参比电极的制作方法
【专利摘要】本发明提供具有原位改性的多孔性隔膜的参比电极以及对所述多孔性隔膜进行原位改性的方法，其中，所述参比电极包括至少一个壳体(1、201、301)、第一导体元件(4、204、304)、能够自由流动移动并且容纳在所述壳体(1、201、301)中的改性电解质，并且进一步包括多孔性隔膜(3、203、303)，所述多孔性隔膜(3、203、303)在所述改性电解质和测量介质(9、209、309)之间建立液体连接，并且所述改性电解质在操作期间透过所述多孔性隔膜(3、203、303)渗出，其中，所述改性电解质包含第一组分和表面改性组分，所述表面改性组分在所述改性电解质透过期间对所述多孔性隔膜(3、203、303)的表面进行原位改性。
【专利说明】参比电极
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于电化学测量链(measuring chain)的具有表面被原位改性的多孔性隔膜的参比电极。
【背景技术】
[0002]参比电极用于许多电化学传感器和/或测量链中，例如用于电位型传感器或电流型传感器中。这些电化学传感器在实验室以及多个工业部门中使用，例如化学工业、食品工业、生物【技术领域】或医药工业。对于此类电极必要的是，它们提供的参比电位应尽可能地恒定。
[0003]已知的现有技术的参比电极包括例如壳体，其内部含有电解质，电解质经由界面连接(interface connection)(也称为液体接界(liquid junction))与测量介质接触。
[0004]在现有技术中另外已知的参比电极除参比电解质以外还包含桥电解质(bridgeelectrolyte),其中桥电解质经由液体连接(也称为液体接界)与测量介质接触，并且还经由另一个界面与参比电解质接触。特别是在在不容许参比电解质与测量介质直接接触的情况下，使用此类双室系统。
[0005]尤其在生物技术、医药领域中以及在食品部门中，对参比电极以及传感器整体及其内部含有的材料关于不存在安全问题以及容易清洁及杀菌方面提出了严格的要求。与测量介质接触的物质和材料在暴露于测量介质时应为化学惰性的并且应优选没有后顾之忧；它们尤其不应为毒性的。参比电极应易于清洁及杀菌。已知的清洁方法包括例如在高温下用高浓度的碱或酸进行的CIP循环和/或SIP循环(就地清洁、就地杀菌)。此外，还应防止所谓的生物污垢，即尤其在隔膜表面上出现的外来或干扰物质的沉积物和积聚物。
[0006]液体接界可例如由开放的通道组成，或其可构造为多孔性隔膜。液体接界一方面应具有尽可能小的电阻，同时另一方面应防止参比电解质或桥电解质与测量介质之间的混合。满足此要求组合的尝试包括多种措施。
[0007]例如，在US7，387，716B2或EP1450019B1中，公开了具有开放的界面通道以及固体或凝固的参比电解质(例如聚合物电解质)的参比电极。以这种方式，可防止或至少大幅降低参比电解质通过开放的界面通道的不受控的流出。然而，用于此的聚合物电解质在许多情况下由不一定无害且甚至可为毒性的有机化合物组成。
[0008]另一种已知的尝试的解决方案是使用多孔性隔膜作为液体接界，优选与流体电解质组合。多孔性隔膜同样具有防止或至少大幅降低参比电解质或桥电解质通过该液体接界不受控的流出而进入测量介质中的能力。多孔性隔膜可例如用于在例如DE 3 702 501 Al中公开的所谓的加压参比电极这类中。这些参比电极经设计而使得参比电解质由于内部超压而连续地透过隔膜从加压参比电极渗出。为防止过度快速地消耗参比电解质，隔膜的孔应尽可能地小。通过将参比电解质设置在一定压力下，流出的参比电解质可防止或至少减轻测量介质的可能流入以及隔膜的孔的堵塞或阻塞。
[0009]然而，当用于生物质材料或含蛋白质的测量介质中时，具有多孔性隔膜的参比电极仍然具有缺点。在含蛋白质的测量介质中使用参比电极的一个显著问题是所谓的生物污垢。大多数天然存在的蛋白质尽管具有中性PH值但带有负电荷，并且因此对于氧化表面上的吸附显示亲和性。隔膜通常由氧化物质(例如氧化陶瓷)组成，从而使其在含蛋白质的测量介质中尤其易于受污染和/或堵塞，尤其在使用小孔径隔膜的情况下。含蛋白质的测量介质污染隔膜会歪曲界面电位并且由此造成测量误差，其中，孔径越小，污染趋势越强烈。问题甚至可严重到错误的测量信号或参比电极完全失效的程度。即使加压参比电极的升高的内部压力和因此导致的参比电解质或桥电解质的向外流动都不足以有效地清洁隔膜。此外，流出的参比电解质或桥电解质或位于隔膜上的沉积物可能污染测量介质。然而，即使在用于含蛋白质的测量介质或生物质材料中时，隔膜在操作期间仍然保持不受污染是有利的。
[0010]已知的用于避免或减少生物污垢(具体地，传感器表面和隔膜的蛋白质污染)的解决方案具有缺点。在加压参比电极中，仅可用相对高速率的流出物冲洗多孔性隔膜，这导致参比电解质或桥电解质的高消耗并且因此电极的频繁维护以补充参比电解质或桥电解质。在参比电解质或桥电解质变浓稠并且因此较不自由流动的情况下，通过冲洗来清洁隔膜是不可能的。另外，使用的许多增稠剂是不能归类为无风险并且例如是会污染测量介质的有机物质。当然，参比电解质或桥电解质还可与天然存在并且基本上无害的聚合物(例如琼脂或纤维素)固结在一起。然而，这些物质会不耐受上文提及的清洁技术。
