专利名称：一体化样品预处理装置及方法
技术领域：
本发明涉及一体化样品预处理装置及方法。
背景技术：
离心过滤器可用于为了浓缩、脱盐、纯化和分馏的目的而分离生物物质，如抗体 酶、核酸和蛋白质。这些装置最常用在离心分离器仪器中，离心分离器仪器可由固定角转子构造或摆动角转子构造或可变角转子构造构成。过滤过程的速度和滞留物样品的回收对于用户而言非常有价值。通过除去膜囊(持样器)且使样品在收纳管中反向转动，通常会获得高于85%的样品回收值。这些装置通常用于浓缩尿液、血清、血浆和脑脊髓液。例如，尿液中的特定蛋白质的测量结果对于各种疾病状态的诊断和处理可能很重要，但尿液中的这些蛋白质的含量通常很小而不能在没有首先浓缩蛋白质的情况下检测出。常规装置大体上包括壳体，壳体具有样品储槽；过滤器，过滤器密封在壳体中，以便样品在受到驱动力(如，离心作用)时必须穿过过滤器；以及用于收集浓缩样品的收集室。存在一类蛋白质纯化规程，该规程使用抗原-蛋白质亲和来将相关的蛋白质从混合样品(如细胞溶解产物或血清)分离。该规程通常使用较小珠粒，珠粒与抗体共轭，使得它们结合至来自于样品的特定蛋白质。一旦蛋白质有效地结合到珠粒上，则需要从珠粒中提取和收集蛋白质(抽提物)来用于下游的分析、化验研究等。示例性的下游分析技术包括2D凝胶电泳和质谱分析。存在在工艺流程中需要的大量处理步骤。这些步骤可包括在结合之前使珠粒与中性缓冲剂平衡、在结合之后清洗珠粒来除去未结合的污染物、抽提相关的蛋白质、从抽提出的蛋白质中交换缓冲剂、浓缩最终稀释的样品以及最后回收纯化的蛋白质样品。对于亲和纯化和免疫沉淀规程，结合到珠粒上的蛋白质是相关的蛋白质。对于去除规程，未结合的部分(未结合至珠粒的蛋白质)为相关的样品。在这些纯化方法中使用的珠粒为磁性的或非磁性的。一种最常用的非磁性珠粒为琼脂糖。磁性珠粒是可从EMD Millipore市售获得,如用于从血清中进行蛋白和IgG去除的PureProteome蛋白质A&G、PureProteome白蛋白和PureProteome白蛋白和IgG,用于染色体免疫沉淀的Magna ChIP蛋白质A珠粒以及用于His标记重组纯化的PureProteome镍磁性珠粒。当用磁性珠粒工作时，当前人工方法依靠使用移液管来往返于样品管(缓冲剂等)移动液体，且将样品从一个装置移动至另一个。磁铁用于将珠粒保持在样品管的一侧，以便使用者可在不干扰珠粒的情况下吸出缓冲剂。在通常的结合/清洗/抽提工艺流程中，每个样品有大约8个移液步骤。对于与珠粒结合的最佳蛋白质，对这些方法需要孵育。包含珠粒和样品的装置通常在立式圆筒形混合机中转动10至30分钟，或放置在振荡器(例如，漩涡振荡器)中振荡10至30分钟。当添加新缓冲剂如清洗缓冲剂和抽提缓冲剂时，使用者将使装置旋动一分钟左右来混合和清洗。清洗和抽提步骤需要重复若干次，以便有效。例如，标准规程在于将清洗缓冲剂加至样品瓶，旋动(混合)一分钟左右，除去缓冲剂且重复两次或多次。在磁性珠粒的情况下，结合/清洗/抽提过程花费大约45分钟。磁性珠粒的备选方案为琼脂糖珠粒。使用琼脂糖珠粒的一种可市售获得的装置包括带有开口底部和定位在开口底部上的多孔玻璃料(porous frit)的管。台式离心机用于驱动流体穿过玻璃料且进入收集管(通常地为4mL或15mL的管)中，从而代替使用移液管从样品管除去流体。玻璃料的孔径选择成用以保持珠粒，同时允许缓冲剂和蛋白质穿过。·取决于使用的转动柱的尺寸，该工艺流程相比于使用磁性珠粒的方法可能很麻烦且耗时。台式离心机通常为定位在公共场所处的设备的共用件；这不同于各使用者可在其工作区域处已经摆放的微离心机。该过程需要每个样品有16个移液步骤，且花费大约I小时来完成。