时，可为水产品食用安全检测国际方法的修订或增补提供科学依据。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明试剂与仪器仪器二氧化碳恒温培养箱，超净工作台，酶标仪，37°C恒温培养箱，恒温电磁搅拌器(国华电器)，Biodot喷膜机(基因公司)，切条机(上海韩感电子科技)。电热恒温培养箱(天津中环)。氯金酸，柠檬酸三钠等化学试剂购自上海生工；微囊藻毒素购自北京伊普瑞斯公司；DMS0，水溶性碳二亚胺-NHS (EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，二环己基碳二亚胺(DCC) 及各种交叉反应药物均购自上海生工；牛血清蛋白(BSA)购自四季青生物公司；福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、邻苯二胺(OPD)等为Sigma公司产品；胎牛血清和新生牛血清为四季青生物公司产品，HAT、HTIMDM和高汤培养基购自hyclone公司，PEG2000为Roche公司产品，GAM-HPR，DMSO等购自Merk公司。实施例1完全抗原制备3mg微囊藻毒素溶于1. aiilDMF中，加入100微升活化液(12mg EDC，HCL和7mg NHS 溶于Iml DMF中)，4°C活化反应过夜。取20mg KLH钥孔蓝蛋白溶于5ml pH = 9. 6的碳酸缓冲液中lh，4°C过夜。混合后用0. OlM PBS透析3天，离心取上清，用lorry法测定MCLR-KLH偶联物的浓度1. %ig/ml，然后根据需要稀释为不同的浓度。实施例2单抗(鼠抗MC-LR)的制备 动物免疫适量MCLR-KLH与等体积完全福氏佐剂混合，完全孵化，取5只8周龄雌性BALB/C小鼠，颈背部皮下3点，四肢腋(胭)皮下，以及腹腔注射，每只小鼠注射孵化后抗原500 μ 1 (相当于每只小鼠免疫抗原100 μ g)。14天后，适量MCLH-KLH与等体积不完全福氏佐剂混合，完全孵化后皮下多点及腹腔注射抗原，按此法每14天免疫一次。第三次基础免疫7天后，尾静脉采血检测效价。MCLH-K包被酶标本，间接法测定效价。小鼠血清清梯度稀释(1 1000,1 2000， 1 4000，1 8000，1 16000)，空白BALB/C小鼠血清做阴性对照。细胞融合无菌取免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞以 5 1体积比混合，按常规方法进行融合，融合剂为PEG。细胞筛选融合7天后，在HAT的选择性培养下，SP2/0、未融合的脾细胞都已经死亡，杂交瘤细胞呈集落状生长，融合率100%。取细胞上清间接ELISA进行检测。强阳性孔 26个，弱阳性孔138个。特异性检测选取阳性细胞孔上清做间接竞争ELISA实验，检测上清中抗体的特异性。经过3次亚克隆，8A9和6E12细胞完全纯化，亚克隆的细胞100%阳性。抗体评估采用间接ELISA法测定。将抗体浓度调整到lmg/ml，再用PBS稀释 (1 10000,1 20000,1 40000,1 80000,1 160000,1 320000,1 640000)。最高腹水效价为1 6.4X105。抗体灵敏度检测采用间接竞争ELISA法测定。IC50为0. 81ng/ml。实施例3胶体金的制备参照FrenS1973年介绍的胶体金颗粒的制备方法，取Iml 氯金酸(HAuCl4)溶液，加入到IOOml水中，加热至沸，再加入0. 5 細1 柠檬酸三钠，混合煮沸5min，直到颜色不发生变化。该方法可制备15 60nm不同直径大小的金颗粒，颗粒大小取决于加入的柠檬酸三钠的量。0. 01%氯金酸(HAuCl4)水溶液IOOml加热至沸腾，加入柠檬酸三钠1. 5ml，混勻，煮沸5分钟，待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却备用，得到粒径30nm (士 2nm)的胶体金。 实施例4胶体金对单抗的标记取实施例3所得30nm的胶体金2ml，加200 μ g/ml实施例2制备的单抗0. 2ml，搅拌混勻1小时，再加20mg BSA,继续搅拌30分钟，IOOOOrpm离心30分钟，去上清，沉淀用 PH7. 420mM Tris-HCL 100 μ 1溶解，加BSA至终浓度为10mg/ml，置4°C中备用，得到胶体金标记的鼠抗MC-LR单克隆抗体-BSA复合物(下称为金标鼠抗MC-LR)。实施例5灵敏度的检测用喷金机对实施例4中各不同单抗浓度标记的金标鼠抗MC-LR进行包被，试纸的材料为硝酸纤维素膜；金标鼠抗MC-LR (实施例4制备)喷涂在点样孔，检测线(T线)上喷涂浓度为0. 75mg/ml的鼠抗MC-LR (实施例2制备)，控制线(C线)上喷涂市售的羊抗鼠 IgG抗体(浓度l.Omg/ml)；喷涂量均为2. 5 μ l/cm(喷涂的长度为1cm)，干燥，组装试纸。 即，点样孔内金标鼠抗MC-LR中的单抗用量1 μ g，T线MCLR-KLH用量1. 875 μ g，C线2. 5 μ g 羊抗鼠IgG抗体。测试时，点样孔上分别滴加100 μ 1不同浓度的MC-LR标准品溶液。以各最佳条件制备金标测试条，对各浓度MC-LR标准品作灵敏度检测，结果如下表1不同MC-LR标准品浓度的灵敏度效果比较