【发明内容】
[0011 ] 因此，本发明的目的是研发改进的参比电极，甚至对于在生物质材料中的测量，它也提供可靠并且可再现的结果，并且另外，它在常规使用的清洁程序及过程条件下得以保持。
[0012]该任务由用于电化学传感器的参比电极解决，所述参比电极包括壳体、导体元件、壳体中含有的自由流动的改性电解质和多孔性隔膜。所述多孔性隔膜在改性电解质与测量介质之间建立液体连接或界面，其中改性电解质在操作期间透过所述隔膜渗出。所述改性电解质包含第一组分和表面改性组分，所述表面改性组分在改性电解质透过期间对隔膜的表面进行原位改性。
[0013]隔膜表面的原位改性与在工厂改性相比是有利的，因为与在将电极交付使用之前施加表面改性组分相比，可在电极的操作状态(即，原位)进行改性，并且可在很大程度上避免在例如CIP过程和/或SIP过程期间表面改性组分的老化效应和/或分离。
[0014]参比电极的隔膜由填充有孔的多孔性材料组成，所述孔容许连续通过隔膜。因此，在本文中，隔膜的表面不仅指面向测量介质的表面，还指由孔呈现的表面。
[0015]改性电解质的第一组分可为经常用于参比电解质的或者作为某一组分或者单独使用的电解导电的和/或电位限定的物质种类。
[0016]第一组分是电解导电的，优选选择是阴离子和阳离子在水溶液中具有基本上相同的扩散速度的等迁移盐。等迁移盐的使用作为降低界面处不希望的扩散电位的方式是有利的。
[0017]在第二种类的参比电极中，第一组分可包括氯化物，例如KCl、NaCl、MgCl2或CsCl20[0018]在以桥电解质作为改性电解质的双室参比系统中，桥电解质可包括例如Na2SO4作为第一组分。当然，还可使用已知作为参比电解质或桥电解质的其它物质作为改性电解质的第一组分。在PH参比电极中，第一组分包含pH缓冲系统，并且在氧化还原参比系统中，第一组分包含氧化还原缓冲剂。改性电解质的第一组分优选以水溶液的形式使用，尤其是氯化钾水溶液，优选以3mol/L的浓度。
[0019]多孔性隔膜的原位改性用以防止或至少大幅减少多孔性隔膜的表面上的生物污垢，如已经利用多种措施所尝试。
[0020]多孔性隔膜可涂覆有例如惰性聚合物(例如，PTFE(聚四氟乙烯))或亲水性交联水凝胶。遗憾的是，这些涂层难以施加，在一些情况下，它们容易再次自身脱离，并且此外，它们相对较厚，因此多孔性隔膜的孔缩小过多，这可导致隔膜的流动阻力不希望地增加。
[0021]作为另一种可能，隔膜表面可覆盖有经由共价键连接自身的物质。然而，这种情况的缺点在于，所产生的共价键在许多情况下不抵抗由例如用于清洁的酸和碱引起的水解，并且此类涂层在一次CIP处理后有时已经自身脱离。用于涂层的物质是例如硅烷。具体地，几乎完全抑制蛋白质沉积物形成的用PEG(聚乙二醇)基团聚乙二醇化的硅烷仍然具有上述缺点。
[0022]为克服现有技术的这些缺点，改性电解质除第一组分以外还包含表面改性组分，所述表面改性组分由于其特性而能够对隔膜的表面进行原位改性以使表面排斥蛋白质和/或氨基酸。改性原位发生，这使得还可使用可逆地结合到表面并且由此改变表面上的电荷的用于表面改性组分的物质。优选另外快速地与表面结合的表面改性物质。向在操作期间透过隔膜渗出的改性电解质中添加表面改性组分，由此在参比电极的操作期间，隔膜表面保持恒定覆盖有表面改性组分，即使用于表面改性组分的物质是可逆地吸附的，或是例如在常规的清洁程序中从隔膜表面自身脱离的物质。
[0023]具体地，使用的表面改性组分应为无毒性的。如果本发明的参比电极打算用于生物质或含蛋白质的溶液的测量，这尤其重要。
[0024]参比电极的设计优选使得在操作期间改性电解质连续地透过多孔性隔膜漏出，由此表面改性组分可连续地对隔膜的表面进行改性。
[0025]参比电极的这种设计特别有利，因为改性电解质连续地透过多孔性隔膜迁移的结果是，一方面，通过改性电解质的流动将外来物质从多孔性隔膜冲洗出来而对多孔性隔膜进行机械清洁，并且另一方面，表面改性可连续地更新或补充。如果使用可逆地结合到隔膜表面或通过物理吸附结合到隔膜表面的这种表面改性组分，这尤其有利。可逆结合可经由例如氢桥键、静电相互作用或范德华力发生。
[0026]作为确保并且优选还控制改性电解质透过多孔性隔膜的迁移的方式，可对参比电极进行加压。即使用非加压参比电极，扩散及毛细管力也会使得表面改性组分缓慢地遍布在隔膜表面上或被吸附到隔膜表面。由于加压，改性电解质以恒定的向外流动速率透过隔膜渗出，因此改性组分透过隔膜的孔连续输送。这为隔膜表面的原位改性并且尤其是连续改性创造了条件。另外，可实现相对快速的原位改性。
[0027]在参比电极的一种构造中，改性电解质可为其中浸没有导体元件的参比电解质。