对于磁性工艺流程和琼脂糖工艺流程两者而言，下游步骤可包括交换载体缓冲剂和浓缩稀释的样品。在期望样品的缓冲剂交换，或许用以除去抽提物(如咪唑)的情况下，通常用夹具等将样品转移至透析膜管，当通过扩散的方式逐渐地交换缓冲剂时，透析膜管然后就放置在交换缓冲剂的槽内达到24小时。在期望缓冲剂交换和浓缩的情况下，可使用透析过滤/蛋白质浓缩装置，如带有多孔UF膜的离心装置，多孔UF膜的尺寸确定为用以保持蛋白质，但允许缓冲剂穿过。通过控制转动时间和选择适合的装置设计，可控制最终浓度。为了使缓冲剂交换有效，缓冲剂交换步骤需要重复两次或三次(像用清洗步骤和抽提步骤完成的那样)。这些装置花费30至45分钟,且需要在离心机中进行若干次转动。在可由EMDMillipore市售获得的AmiconUltra装置中，有5个移液步骤用于缓冲剂交换和浓缩。当蛋白质样品的体积变得较小时，由装置内的滞留体积造成的不期望的样品的潜在损失已经变得比平常更重要。当前数据间接表明50 y L的浓缩样品中的IOy L的损失表示80%的蛋白质回收。如果蛋白质损失从IOiiL至Iiim减小了一个数量级，则蛋白质样品回收可从80%增大至98%。蛋白质样品回收中的18%的改善可能很有价值。将期望的是，提供一种装置和方法，该装置和方法高效地且有效地执行结合和清洗、缓冲剂交换和浓缩和/或在单个装置中进行完整的结合、清洗和抽提、缓冲剂交换和浓缩，而不需要移液管在装置之间转移贵重的样品，特别是对于大小达到大约IlmL的样品。
发明内容
通过本文公开的实施例已经克服了现有技术的问题，在某些实施例中，本文包括一种样品预处理装置，该样品预处理装置允许结合和清洗、缓冲剂交换和浓缩，和/或在没有在若干装置之间转移样品的情况下执行完整的结合、清洗、抽提、缓冲剂交换和浓缩过程。根据某些实施例，提供了一种离心装置，其包括储槽，储槽具有入口、用于保持介质(如珠粒填充床)的柱、用于以密封关系收纳过滤装置的支座区以及出口。根据某些实施例，过滤装置包括具有样品储槽的壳体、设置在壳体中的一个或多个(优选两个)大致垂直地定向的膜(在存在一个以上的情况下间隔开)、与各膜相关联的暗沟，使得穿过各膜的流体流过相应的暗沟进入滤液收集室中。过滤装置插入离心装置的支座区中，且该组件可放置在可选的支座中。具有或没有可选的支座的组件可放置在用于离心作用的常规离心管中。可在没有任何移液管转移(和相关样品损失)的情况下用该装置执行整个结合、清洗、抽提、缓冲剂交换和浓缩步骤，从而导致较好的相关样品的回收。该样品预处理装置还可用于结合和清洗步骤，在此情况下，不需要过滤装置，且该样品预处理装置还可用于缓冲剂交换和浓缩步骤，在此情况下，不需要介质。可在相同的装置中执行若干次缓冲剂交换。根据某些实施例，该装置可包括可收缩的供给管，以便有助于减少累积在供给管的内部润湿开孔和外表面上的样品溶液的损失。
根据某些实施例，样品与介质在装置中的适当位置上进行孵育，以便所选择的目标结合到介质上。然后，可清洗掉剩余的未结合的样品。通过添加缓冲剂从介质中抽提相关的目标样品来使样品纯化，缓冲剂导致介质将获取的目标释放回溶液中。一旦纯化样品，则样品可浓缩成可使用的浓度来用于分析或储存(大多数蛋白质在接近lmg/ml的浓度下储存时最稳定)。根据某些实施例，样品预处理装置可包括偏压部件或隔膜，可促动偏压部件或隔膜来从装置中抽出较小数量(value)的样品(例如，滞留体积)。该样品预处理装置导致用于结合和清洗、缓冲剂交换和/或结合、清洗、抽提和浓缩规程的总体时间的节省。不需要样品移液，从而导致较高的样品回收。利用用于各缓冲剂交换和清洗步骤的单个离心机转动步骤，而非先前需要的若干次转动步骤，缓冲剂交换就可在大致可能比先前少的时间内执行。不需要结合孵育周期。根据某些实施例，过滤装置与交换室之间的组装界面可允许相对的移动或分离，如通过机械构件(如物理止挡件)或通过自促动几何结构，自促动几何结构受到离心压力梯度来除去与获取的目标接合的末梢来优化样品回收。用所公开的装置和方法实现的优点包括但不限于缩短用于亲和分离过程的孵育时间；改善一个装置平台中的样品浓缩；改善使用反转转动出离心装置的样品回收；以及改善单次转动缓冲剂交换稀释。