权利要求
1.一种快速检测微囊藻毒素的试纸，其特征在于，依次包括点样孔、检测带和控制带； 点样孔上喷涂胶体金标记的鼠抗MC-LR单克隆抗体-BSA复合物，检测带为微囊藻毒素 MC-LR半抗原与钥孔蓝蛋白的偶联物，控制带上喷涂羊抗鼠二抗。
2.权利要求1所述快速检测微囊藻毒素的试纸，其特征在于，试纸的基材为硝酸纤维素膜或定性滤纸。
3.权利要求1所述快速检测微囊藻毒素的试纸，其特征在于，所述胶体金标记的鼠抗 MC-LR单克隆抗体-BSA复合物中的单抗、MC-LR半抗原与钥孔蓝蛋白的偶联物及羊抗鼠二抗的重量比为1 1.8 2 2 3。
4.权利要求1或3所述快速检测微囊藻毒素的试纸，其特征在于，所述胶体金标记的鼠抗MC-LR单克隆抗体-BSA复合物中的单抗、MC-LR半抗原与钥孔蓝蛋白的偶联物及羊抗鼠二抗的重量比为1 18.75 2.5。
5.权利要求1所述快速检测微囊藻毒素的试纸，其特征在于，所述胶体金标记的鼠抗 MC-LR单克隆抗体-BSA复合物的制备方法为(1)将胶体金与鼠抗MC-LR单克隆抗体溶液混合搅拌0. 5 》ir，加入小牛血清BSA继续搅拌20 45min，其中胶体金与鼠抗MC-LR单克隆抗体和BSA的用量比Iml 5 40 μ g 8 12mg ；所述的胶体金粒径在观 32nm，其制备方法为将浓度为0. 005 % 0. 015 %的氯酸金溶液加热至沸腾，加入柠檬酸混勻继续煮沸4 Smin ；氯酸金与柠檬酸的用量比为 1 0. 012 0. 0016 ；(2)取沉淀溶解于pH = 7. 3 7. 45缓冲液，鼠抗MC-LR单克隆抗体与缓冲液用量比 100 600 μ g/ml，再加入BSA至BSA浓度为8 12mg/ml。
6.权利要求5所述快速检测微囊藻毒素的试纸，其特征在于，步骤(1)中胶体金与鼠抗 MC-LR单克隆抗体和BSA的用量比为Iml 20 μ g IOmg ；步骤(2)中鼠抗MC-LR单克隆抗体与缓冲液用量比为400 μ g/ml。
7.权利要求1所述快速检测微囊藻毒素的试纸，其特征在于，所述微囊藻毒素MC-LR半抗原与钥孔蓝蛋白的偶联物的制备方法为微囊藻毒素活化后与钥孔蓝蛋白(KLH)混合反应制备，两者重量比为1 6 1 7;并用磷酸盐缓冲液PBS透析，取上清液。
8.权利要求5所述快速检测微囊藻毒素的试纸，其特征在于，所述鼠抗MC-LR单克隆抗体的制备方法为，取MC-LR半抗原与钥孔蓝蛋白的偶联物与完全福氏佐剂混合孵化后免疫小鼠；10 15天后取MC-LR半抗原与钥孔蓝蛋白的偶联物与不完全福氏佐剂混合孵化后， 每10 15天免疫小鼠，共三次。
9.一种快速检测微囊藻毒素的方法，其特征在于，将待测水样滴加在权利要求1 8任一项所述试纸的点样孔内，放置3 5min ；待测水样与胶体金标记的鼠抗MC-LR单克隆抗体-BSA复合物用量比100 μ 1 0. 25 1.5 μ g。
10.权利要求9所述一种快速检测微囊藻毒素的方法，其特征在于，待测水样与胶体金标记的鼠抗MC-LR单克隆抗体-BSA复合物用量比100 μ 1 Iygo
全文摘要
本发明涉及水样的检测，建立了微囊藻毒素MC-LR的快速胶体金免疫层析检测方法及试纸。首先制备平均粒径30nm左右的胶体金，用以标记抗微囊藻毒素MC-LR单克隆抗体；将微囊藻毒素MC-LR半抗原与钥孔蓝蛋白的偶联物包被在硝酸纤维素膜上作为检测带，羊抗鼠二抗作为控制带，依据免疫竞争法原理，建立快速检测微囊藻毒素MC-LR的免疫层析试纸条方法。该方法灵敏度可达到3ng/mL，只需3～5min即可目测判断结果，具有快速、直观、操作简单、便于使用等特点，可以作为现场大量筛查淡水及淡水产品是否感染微囊藻毒素MC-LR的有效手段。
文档编号G01N33/577GK102495212SQ20111042540
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者何培民, 汪卿, 缪辉南, 胡乐琴, 蔡春尔 申请人:上海海洋大学