[0028]在参比电极的另一种构造中，改性电解质可为经由隔膜与测量介质接触的桥电解质。这种构造的参比电极进一步包括参比电解质和具有另一个隔膜的参比壳体，其中导体元件浸没在参比电解质中，并且参比电解质经由所述另一个隔膜与桥电解质接触。此类参比电极可例如包括具有内部电解质和外部电解质的双室系统，其中外部电解质(即，桥电解质)经由隔膜与测量介质接触并且包含表面改性组分。
[0029]作为另一个实施方案的实例，本发明的参比电极构造为包含pH缓冲系统作为改性电解质的第一组分的pH电极。此类系统也称为差示pH测量链(differential pHmeasuring chain)。pH缓冲系统可包含电位限定物质(例如乙酸盐缓冲剂或朽1檬酸盐缓冲齐U)作为第一组分。对于表面改性组分，可使用上文提及的物质中的一种。
[0030]可用作表面改性组分的物质具体地符合以下标准:它们吸附在隔膜表面或沉降在隔膜表面上并且随后抑制蛋白质的吸附或其它或额外外来物质的凝聚。优选地，用作表面改性组分的物质无毒性并且对于测量介质是化学惰性的。通过以静电方式起作用的物质或有空间要求的物质可抑制随后外来物质或干扰物质(例如蛋白质)的吸附。
[0031]以静电方式起作用的物质改变隔膜的表面电荷，由此抑制隔膜表面上的外来物质的吸附，以防止或至少减少生物污垢。如果对于吸附物(例如蛋白质)的吸引力占主要地位，隔膜表面上的吸附将增强或加速。已由静电物质改变的隔膜表面具有排斥吸附的静电电荷或静电力，因此以静电方式阻止隔膜表面上不希望的蛋白质吸附。这里应注意，隔膜以及吸附物的电荷通常为PH依赖性的量。
[0032]在另一个实施方案中，可使用有空间要求的物质作为表面改性组分，所述有空间要求的物质可以空间方式阻止或甚至防止测量介质中含有的物质(尤其是蛋白质)的凝聚。术语“有空间要求的”是指物质由于其所占据的空间的大小而可显著阻止其它物质吸附在隔膜表面上。所述现象还可影响反应的动力学并且例如减缓竞争吸附，因为先前吸附的空间占据物质可阻止其它物质的吸附。有空间要求的物质的实例是聚乙二醇(PEG)。
[0033]在其它实施方案中，表面改性组分可为包含至少一个羟基取代基和至少一个羰基取代基的有机物质。这些物质可尤其经由氢桥键结合到隔膜表面，并且因此阻止其它物质(例如蛋白质)的吸附。
[0034]此类有机物质的实例是有机酸，例如乳酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、抗坏血酸以及其盐或它们的混合物。所有这些化合物包括至少一个羟基取代基和一个羰基取代基，并且此外以它们无毒性的事实来区分。已经作为实例提及的二羧酸带负电荷，这使它们尤其有效地经由吸附将自身附着到带正电荷的隔膜表面。
[0035]苹果酸、抗坏血酸或其它还原剂优选用于具有不含氯化银的改性电解质的参比电极中，因为尤其在较高温度下，这些物质可造成氯化银不希望地还原成银。
[0036]令人惊奇地，已发现，尤其柠檬酸及其盐由于其还原电位而甚至在升高的温度下也基本上不会造成具有含AgCl的改性电解质的参比电极中的改变。因此，柠檬酸及其盐尤其适合用作Ag/AgCl参比电极中的表面改性组分。
[0037]参比电极的另一个实施方案可包括聚赖氨酸聚乙二醇(pLy-PEG)作为表面改性组分。该物质借助其聚氨基酸部分可由氧化表面吸附，由此背离表面的PEG部分可防止其它不希望的外来物质或干扰物质的吸附。在本文中的术语“外来物质”指例如易于吸附或凝聚在开放的隔膜表面上并且因此堵塞隔膜并使其不能用的蛋白质及其它来自生物质的分子。
[0038]优选地,表面改性组分以小于0.1重量％ (wt% )并且特别地约0.01重量％到0.1重量％的低浓度添加到改性电解质中。该浓度足以确保隔膜表面的改性，并且同时足够低，以基本上防止或至少大幅降低由添加的表面改性组分引起的干扰扩散电位(interferingdiffusion potentials)的发生。
[0039]多孔性隔膜可为例如陶瓷材料，或可包括具有大表面的金属结构。
[0040]优选使用含锆的陶瓷，因为它们特别耐碱并且在常规的清洁程序中稳定，这使其特别适合用作参比电极中的多孔性隔膜。
[0041]作为另一种可能，硅酸铝陶瓷可用作多孔性隔膜，但是它们明显较不耐受常规的清洁方法。
[0042]金属结构的实例采取由例如贵金属并且具体地钝化的钼组成的毛细管束或金属丝团的形式。
[0043]上述陶瓷材料以及金属结构以其对通常遇到的过程条件及清洁方法的高耐受性而著称。
[0044]本发明的另一个方面涉及对在本发明的参比电极中布置为界面或液体通道的多孔性隔膜进行原位改性的方法。该方法除其它特征以外尤其包括以下步骤:向包含在参比电极中的改性电解质添加表面改性组分，并且确保改性电解质透过多孔性隔膜向外迁移。以这种方式，参比电极的隔膜的表面可在操作期间(即，原位)进行改性，并且可有效地防止存在于例如测量介质中的其它物质阻塞和/或污染隔膜。
[0045]在有利的实施方案中，对参比电极进行加压，以确保改性电解质连续地透过隔膜流动。