图I为根据某些实施例的储槽/交换部件的截面形式的透视图；图IB为根据某些实施例的包含预先填充珠粒柱的储槽/交换部件的截面形式的透视图；图2为根据某些实施例的储槽/交换部件和过滤装置的分解视图；图3为根据某些实施例的过滤装置的垂直定向的截面侧视图；图4为根据某些实施例的储槽/交换部件和定位于其中的过滤装置的截面形式的透视图；图5为根据某些实施例的储槽/交换部件、过滤装置、可选的组件支座、离心管和盖的分解视图；图6为根据某些实施例的包括储槽/交换部件、过滤装置、组件支座、离心管和盖的组件的截面视图；图7为根据某些实施例的包括储槽/交换部件、过滤装置、组件支座、离心管和盖的组件的截面视图，示出了定位在过滤装置的死体积区(dead stop volume)中的储槽/交换部件的末梢；图8为根据某些实施例的包括储槽/交换部件、过滤装置、组件支座、离心管和盖的组件的截面视图，示出了抽离出过滤装置的死体积区的储槽/交换部件的末梢；图9为根据某些实施例的结合、清洗、抽提和浓缩装置的分解透视图；
图10为示出根据某些实施例的由过滤装置中的交换部件占据的体积的截面视图；图11为根据某些实施例的具有带有用以允许离心作用期间的轴向移动的回旋部分的储槽/交换部件的截面视图；图12为根据某些实施例的具有用以允许离心作用期间的轴向移动的薄壁部分的储槽/交换部件的截面视图；图13为根据某些实施例的具有用以允许离心作用期间的轴向移动的一体模制(over-molded)的薄壁部分的储槽/交换部件的截面视图；图14为示出柱的外表面上的模制的粗糙部的位置的储槽/交换部件的简图，并且该分解的细节示出了润湿表面和气体边界层的截面；图15为根据某些实施例的隔膜盖的底部透视图；图16为根据某些实施例的图15中的隔膜盖的顶部透视图；图17为根据某些实施例的包括图15中的隔膜盖的储槽/交换部件的截面视图；图18为根据某些实施例的具有用以容纳图15中的隔膜盖的改变的凸缘的储槽/交换部件的顶部透视图；图19为根据某些实施例的包括隔膜盖的组件的截面视图；图20为储槽/交换装置的顶部透视图，示出有在开启位置上的附连的隔膜盖；图21为储槽/交换装置的侧视图，示出有在开启位置上的附连的隔膜盖；图22为根据某些实施例的包括隔膜和15ml过滤器的储槽/交换装置的分解视图；图23为根据第一备选实施例的储槽-交换装置的透视图；图24为根据第二备选实施例的储槽-交换装置的透视图；图25为根据第三备选实施例的储槽-交换装置的透视图；图26为示出根据某些实施例的具有和没有隔膜的装置的滞留体积的图表；以及图27为将3次转动过程与根据某些实施例的结合-清洗-抽提过程相比较的图表。
