专利名称：一种用于等电聚焦分离的微流控芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及微流控芯片，尤其是涉及ー种利用锯齿形的微通道实现高分辨率等电聚焦分离的用于等电聚焦分离的微流控芯片。
背景技术：
等电聚焦(Isoelectric focusing, IEF)是利用两性电解质载体在电场中形成连续的PH梯度，蛋白质等生物分子具有特定的等电点，在pH梯度中会迁移到具有与等电点相一致的PH的位置，从而实现分离、測定和鉴定等目的的ー种方法。早期的等电聚焦电泳采用垂直管式，近年来又发展了超薄层水平板式等电聚焦电泳，一般采用聚丙烯酰胺凝胶作为抗对流和扩散的支持介质(D. J.布勒尔，E.佩特斯，R.库尔持，R.彭特曼中国专利CN101460835A)。也有使用pH梯度固定的IPG胶条 (Gorg, A. ；Obermaier, C. ；Boguth, G. ；Harder, A. , Scheibe, B. ；Wildgruber, R. ；Weiss, W. Electrophoresis 2000，21，1037-1053)，这ー改进简化了蛋白质的等电聚焦分离、检測。这类方法虽然使用方便、实验准备与操作较为简単，但是所需的两性电解质等原料及样品量相对较大，不适合进行微量蛋白质混合样品的分离检測，而且对于等电点相近的蛋白质的分辨能力有限，分离效果有待提高。针对这些不足，发展了基于毛細管的等电聚焦方法(cIEF)，利用载体两性电解质在石英毛細管内进行样品的等电聚焦(杨春，张玉奎，张丽华中国专利CN1831526A)，能有效降低所需试剂和样品量、缩短分离时间、提高分辨率 (张玉奎，朱贵杰，张丽华，杨春，刘和春，张维冰中国专利CN1865991A ；屈锋，蔡波大，马文韬中国专利CN101556^K)A)，并且可以和其他分离方法进行耦联(张祥民，毛煜，中国专利 CN1316244C)。但毛細管结构简单、功能単一，无法在结构上进行改进以进一步提高分析性能。微流控芯片是利用各种微加工技术在芯片材料上加工出具有各种功能的微结构， 实现反应、分离、检测等功能。自20世纪90年代初Manz和Widmer等(Manz A，Graber N, Widemer H M. Sens. Acturators，B，1990，1，244-248)首次提出以来，微流控芯片技术得到了快速发展。在微流控芯片上进行等电聚焦分离，能够有效降低试剂消耗、加快分离速度和提高分离效率(Chen，H.，Fan, Ζ. H. Electrophoresis, 2009, 30, 758-765) 在微流控芯片上进行等电聚焦已有大量的报道，表现出了优异的性能(Hofmarm，0.，Che, D. P.， Cruickshank, K. A. ，Muller, U. R. ，Anal. Chem. 1999,71,678-686 ；Tan, W. ，Fan, Ζ. H. ，Qiu, C. X.，Ricco, A. J.，Gibbons, I. Electrophoresis 2002，23，3638-3645)。但目前已报道的利用微流控芯片进行等电聚焦的方法，仍主要延续cIEF的方法，较少在微通道结构上进行改进以提高分离性能，对于等电点比较接近的样品，仍无法达到很好的分离效果，分离分辨率还有待进ー步提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于等电聚焦分离的微流控芯片。
本发明设有2片基底，所述2片基底经可逆或非可逆键合形成，在1片基底上加工有微通道和出入孔，所述出入孔作为储液池，所述微通道设有收缩区域和扩大区域，所述收縮区域与扩大区域之间设有过渡的连接区域，所述连接区域具有倾角，以便于蛋白质等样品在微通道内的运动和分离。所述微流控芯片可由石英、玻璃、硅、高聚物或者其他材料制作而成，也可以是锯齿形的固相PH梯度(IPG)胶条。所述微通道可采用IGP胶条，通过收缩区域和扩大区域在电场作用下实现非线性的PH梯度。所述微通道(IPG胶条)的宽度可为Inm 5cm，长度可为Ιμπι lm。扩大区域和收缩区域的宽度的比值可为1 107，可以通过调节不同的宽度，实现不同比值的微通道结构。