[0046]下文中将借助附图对多个示例性实施方案、本发明的参比电极以及多孔性隔膜的原位改性的方法进行解释，其中各图中相同的特征由相同的附图标记标示。特别地，通过根据本发明的包括参比电解质的参比电极的PH测量链的实例描述实施方案。因此，在下文中，术语“参比电解质”与术语“改性电解质”在某种程度上同义使用。当然，本发明的参比电极还可与其它电化学测量链或传感器一起使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0047]概述各个附图:
[0048]图1在纵向截面图中示意性地示出了具有参比电极的组合pH测量链；
[0049]图2在纵向截面图中示意性地示出了具有参比电极的组合pH测量链,其中参比电极包含参比电解质和桥电解质；
[0050]图3示意性地示出了用于pH参比电极相对于相同设计的外部参比(externalreference)的比较测量的测量配置；
[0051]图4显示理想地执行Ag/AgCl参比电极相对于相同设计的外部参比的电压/时间图表，其中使用3mol/L KCl溶液作为改性电解质的第一组分；
[0052]图5显示Ag/AgCl参比电极相对于相同设计的外部参比的电压/时间图表，其中在开始后600秒向测量介质中添加柠檬酸钠，并且其中参比电极包括:
[0053]a.平均孔径为70nm或120nm的二氧化锆隔膜，
[0054]b.平均孔径为200nm的二氧化锆隔膜，
[0055]c.平均孔径为400nm或800nm的二氧化锆隔膜；[0056]图6显不Ag/AgCl参比电极相对于相同设计的外部参比的电压/时间图表，其中向改性电解质中添加5X l(T4mol/L柠檬酸钠。
[0057]图7显示Ag/AgCl (其中向改性电解质中添加5X 10_4mol/L柠檬酸钠)相对于相同设计的外部参比的电压/时间图表，其中在开始后600秒向测量介质中添加柠檬酸钠，并且其中参比电极包括:
[0058]a.平均孔径为70nm或120nm的二氧化锆隔膜，
[0059]b.平均孔径为200nm的二氧化锆隔膜，
[0060]c.平均孔径为400nm或800nm的二氧化锆隔膜。
【具体实施方式】
[0061]图1在截面图中示意性地示出了具有加压参比电极的组合pH测量链。参比电极具有填充有参比电解质2的基本上管形状的壳体I。参比电极的壁中的通道构造为多孔性隔膜3，在操作期间参比电解质2透过其连续流动漏出。第一参比元件或导体元件4浸没在参比电解质2中。
[0062]pH测量链另外由内部壳体5组成，内部壳体5布置在壳体I的内部，包括pH敏感性玻璃膜6，并且填充有内部缓冲剂7。第二导体元件8浸没在内部缓冲剂7中。
[0063]测量pH时，将pH测量链浸没在测量介质9中，以使至少玻璃膜6和多孔性隔膜3与测量介质接触。参比电解质2经由隔膜3与测量介质9接触。
[0064]一种最为熟知的用于pH测量链的参比电极是所谓的Ag/AgCl电极，其具有Ag/AgCl的第一导体元件4和参比电解质2的含氯化物的第一组分，例如KCl溶液。其它现有技术的参比电极是不含AgCl的pH差示电极或氧化还原参比电极。
[0065]根据本发明，向参比电解质2中添加表面改性组分。参比电解质2基本上由第一组分组成，因此，添加有表面改性组分的参比电解质2是根据本发明的改性电解质。在含有银离子的参比电极或参比系统中，添加到参比电解质2中的表面改性组分优选为甚至在大约130°C或高于130°C的温度下也不具有还原效应的种类，例如柠檬酸及其盐。添加到pH差示电极的改性电解质中的表面改性组分优选为自身构成缓冲系统的种类，例如柠檬酸盐缓冲剂。
[0066]现有技术包括许多其它类型的用于电化学传感器的参比电极，此处并不作详细描述。当然，所有这些其它类型的参比电极在本发明的意义上同样可通过向改性电解质中添加适合的表面改性组分进行改性。
[0067]另外，在图1中示出了在pH测量链中测量期间存在并且可影响测量结果的电化学电位。这些电位包括第一导体元件4的电位E1、横跨隔膜3的扩散电位或隔膜电位E2、第二导体元件的电位E3、玻璃膜6内侧的电位E4、第一导体元件4与第二导体元件8之间的不对称电位E5以及玻璃膜6外侧的pH依赖性电位E6。
[0068]两个导体元件4、8之间存在的电位(在这个实例中为pH电位E5)可用伏特计13测量，并且由所显示的电位的总和组成。可将其转化成PH值。在现有技术的Ag/AgCl参比电极中，根据能斯特方程(Nernst equation),电位El对应于第一导体4处氯离子的电位。只要参比电解质2中Cl离子的浓度不改变，电位El将基本上恒定。在现有技术的Ag/AgCl参比电极中，参比电解质中的Cl-浓度c (CL-)相对恒定为3mol/L。这尤其适用于加压参比电极，因为在加压下可基本上避免参比电解质2的稀释或污染。