具体实施例方式首先转到图1，示出了根据某些实施例的储槽/交换部件12。作为优选，部件12由弱结合的透明材料制成，该透明材料能够经得起离心作用期间通常遇到的力。适合的材料包括透明的聚丙烯或聚碳酸酯。在某些实施例中，部件12包括具有开口顶部(入口)的大体上圆柱形的样品储槽14，但其它形状也适合，且在本文公开的实施例的范围内。可提供具有大于储槽14的外径的外径的顶部环形凸缘16，该凸缘16可坐落在离心管盖(图I中未示出)中。储槽14的体积或容量并未特别地限制，且可基于样品大小和/或过滤装置的大小来选择，储槽将连接到过滤装置上。示例性体积包括3ml和11ml。在某些实施例中，储槽14的底部为截头圆锥形、向下地(从开口顶部沿流体流动的方向)且沿径向向内地成锥形，汇合至中心开口，这导致柱18的直径小于储槽14的直径。柱18的上部具有选择为用以保持足量的介质30来执行结合步骤的直径和长度，且因而在结合操作期间沿样品流动方向定位在样品储槽14的下游。在不期望结合(例如，缓冲剂交换和浓缩规程)的实施例中，可从柱18上省略介质。作为优选，柱的直径和长度足以保持至少200微升的珠粒，从而创造出填充床。示例性直径为大约1/4英寸，其中长度为1/2英寸或更长。在使用介质的情况下，介质保持结构如多孔玻璃料31可放置在介质20下方来将介质保持在适当位置 上，在预先填充柱的情况下，对定位在介质的上方来使介质包含在柱直径(图1B)内的附加保持结构31a将存在需求。柱18可包括环形凸缘19，环形凸缘19提供肩部或止挡件，在使用期间，过滤装置50定位成抵靠肩部或止挡件(例如，用介入的垫圈40 (图2)，垫圈40提供了过滤装置50与部件12之间的液体密封界面)。在环形凸缘19的下方，柱具有中间直径的支座区20，支座区20在使用期间定位在柱上时，收纳在过滤装置的样品储槽的上部中。区20具有小于环形凸缘19的外径的外径。具有小于区20的外径的外径的进一步成阶梯状直径的下游部分21在使用期间定位在柱上时，在膜上方坐落于过滤装置的样品储槽部分的下区中。柱18的区22具有翼片状的几何结构，从相对较厚的上部22a至相对较薄的下部22b沿径向成锥形，且限定结合/抽提室。在较薄部分22b处，柱在22c处沿径向向内成锥形，优选为中心地定位且在茎部23处汇合，茎部23具有开口的底端24，茎部从翼片形状的柱沿轴向延伸。翼片状的特征定形为配合在匹配的过滤装置50的内侧，该匹配的过滤装置50带有挖空的内部来保持统一的壁厚。根据某些实施例，翼片状的特征允许柱18的区22占据过滤装置50的膜12A和12B之间的大致整个体积，因而将期望的样品体积保持在开口底端24的附近。作为优选，茎部为圆柱形，且朝开口底端24沿径向向内成锥形。开口底端24允许储槽14 (通过存在的任何介质和玻璃料和通过区22(结合/抽提室))与下游装置(如管或过滤装置)之间的流体连通。根据某些实施例，介质可为层析介质，如用于在样品中获取所选择的分析物且在适当地改变缓冲剂状态时将分析物释放的介质。适合的介质包括结合金属螯合物、蛋白质A、谷胱甘肽、白蛋白等的珠粒。介质可为磁性的、非磁性的、琼脂糖等，且可用某些化学制品如IMAC、蛋白质A、谷胱甘肽、链酶亲和素等来改性。因此，介质可包括用以执行期望的结合的适当的化学制品。根据某些实施例，翼片状的下部和柱可形成单个可分离的特征，该特征可附接到储槽14上，如通过搭扣配合、鲁尔配合(luer fit)、螺接等。由于储槽部分可清洗且可再使用，故可分离的特征减少了塑料的浪费量和一次性使用的成本。图23中示出了在柱18可除去的情况下的示例性装置。尽管任何适合的连接机构都可用于将柱18连接到储槽14上，但图23示出了一个实施例，其中柱18包括螺纹部分118，螺纹部分118以螺纹方式收纳在储槽14的下部114中，下部114包含内槽145，内槽145与螺纹部分118上的螺纹匹配。作为优选，下部114为圆柱形,且限定有(circumscribe)喷口 146,喷口 146与储槽14流体连通。柱18的可除去性允许了结合相同储槽14使用不同的柱18的灵活性。图24和图25示出了若干柱可附接到储槽上的情况下的类似的实施例。例如，图24的实施例中的储槽14'具有两个出口，且两个可除去的柱18A和18B可分别附接到相应的出口上。