所述微通道可以是直形、盘管形、矩形或螺旋形等，所述微通道可以是单根通道或多根平行通道。以下给出本发明的使用方法1)将样品溶解在含有 5%载体两性电解质的电泳缓冲液内，并加入到微通道内，在微通道两端的出入孔(储液池)中分别加入阳极和阴极缓冲液。2)将电极插入阳极和阴极缓冲液中，并施加电压进行等电聚焦，电压范围为IV 10万V。载体两性电解质会根据电场分布和电压降在微通道内形成相应的PH梯度，样品由于各自的等电点不同而在PH梯度中带上不同的电荷。带有电荷的样品在电场作用下在pH 梯度中进行迁移，直到迁移到某一位置。这ー位置的PH值与样品的等电点一致，样品在此位置会失去电荷呈电中性而停止迁移。不同的样品由于具有不同的等电点从而能在微通道内实现分离。3)所述样品可以是但不限于生物分子及化合物，如蛋白质和相关化合物(如多肽、肽、单克隆或多克隆的抗体、可溶的或结合的受体、转录因子等)；核酸和相关化合物 (例如DNA、RNA、寡核苷酸或其类似物、PCR产物、基因组DNA、細菌人工染色体、质粒等)；抗原、配体、半抗原、碳水化合物和相关化合物(例如多糖、低聚糖等)；细胞片段，如細胞膜片段、細胞器、完整細胞、細菌、病毒、原生质等；药物；受体等。传统的等电聚焦是在两性电解质(或IPG胶条)上形成线性的pH梯度从而实现蛋白质等样品的等电聚焦分离，本发明的突出特点在于在PH梯度范围为定值的前提下，利用微通道宽度的周期性变化，引起通道内电场分布也呈规律性的变化，以形成非线性的PH梯度，使等电点比较相近的蛋白质样品能够实现更高分辨率的分离。本发明是基于微流控芯片技木，具有尺度小、试剂省、分离快以及便于集成化和自动化等特点。微流控芯片利用微加工技木，能够一次性地加工出成百上千个重复的微结构，成本低廉、制作简单、操作简便、 效率可观，在等电聚焦分离方面具有良好效果和实际意义。本发明是加工具有锯齿状微通道的微流控芯片，通过电场在微通道内的非均勻分布实现非线性的PH梯度，用于蛋白质等生物样品的等电聚焦分离。
图1为本发明实施例的结构俯视图。图2为图1的A-A剖面(微通道)的构型示意图。图3为本发明实施例的锯齿形微通道内的电场等势线图。在图3中，微流控芯片水平放置，横坐标为平面X方向，纵坐标为平面Y方向，微通道沿X方向延伸。
图4为本发明实施例的锯齿形微通道和等宽度微通道内的PH梯度对比图。在图4 中，横坐标为微通道延伸方向，纵坐标为PH值；虚线是在等宽度微通道内形成的线性pH梯度，实线是在锯齿形微通道内形成的非线性PH梯度。图5为本发明实施例的锯齿形微通道与等宽度微通道内进行等电聚焦分离的效果对比示意图。在图5中，横坐标为微通道延伸方向，纵坐标为pH值；下图中的直线是在等宽度微通道内形成的PH梯度，折线是在锯齿形微通道内形成的pH梯度；上图是等电点不同的两个蛋白质分别在两种不同PH梯度中经等电聚焦分离后所处的不同位置。
具体实施例方式以下实施例将结合附图对本发明作进ー步的说明。实施例1參见图1和2，微通道的收缩区域4和扩大区域5长度均为40 μ m,宽度分别为 50 μ m ^P 100 μ m，其比值为2。收缩区域4和扩大区域5之间的连接区域6长度为10 μ m。 由通道收缩区域4、扩大区域5和连接区域6三个部分組成的重复结构的长度可为100 μ m。 不同宽度的通道在电场中具有不同的电阻率，具有不同的电压降，在等电聚焦过程中实现非线性的PH梯度。常规的等电聚焦中采用的IPG胶条有几种规格，长度分别为7cm、llcm、 17cm、18cm和Mem。若制作与IPG胶条相同长度的微通道，则分别可加工700、1100、1700、 1800和MOO个重复结构。如果每个重复结构均容纳ー个样品，则峰容量可分别达到700 个、1100个、1700个、1800个和MOO个。对于pH范围最大的IPG胶条(范围从pH = 3到 pH = 10)，其 pH 分辨率分别达至Ij 0. 0100,0. 00636,0. 0042,0. 0039 和 0. 0030。如果选择 pH 范围较窄的IPG胶条，可以实现更高的pH分辨率。同时可根据需要，减少重复结构的尺寸进ー步增加重复结构的数目以实现更高的峰容量和更高的分辨率。微流控芯片1由两片基底7经可逆或非可逆键合所形成，在一片基底上加工有微通道2和出入孔(储液池)3。