[0069]扩散电位E2是若干个量的函数，包括参比电解质2与测量介质9之间的离子浓度差以及受?电位及隔膜的孔径影响的隔膜3的表面电荷。扩散电位Ε2同样应基本上恒定并且优选具有OmV的值。只要第二导体元件8处的氯离子电位及内部pH玻璃处的内部电解质的H+离子电位保持基本上恒定(该条件因具有内部电解质7的封闭的内部壳体5而得以满足)，电位E3和E4基本上恒定。只要温度保持恒定，组合pH测量链的不对称电位E5可认为大致恒定。电位E6随玻璃膜6外侧的H+电位(即，依赖于测量介质的pH值)而变化。
[0070]图2示出了具有双室参比系统的组合pH测量链。该pH测量链具有与图1的pH测量链基本上相同的特征，只是图2的pH测量链具有不同的参比电极。第一导体元件204位于含有参比电解质202的另一个参比壳体220中。该参比壳体220包括另一个隔膜219，其代表壳体201中含有的参比电解质202与桥电解质218之间的液体接界。桥电解质218经由隔膜203与测量介质209接触。桥电解质218在本发明的意义上代表改性电解质并且包括第一组分以及表面改性组分，因此隔膜203随桥电解质通过隔膜在操作期间被原位改性。
[0071]以下实施例旨在于证实尤其在含蛋白质的测量介质的情况下，向电解质中添加表面改性组分对PH测量的影响。
[0072]在所有实施例1 到7中，使用图3的设置。所示例的配置包括浸没在第一容器311中的加压参比电极312，以及外部参比315。外部参比315包括另一个容器310，并且两个容器310、311通过隔膜导管314彼此连接。隔膜导管314填充有液体并且构成两个容器310、311之间的液体连接。容器310(例如玻璃烧杯)含有外部参比315的电解质316，参比元件317浸没在其中。因此，容器310构成外部参比315的半电池。
[0073]加压参比电极312浸没在由第二容器311容纳的测量介质309中。参比半电池或参比电极312包括壳体301，所述壳体301填充有参比电解质302并且具有隔膜303作为与测量介质309的界面通道。第一导体元件304再次浸没在参比电解质302中。对参比电极312进行加压，因此，参比电解质302可连续地透过隔膜303向外流动。
[0074]为证实添加表面改性组分(例如柠檬酸钠)如何对参比电极的测量性质进行影响，首先用图3的配置用不同构造的参比电极312、不同组成的参比电解质302及不同的测量介质309进行测量。
[0075]实施例1:标准类型的参比电极相对于外部参比.[0076]对于参比电极312,使用加压Ag/AgCl电极,所述电极具有用于第一导体兀件304的Ag/AgCl金属丝及由微孔性二氧化锆制成的隔膜303。参比电解质302仅包括3mol/LKCl水溶液作为第一组分，不含表面改性组分。对所使用的参比电极进行加压，以确保参比电解质302透过隔膜303的受控迁移。
[0077]使用容器310作为外部参比，其包括Ag/AgCl金属丝作为第二导体元件8并且包括3mol/L KCl水溶液作为电解质317。
[0078]测量介质同样为3mol/L KCl水溶液，并且两个容器310、311通过大孔性隔膜管314彼此连接。
[0079]由于该实施例中的所有电解质以及测量介质均为相等浓度的KCl水溶液，因此自身无法建立贯穿隔膜303及隔膜管314的浓度梯度，所以测量中获得的扩散电位E2基本上恒定为零值，并且因此所有电位El到E6的总和基本上为零。
[0080]图4显示参比电极相对于外部参比的电压对时间图表曲线,其示例的是上述描述的情况。如在图中可以看到，随时间流逝测量的电压基本上大约为零。
[0081]实施例2:含柠檬酸盐的测量介质
[0082]在另一个实施例(其本质上对应于实施例1)中，在测量时间过去600秒之后，向测量介质309 (3mol/L KCl溶液)中添加0.lmol/L浓度的柠檬酸钠。
[0083]这些测量是用不同孔径的多孔性氧化锆隔膜303的参比电极312进行，具体地，平均孔径为 70nm、120nm、200nm、400nm 和 800nm。
[0084]当向测量介质309中添加柠檬酸钠时，隔膜的表面首先聚集有柠檬酸根离子，由此隔膜表面的表面电位((电位)及等电点(Pl)相应地改变，因此扩散电位Ε2也改变，即，停止保持恒定。扩散电位Ε2的改变在小孔径的隔膜中以及在低离子浓度及(作为后者的结果)高水平扩散的测量介质中尤其明显。
[0085]由于电位Ε2的改变，电位的总和并且因此测量结果也改变，如图5a到图5c的图表中的电位的阶跃改变所显示，其中，所观察到的图表的趋势与所使用隔膜的孔径无关。在图5a中，实线显示平均孔径为70nm的隔膜的结果，并且虚线显示平均孔径为120nm的隔膜的结果。图5b显示平均孔径为200nm的隔膜的结果，并且图5c显示平均孔径为400nm(实线)及SOOnm(虚线)的隔膜的结果。
[0086]该效应在较小孔径的隔膜中更强烈(图5a)，这归因于离子(包括水合物包封)与隔膜303的表面相互作用，即其将由后者吸附和/或保留在隔膜303中的可能性增加，这可导致电荷分离并且因此扩散电位的改变。