类似地，图25的实施例中的储槽14"具有四个出口，且四个可除去的柱18A，18B，18C和18D可分别附接到相应的出口上。图2为部件12和过滤装置50的分解视图，其中过滤装置50示出为定向成由部件12的柱18收纳。鉴于柱18的区22的平坦构造和锥形构造，且鉴于过滤装置50的对称，故过滤装置50可仅以两种方式中的一种方式配合在柱1 8上；一种方式是图2中所示的，而另一种方式是从此处旋转180°。在所示的实施例中，垫圈40用于提供过滤装置50与部件12之间的不透液体的密封。可使用其它密封机构，如0形环或常规形状的一体模制密封件，包括端面密封件、挠性簧片型密封件等。该一体模制的密封件可为整体地模制的。现转到图3，示出了适合根据某些实施例使用的过滤装置50。过滤装置50为第2009/0078638号美国出版物中描述的过滤装置，该出版物的公开内容通过引用并入到本文中。装置50包括用以收纳未过滤的样品的样品储槽11以及分别布置在如所示的装置50的侧壁上的第一膜12A和第二膜12B。限定死体积的滞留物室14设在膜12A和12B的下方。大体上为弧形且从装置的底部周边向外突出的收集末梢30可提供成使得死体积定位在装置的中心线处，且随后在离心机中的定向角改变时减少死体积的可变性。作为优选，装置50由液体不可渗透的固体材料制成，具有弱蛋白质结合特性，且足够坚固而经得起离心作用期间施加的重力(Gs)。适合的材料包括丙烯酸、CYROLITE G20 HiFlo树脂、ESTAR HN631树脂和KRATON聚合物。具体而言，侧面板可由透明塑料材料制成，透明塑料材料使操作人员或使用者能够看到装置的内腔，以便在过滤过程之前和之后确定流体的高度。侧面板分别包括暗沟支承件，暗沟支承件支承膜，且提供与滞留物室14的流体连通。例如，暗沟支承件可包括定位在膜的下方的一系列间隔开的纵向槽、通道或表面纹理，以便在滤液穿过膜时获取滤液且将滤液朝排放孔引送且引送到收纳瓶中。各膜均密封到相应的侧面板上，以便仅穿过膜的流体可流出定位在侧面板中的装置的排放孔。在某些实施例中，各膜12A，12B均随相应的暗沟支承件共同延伸，且密封到暗沟支承件上。暗沟的几何结构旨在支承膜且保持其尽可能的平坦，同时允许膜下方有足够的开放空间，以便使流体能够流动且穿过装置的排放孔18。优选的是，保持液压流体阻力尽可能低。适合的膜包括多微孔膜和超多孔膜，后者可用于超过滤。再生纤维素超过滤膜(例如，可从马萨诸塞州贝德福德的Millipore公司(Millipore Corporation of Bedford,Mass)获得的"Ultracel Amicon YM"膜和"Ultracel PL"膜)很适合目标为用于使得极度稀释的样品液体或憎水性样品液体浓缩或脱盐的装置。使用具有"紧密"微观结构的亲水性膜以蛋白质、DNA和其它大分子的弱吸收促进了良好保持。聚醚砜超过滤膜(例如，也可从Millipore公司获得的"Amicon PM"和"Biomax PB")或具有适合快速分离的"开启"微观结构的其它类似的膜更适合目标为用于使得更浓缩的样品液体(如血清、血浆和带条件的组织培养物)浓缩和脱盐的装置。作为优选，各膜12A，12B均定位成相对于装置10的纵向中心线成较小的角，使得各膜的顶部与纵向中心线间隔开的距离大于膜的底部的与其间隔的距离。形成了漏斗形的构造。这样定位各膜利用了离心作用期间的切向流动效果。已经发现大于大约0°且小于大约5°，优选为大约3°的角是适合的。侧面板分别包括一个或多个排放孔18 (图2)，排放孔18与滞留物室14流体连通，且使滤液能够穿过装置壳体来用于收集在另一壳体中。