所述微通道2的构型如图2所示，微通道由收缩区域4和扩大区域5的重复结构共同组成微通道，收缩区域4与扩大区域5之间过渡的连接区域6具有一定的倾角，以便于蛋白质等样品在微通道内的运动和分离。重复结构的尺寸可根据需要和加工能力进行加工。微流控芯片可以是由石英、玻璃、硅、高聚物或者其他材料制作及加工而成，也可以是锯齿形的固相PH梯度(IPG)胶条。所述微通道(IGP胶条)由收缩部分和扩大部分连接在一起組成重复结构，通过收缩部分和扩大部分在电场作用下实现非线性的PH梯度。微通道(IPG胶条)的宽度范围是Inm 5cm，长度范围是1 μ m lm。扩大部分和收缩部分的宽度的比值范围是1 107，可以通过调节不同的宽度，实现不同比值的微通道结构。所述微通道(IGP胶条)可以是直形、盘管形、矩形、螺旋形，可以是单根通道，也可以是多根平行通道。图3给出本发明所述用于等电聚焦的微流控芯片的锯齿形微通道内的电场等势线图，黒色线条为等势线。等势线集中在收缩区域是因为收缩区域的电阻比扩大区域大，电场强度较大，电压降也相对较多，所以形成的PH梯度也集中在收缩区域。根据收缩区域和放大区域的截面积对比，会形成如图4所示的非线性的pH梯度，其中的虚线为线性pH梯度。具有不同等电点的蛋白质等样品在锯齿形微通道内会有更大的几率聚焦于收缩区域，由于间隔有扩大区域能实现更大分辨率的分离。 图5为具有接近等电点的两个样品在两种不同pH梯度内的分离效果示意图。虚线1所对应的位置为线性PH梯度内，两个样品峰所处的位置；虚线2为在非线性pH梯度内，两个样品峰所处的位置。后者中两峰所处的位置相距更远，峰的分离度更高。如果两个样品在非线性PH梯度内被聚集于同一个收缩区域内，可通过对pH梯度的微调、改变或平移 PH梯度，使这两个样品的聚集点分別位于扩大区域两侧实现更灵敏的分离。
权利要求
1.ー种用于等电聚焦分离的微流控芯片，其特征在于设有2片基底，所述2片基底经可逆或非可逆键合形成，在1片基底上加工有微通道和出入孔，所述出入孔作为储液池，所述微通道设有收缩区域和扩大区域，所述收缩区域与扩大区域之间设有过渡的连接区域。
2.如权利要求1所述的ー种用于等电聚焦分离的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片采用石英、玻璃、硅、高聚物制成。
3.如权利要求1所述的ー种用于等电聚焦分离的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片采用锯齿形的固相PH梯度胶条制成。
4.如权利要求1所述的ー种用于等电聚焦分离的微流控芯片，其特征在于所述微通道采用IGP胶条。
5.如权利要求1或4所述的ー种用于等电聚焦分离的微流控芯片，其特征在于所述微通道的宽度为Inm 5cm，长度为1 μ m lm。
6.如权利要求1所述的ー种用于等电聚焦分离的微流控芯片，其特征在于所述扩大区域和收缩区域的宽度的比值为1 107。
7.如权利要求1或4所述的ー种用于等电聚焦分离的微流控芯片，其特征在于所述微通道为直形微通道、盘管形微通道、矩形微通道或螺旋形微通道。
8.如权利要求1或4所述的ー种用于等电聚焦分离的微流控芯片，其特征在于所述微通道为单根通道或多根平行通道。
9.如权利要求1所述的ー种用于等电聚焦分离的微流控芯片，其特征在于所述连接区域具有傾角。
全文摘要
一种用于等电聚焦分离的微流控芯片，涉及微流控芯片。设有2片基底，2片基底经可逆或非可逆键合形成，在1片基底上加工有微通道和出入孔，出入孔作为储液池，微通道设有收缩区域和扩大区域，收缩区域与扩大区域之间设有过渡的连接区域，连接区域具有倾角。在pH梯度范围为定值的前提下，利用微通道宽度的周期性变化，引起通道内电场分布也呈规律性的变化，以形成非线性的pH梯度，使等电点比较相近的蛋白质样品能够实现更高分辨率的分离。具有尺度小、试剂省、分离快以及便于集成化和自动化等特点，能够一次性地加工出成百上千个重复的微结构，成本低廉、制作简单、操作简便、效率可观，在等电聚焦分离方面具有良好效果和实际意义。
文档编号G01N27/447GK102565171SQ20121000399
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者付广春, 张博, 戴思敏, 陈宏 申请人:厦门大学