[0087]在较低离子浓度的测量介质中，该效应更强烈，这是由于扩散的驱动力增加，并且因此，由参比电解质302与测量介质309的各自离子浓度的差异引起的扩散量也增加。
[0088]电解质离子与隔膜相互作用的可能性越高，测量信号的噪声水平以及扩散电位E2的改变越高。该可能性随隔膜孔径的减小而增加。扩散电位E2的改变造成图中在600秒时看到的阶跃改变，并且因此导致组合PH测量链中的测量误差。
[0089]实施例3:含柠檬酸盐的参比电解质
[0090]在该实施例中，使用加压Ag/AgCl电极作为参比电极312，所述电极具有Ag/AgCl金属丝作为第一导体元件304以及由多孔性二氧化锆制成的隔膜303。参比电解质302包含3mol/L KCl水溶液作为第一组分，其中添加5X10_4mol/L浓度c (柠檬酸钠)的柠檬酸钠作为表面改性组分，由此使得参比电解质302能够作为改性电解质。对该实施例中所使用的参比电极进行加压，以确保参比电解质302透过隔膜303的受控迁移。
[0091]使用第一容器310作为外部参比电极，它含有Ag/AgCl金属丝作为参比元件317并且含有3mol/L浓度的KCl水溶液作为电解质316。
[0092]测量介质是3mol/L的KCl水溶液。
[0093]在该实施例中，电位E2基本上恒定，但不为零，它是隔膜的孔径的函数，并且该函数由于添加柠檬酸根离子而改变。因此，电位的总和同样是恒定但不为零的量，如图6的图表中可以看到。
[0094]表面改性组分(这里为柠檬酸钠)的优选连续的向外流动对隔膜表面的原位覆盖或改性导致参比电位的改变，然而，这可用适合的校准程序来补偿。组合PH测量链的零点的位移(在图6中可以看到)可通过调整内部缓冲剂7进一步调节或调整归零。
[0095]实施例4:含柠檬酸盐的参比电解质和含柠檬酸盐的测量介质
[0096]在该实施例中，向参比电解质302以及测量介质309中添加柠檬酸钠。另外，在测量进行到600秒时，向测量介质309的3mol/L KCl水溶液中添加0.lmol/L浓度的柠檬酸钠。测量设置的其它参数与实施例3中的相同，但是，此处，用不同孔径的多孔性氧化锆隔膜3进行测量，具体地，孔径为70nm、120nm、200nm、400nm和800nm。
[0097]如在实施例3中，隔膜表面通过参比电解质302的流动原位地并且优选连续地补充有柠檬酸根离子，所述参比电解质302的流动通过对参比电极加压得以保持。因此，在向测量介质中添加柠檬酸盐时隔膜表面已经被占据，所以，隔膜的表面电荷和扩散电位仅有微小程度的改变。
[0098]如图7a到图7c中的图表所显示，在向测量介质中添加柠檬酸盐之后不再发生电位的阶跃增加。该效应再次与所使用隔膜的孔径无关。仍然存在的零点偏移可再次通过调整内部缓冲剂容易地补偿。图7a的图表中的实线显示平均孔径为70nm的隔膜的结果，而虚线显示平均孔径为120nm的隔膜的结果。图7b中显示平均孔径为200nm的隔膜的结果。在图7c中，实线显示平均孔径为400nm的隔膜的结果，而虚线显示平均孔径为SOOnm的隔膜的结果。
[0099]根据实施例1到4，可推断，干扰pH测量链在含柠檬酸盐的测量介质中的测量结果的效应可通过向参比电解质中添加柠檬酸盐作为表面改性组分而补救。可进一步推断，即使改性电解质(这里为参比电解质)中低浓度的柠檬酸盐也足以原位并且优选连续地对隔膜表面进行改性，并且由此足以抵消柠檬酸盐从测量介质的进一步附聚。
[0100]实施例5:具有本发明的参比电极的差示电极
[0101]在体现本发明的另一个实施例中，改变实施例4的测量设置，用pH参比电极代替Ag/AgCl参比电极。已经在实施例4的测量中评估隔膜孔径不同的参比电极。对于参比电解质，使用PH4.6的缓冲溶液，向其中添加约0.05mol/L浓度的抗坏血酸作为表面改性组分。
[0102]如已经结合实施例4所描述，在测量进行到约600秒时，向测量介质中添加表面改性组分的盐(这里为抗坏血酸钠)。
[0103]作为向参比电解质(这里为pH缓冲系统)中添加抗坏血酸的结果，又一次地甚至在添加抗坏血酸盐之后也不再出现阶跃改变，并且该效应不依赖于所使用隔膜的孔径。仍然存在的零点偏移可再次通过改变内部缓冲剂容易地补偿。
[0104]实施例6:金属结构对于隔膜的用途
[0105]与实施例1到4中使用的测量设置类似，也获得具有金属结构的测量设置，具体地呈钼丝束形式的隔膜，并进行测试。作为所进行测量的显著特点，已发现，新的钼丝隔膜具有相对大的孔径，因此装备有此类新的钼丝束的参比电极312显示与实施例1到4中的具有大孔径氧化锆隔膜的参比电极相同的效应。
[0106]钼丝束性质非常柔软，并且在机械清洁中及在机械应力下具有改变其形状的趋势。因此，丝束中的孔将逐渐变得较小，同时对扩散电位的影响变得较大。
[0107]在例如通过研磨或强烈的磨损隔膜对钼丝束进行重复机械清洁后，对隔膜的电位的影响变得越来越大，因此，最终获得与实施例2到4中使用微孔性隔膜(70nm、120nm)类似的结果。