作为优选，各排放孔18均定位在相应的暗沟槽或通道的底部处，且作为优选大致为圆形的截面。排放孔应当定位在离面板的侧缘有足够的距离处，以便在装置的制造期间可使用的热密封操作期间不使孔收缩或以其它方式不使孔有害地改变。作为优选，排放孔18与彼此等距间隔开且共线。图4示出了根据某些实施例的部件12，部件12带有定位在部件12的柱18上的适 当位置上的过滤装置50。可看到垫圈40提供了过滤装置50与柱18的凸缘19之间的密封界面。作为优选，如下文更为详细描述的那样，部件12的茎部23定位在过滤装置50的死体积内。如图5中可见，根据某些实施例，在通常地施加到组件上的离心力下将部件12保持为附接到过滤装置50上成问题的情况下，可提供可选的组件支座60。在某些实施例中，支座60可由与部件12相同的材料制成，且包括构造成用以收纳部件12的储槽14的圆柱形顶部保持套筒62。沿径向向外延伸的顶部环形凸缘6提供了用于部件12的环形凸缘16的基座。根据某些实施例，保持套筒62的底部63为截头圆锥形，以便收纳储槽14的类似形状的底部。底部63中中心地定位的孔口通向具有开孔的沿轴向延伸的圆柱形柱64。开孔定形为用以收纳过滤装置50，使得过滤装置50的下部沿轴向突出开孔外(图6)。为了组装如用于离心作用的构件，过滤装置50可插入部件12的柱18上，且然后可插入支座60中。然后，该组合可放置到常规离心管70 (例如，15ml或50ml)中，常规离心管70具有一定外径，使得凸缘61坐落在管70的顶表面上(图6)。然后，盖72可螺接到管上，或以其它方式连接来将组件固定在管中。在省略可选的支座60的情况下，部件12的凸缘16坐落在管70的顶表面上。对于大多数纯化和IP规程，可用与柱22分离的过滤装置来执行结合和清洗步骤。然后，过滤装置可附接到柱22上，且通过离心作用从装置中直接地抽提出蛋白质。对于其中未结合的部分为相关样品的去除而言，可从该过程的一开始就保留过滤装置附接到柱22上。在某些实施例中，介质柱30更像是层析柱，将介质(优选为珠粒)聚集到柱中。这创造出填充床，在填充床中，驱动流体以一种方式穿过该填充床，使得增大了活动(流过)相与静止(介质)相之间相互作用的概率。这导致了更高效的结合、清洗和抽提。实际上，清洗和抽提步骤的数量可分别从三个减少至一个，其中需要最少的结合(孵育)时间或不需要结合(孵育)时间。当仅使用单个浓缩步骤时，回收的蛋白质显示出了增大的活性。当期望结合(孵育)时，玻璃料31优选为憎水性玻璃料，憎水性玻璃料阻止样品流过玻璃料，因而允许延长孵育时间，直到离心作用才开始流动。例如，包括憎水性材料的玻璃料使琼脂糖能够在没有滴注的情况下在磁性珠粒溶液中孵育，且当受到大约100G至大约700G之间的离心G力时，玻璃料允许滤液通过而进入收纳管中。适合的材料包括由Porex公司制造的容器烧结聚丙烯(case sintered polypropylene)和由Filtronna公司制造的细丝挤出的聚丙烯(filament extruded polypropylene),细丝挤出的聚丙烯已经用表面涂层处理过，如氟化等离子处理。在期望不结合如用于缓冲剂交换和浓缩的情况下，可从组件中省略介质。还可省略玻璃料(介质保持结构)，但由于玻璃料不干扰缓冲剂交换，故如果期望的话，玻璃料可保留在装置中。柱22的翼片形的下部允许比常规方法更高效地交换新鲜缓冲剂溶液。尽管没有通过任何理论来约束本发明人，但相信其功能基于透析过滤原理。交换柱与过滤装置之间匹配的几何结构优化了新鲜缓冲剂穿过系统的流动。根据某些实施例，作为优选，翼片形的几何结构填充过滤装置内的大多数未使用的腔空间，且将样品体积保持在出口孔24附近。