[0108] 同样，可以与实施例4中类似的方式通过使用含柠檬酸盐的参比电解质降低对扩散电位的影响。
[0109]根据这些结果，可推断，如果向参比电解质中添加表面改性组分，具有金属结构的隔膜会变得不易吸附外来物质。
[0110]实施例7:在含蛋白质的测量介质中的测量
[0111]在本发明方法的下一个应用实施例中，使用具有不同参比电极的pH测量链测定含蛋白质的测量介质的PH值，并且将其各测量性能彼此进行比较。
[0112]在“哺乳动物生物过程”中进行这些比较测量以用于从仓鼠卵巢细胞(CH0，中国仓鼠卵巢)制造重组催乳激素蛋白。
[0113]与该生物过程有关的蛋白质尤其包括等电点约为4.5的牛血清白蛋白(BSA)和等电点约为4.6的酪蛋白(存在于奶中的蛋白质)。
[0114]对于该生物过程，使用工作体积为2升的2.5升生物反应器(MBR生物反应器，Zurich)。使CHO细胞在35.6 V的温度下在以7g/L葡萄糖和7mmol/L谷胺酰胺作为主要碳源的反应介质中生长。
[0115]氧饱和度设置为50%，并且通过注入氮气和/或氧气保持在这个水平。生物质的PH值设置为pH6.8，并且通过添加0.3mol/L浓度的NaOH保持在这个水平。然后，给每毫升生物质接种8.5 X IO6个CHO细胞，并且通过连续地稀释细胞并将其撇去而保持恒定在IOX IO6个细胞/毫升。生产率为每天约1.5个生物反应器体积，并且连续操作反应器七天。
[0116]用不同传感器，包括但不限于氧传感器、温度传感器及CO2传感器以及若干种不同设计的PH测量链监测该生物过程。在为期七天的细胞制备完成后，对不同pH测量链关于其测量性能彼此进行比较。
[0117]以下是所测试pH测量链的列表:
[0118]
参比电解质
加压KCl* 柠檬酸钠*隔膜
_____(材料/平均孔径)_
PHl__未加压__3__?__ZrOxZlOOnm_
PH-2__Mi__3__---__ZrOxZlOOnm_
PH-3__Wg__3__SxlO-4__ZrOx/ IOOnm_
PH-4__ME__3__---__Pt 丝束_
PH-5~ MS.3 ~5xl0'4~Pt 丝束
[0119]*所陈述的浓度参照pH7并且单位为mol/L。
[0120]使用两种PH-3型pH测量链，使用其中的一种pH测量链作为过程控制pH测量链。
[0121]在为期七天的生物过程完成后，关于不同pH测量链的测量性能的结果如下。
[0122]测量链PH-1在整个生物过程期间显示强烈波动的pH值，并且在生物过程结束时根本无法测得PH值。强噪声使测量链PH-2显示的pH值改变高达±1个pH单位，但与PH-1相比，pH值的读数甚至在过程完成后仍可获得。测量链PH-3在整个生物过程期间显示pH6.8±0.1的稳定值。
[0123]测量链PH-4和PH-5的参比电极的隔膜包括旧的强烈压缩的钼丝束，因此具有非常小的孔径。测量链PH-4显示与PH-1类似的行为。所显示的pH值强烈波动，并且在生物过程结束时不再可获得PH读数。测量链PH-5与PH-3 —样显示pH6.8的准确值，尽管具有
0.2个pH单位的略微较高量的噪声。
[0124]在生物过程完成后，用标准的缓冲溶液在pH4和pH7下对全部五种pH测量链进行校准。
[0125]在校准过程中，已发现，测量链PH-1和PH-4不能被校准，因为过量噪声使得不能
获得最终值。
[0126]测量链PH-2的校准仍然勉强可进行，尽管仅在长的等候时间后，因为测量链PH-2的响应大大减慢。已发现，测量链PH-2的特征的陡度退化，并且后者尤其由于缓慢响应和/或非常嘈杂的信号而不显示充分稳定的最终值。
[0127]尝试使测量链ΡΗ-1、ΡΗ-2和PH_4再生并再次进行校准。为实现这个目的，使测量链在盐酸和胃蛋白酶的再生溶液(Mettler-Toledo)中再生12小时，并再次在pH4和pH7的缓冲溶液中校准。 [0128]可以这种方式使测量链PH-2再生并随后再次校准。在这个程序后，测量链PH-2的零点在5mV，陡度为97.6%。
[0129]再生后，测量链PH-1和PH-4的测量值在用pH4的缓冲溶液校准时仍然显示±5mV的高噪声水平，并且确定测量值需要花费较长时间。在换成PH7缓冲剂后，测量值再次证明非常噪杂并且无法测得最终值。
[0130]显然，即使使测量链在HCl/胃蛋白酶中再生12小时也不足以完全去除隔膜表面的蛋白质吸附。
[0131]因此，甚至在使测量链PH-1和PH-4再生12小时后也无法在含蛋白质的测量介质中实现足够的测量性能和充分的再现性，并且因此不能再用于进一步测量。
[0132]尽管测量链PH-2可再生，但其在含蛋白质的溶液中的测量性能明显减损。
[0133]相比之下，测量链PH-3和PH-5 (根据本发明，其具有的参比电极含有改性电解质)显示非常良好的校准行为并且快速地停留在稳定的最终值。甚至在高蛋白质含量下的生物过程中操作7天后，测量链仍然分别显示98% (PH-3)和96.3% (PH-4)的陡度值。