由于柱22内的新鲜缓冲剂和过滤装置内的样品在离心作用期间处在静态平衡状态，故在新鲜缓冲剂的压头高度减小时，在任何给定时间离开系统的样品的体积就较小，同时有涌过的大量的新鲜缓冲剂。这导致了高效率。如可在图10中看到 的那样，面对膜12A的翼片的表面之间(和面对膜12B的翼片的表面之间)的偏移量"A"大于面对过滤装置的表面的翼片的表面之间的偏移量"B"((例如，在81A和81B处)不存在膜的情况下)，以便翼片不会闭塞膜的部分，其可阻挡穿过膜的流动。在一个实施例中，面对各膜的翼片的表面之间的偏移量"A"为从大约0.005英寸至大约0.02英寸，优选为0.020英寸。在不存在膜的情况下，面对过滤装置的表面的各翼片的表面之间的偏移量"B"在大约0.020英寸至大约0. 005英寸之间,优选为大约0. 005英寸。优化的是,最大限度地减小(以便优化交换率)样品的体积量，同时优化膜的流动特性。翼片的几何结构有助于使流体位于膜的活性区域与翼片之间，且最大限度地减小非活性膜区与翼片之间的流体量。此外，通过将茎部23定位在过滤装置的死体积中，当新鲜缓冲剂总是可经由缓冲剂交换柱获得时，就加强了混合，避免了变性引起的聚合，且防止了蛋白质的干燥。由于控制体积形成在死体积的流体空间中，故实现了缓冲剂溶液的更高效的混合。稳定流动系统存在于该控制体积内。缓冲剂溶液从储槽14进入，且混合的溶液通过排放孔18流出。在控制体积内，流出末梢23的缓冲剂溶液流创造出且保持漩涡混合流。就是该漩涡流创造出更高效的缓冲剂溶液和样品流体的混合。如可在图7中看到的那样，当交换装置的末梢23在离心作用期间几乎没入过滤装置50的样品体积隔间的底部时(没有接触底部表面，其可闭塞流出孔且阻碍向外流动)，实现了最佳且高效的缓冲剂交换。根据某些实施例，如图8中所示，一旦已经完成缓冲剂交换，则存在的附加利益为能够提供末梢23与过滤装置50之间的相对移动，如通过在离心作用期间将交换装置的末梢23升离样品。这减小了由于材料的表面张力而粘附于末梢的外表面和内表面上造成的潜在样品损失。可通过机械构件(如物理止挡件)或通过自促动几何结构来实现末梢与过滤装置之间的相对移动，自促动几何结构受到离心压力梯度来除去与获取的目标接合的末梢来优化样品回收。包括可收缩的末梢的设计(如图11中所示的末梢)有助于减少累积在末梢的内部润湿开孔和外表面上的样品溶液的损失。首先，浓缩的蛋白质样品溶液已定位在过滤装置50的底部处。将缓冲剂交换溶液添加至储槽14，且允许缓冲剂交换溶液穿过玻璃料材料且进入过滤装置中。在离心转动操作期间，现在缓冲剂交换溶液进入发生混合的过滤装置50中。这种混合使含盐浓缩的蛋白质样品通过缓冲剂交换溶液稀释。当已经经完成转动时，末梢23的端部可仍延伸到浓缩样品的体积中。毛细作用带入末梢的远端的内开孔中且还涂布末梢的外壁的表面的少量的样品可为5 y L或6 y L那么多。由于末梢的远端没入浓缩样品体积中，故发生了最成功的混合行为。—种选择在于执行次级转动操作来移动该5 y L至6 y L的溶液的损失。这可涉及停止离心机且使用机械保持件来以0. 100英寸的距离使得整个储槽升离出样品体积。然而，不期望使用次级转动。相反，可收缩的末梢设计(如图11至图13中所示的末梢)使得末梢能够由于离心机提速至转动速度时的G力而被拉入样品体积中，且使末梢能够在离心机转动减慢至零速度时从样品体积中弹性地退回。G力将末梢23拉入过滤装置50的样品体积的底部中，且促进最有效的混合行为，最有效的混合行为是在单次转动操作中实现缓冲剂溶液的最有效的稀释所需要的。在所有缓冲剂交换溶液都已经穿过装置之后，在转动减慢期间减小的流体静压力和减小的G力导致末梢23从样品体积中退回。退回的末梢使末梢的内开孔和末梢的外表面中的任何残余流体能够被拉离。 