[0134]尽管已经通过提供实施方案的具体实施例描述本发明，但可以认为下述是不言自明的:可基于本发明的教导例如通过将各个实施方案的特征彼此组合和/或在各实施方案之间相互交换各个功能单元产生许多其它变化形式。
[0135]参考符号列表
[0136]1、201、301 壳体
[0137]2、202、302 参比电解质
[0138]3、203、303 隔膜
[0139]4、204、304 第一导体兀件
[0140]5、205、305内部壳体
[0141]6、206玻璃膜
[0142]7、207内部缓冲剂[0143]8,208第二导体元件
[0144]9、209、309测量介质
[0145]310第一容器
[0146]311第二容器 [0147]312参比电极
[0148]13、213、313伏特计
[0149]314隔膜导管、隔膜管
[0150]315外部参比
[0151]316电解质
[0152]317参比元件
[0153]218桥电解质
[0154]219另一个隔膜
[0155]220参比壳体
[0156]El第一导体元件的电位
[0157]E2扩散电位/隔膜电位
[0158]E3二导体元件的电位
[0159]E4玻璃膜内侧的电位
[0160]E5不对称电位
[0161]E6玻璃膜外侧的电位
【权利要求】
1.参比电极，其包括至少一个壳体(1、201、301)、第一导体元件(4、204、304)、能够自由流动移动并且布置在所述壳体(1、201、301)中的改性电解质以及多孔性隔膜(3、203、303)，所述多孔性隔膜(3、203、303)在所述改性电解质和测量介质(9、209、309)之间建立液体连接，并且所述改性电解质在操作期间透过所述多孔性隔膜(3、203、303)渗出，其中，所述改性电解质包含第一组分和表面改性组分，所述表面改性组分在所述改性电解质透过期间对所述多孔性隔膜(3、203、303)的表面进行原位改性。
2.如权利要求1所述的参比电极，其特征在于所述多孔性隔膜(3、203、303)的所述表面被连续改性。
3.如权利要求1或2所述的参比电极，其特征在于所述参比电极被加压，以使在操作期间所述改性电解质连续地透过所述多孔性隔膜(3、203、303)渗出。
4.如权利要求1到3中任一项所述的参比电极，其特征在于所述改性电解质是其中浸没有所述第一导体元件(4、304)的参比电解质(2、302)。
5.如权利要求1到3中任一项所述的参比电极，其特征在于所述改性电解质是桥电解质(218)，并且所述参比电极进一步包括参比电解质(202)和具有另一个隔膜(219)的参比壳体(220)，其中所述第一导体元件(204)浸没在所述参比电解质(202)中，并且所述参比电解质(202)经由所述另一个隔膜(219)与所述桥电解质(218)接触。
6.如权利要求1到5中任一项所述的参比电极，其特征在于所述表面改性组分包含以静电方式起作用的物质。
7.如权利要求1到5中任一项所述的参比电极，其特征在于所述表面改性组分包含有空间要求的物质。
8.如权利要求1到7任一项所述的参比电极，其特征在于所述表面改性组分包含具有至少一个羟基取代基和至少一个羰基取代基的有机物质。
9.如权利要求8所述的参比电极，其特征在于所述表面改性组分包含乳酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、抗坏血酸、所述酸的盐或它们的混合物。
10.如权利要求8所述的参比电极，其特征在于，所述表面改性组分包含聚赖氨酸聚乙二醇。
11.如权利要求1到10任一项所述的参比电极，其特征在于所述改性电解质包含小于0.1重量％、特别地约0.05重量％到0.1重量％浓度的所述表面改性组分。
12.如权利要求1到11任一项所述的参比电极，其特征在于所述多孔性隔膜(3、203、303)本质上包含陶瓷材料。
13.如权利要求1到11任一项所述的参比电极，其特征在于所述多孔性隔膜(3、203、303)本质上包含金属结构。
14.对多孔性隔膜(3、203、303)进行原位改性的方法，所述多孔性隔膜(3、203、303)作为与测量介质(9、209、309)的液体连接布置在根据前述权利要求中任一项所述的参比电极中，其中，所述方法包括以下步骤: a.向布置在所述参比电极中的改性电解质中添加表面改性组分，和 b.确保所述改性电解质透过所述多孔性隔膜(3、203、303)向外迁移。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述改性电解质在操作期间连续地透过所述多孔性隔膜(3、203、303)排出。
【文档编号】G01N27/30GK103975235SQ201180075306
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2011年12月15日 优先权日:2011年12月15日
【发明者】R·特里尔 申请人:梅特勒-托利多公开股份有限公司