图11列举了根据某些实施例的单件式储槽14和末梢23可构造成如何在转动之前具有缩短的长度而在转动期间具有增大的长度。可通过在弹性体材料的薄壁部分中模制或以其它方式形成一个或多个(例如，一个到五个(示出了三个))的回旋部分90来实现伸长，弹性体材料的薄壁部分限定柱22，以便实现手风琴状的构造。一种适合的材料为注入模制的硅树脂，注入模制的硅树脂可在不破裂的情况下伸长50%至200%那么多。其它适合的材料可包括聚氨基甲酸酯和其它热塑性弹性体，且应当具有足够低的非特定蛋白质结合性能。如果在装置的储槽部分中需要较大的刚度，则弹性体回旋部分90可一体模制到由聚丙烯或等同材料制成的预先模制的储槽的端部上。图12示出了更简单的设计的实例，其中柱22包括直的且薄壁的部分91。已经从该实施例中消除了若干回旋部分。较薄的壁允许G力在离心作用期间延伸柱22的轴向长度。适合的薄壁厚度包括在大约0. 015英寸至大约0. 040英寸之间。图13示出了一体模制设计的实例。交叉影线绘制的储槽是预先模制的。柱22使用透明的或实际上透明的弹性体材料(如液体注入模制(LM)的硅树脂、热塑性弹性体或等同的材料)一体模制在储槽上。适合的材料应当具有非特定蛋白质结合性能，该性能将不会牺牲相关样品蛋白质的回收。根据某些实施例，可通过减少供给管柱22和/或末梢23的外表面的可用润湿表面面积来进一步改善样品滞留体积的减少，如通过在柱和/或末梢的外表面上包括粗糙表面或更有纹理的表面。该纹理表面可由表面粗糙部(小凸块)构成，表面粗糙部为至少大约IOy的直径且大约IOy的高度。这些表面粗糙部可使用低表面能量材料如聚丙烯、聚乙烯、PTFE或等同物模制在装置中。这些粗糙部创造出表面形貌，该表面形貌显著地减小了装置的表面上的润湿表面。粗糙部上仅最高点通过流体流润湿，且与样品流体相接触。谷或沟槽保持未润湿，且通过较薄的气体边界层覆盖，在此情况下，气体边界层通常地为空气。这显著地减少了润湿行为(憎水行为)造成的样品损失。这还显著地减少了可能由于样品流体的非特定蛋白质结合造成的发生损失的机会。低表面能量材料和其粗糙部表面几何结构(geometry)的组合可创造出称为莲花效应的效应，该效应有助于减少与流体的表面滞留相关联的样品损失以及低量高利益的蛋白质片段的不期望的结合。在将表面粗糙部模制到装置中可能太困难或不可行的情况下，相同表面22和23可涂布有娃乳化溶剂(silicon solvent emulsion),以便最大限度地减小装置的表面能量或可进行等离子处理。在期望进一步最大限度地增大样品回收(特别是使用高价值的样品溶液)的情况下，最大限度地减小由滞留体积和非特定蛋白质结合造成的样品损失是不可避免的。当蛋白质样品的体积变得较小时，由装置内的滞留造成的样品的非期望的损失的重要性已经增大。根据某些实施例，具有偏压部件或隔膜的隔膜盖可包括在装置中，以便挽救样品溶液的损失，如，样品溶液累积在供给管的润湿开孔上。例如，当完成离心作用时，少量的样品可通过毛细作用带入到供给管的远端的内开孔中。该少量的样品或滞留体积可为5 或IOy L那么多。可通过促动偏压部件来在装置中创造出压力且迫使该滞留体积的一些或所有都离开装置，就可从装置的内开孔中抽出该滞留体积的一些或所有。图15和图16示出了隔膜盖300，在某些实施例中，隔膜盖300可附连(优选为铰接)到储槽/交换部件12上。作为优选，隔膜盖300不干扰装置盖72。在某些实施例中，隔膜盖300包括周边301和从周边301沿径向向内定位的偏压区302。偏压区302从周边301经由肩部303成阶梯状，且包括用以允许空气逃逸的孔口 320。在某些实施例中，隔膜 盖300大体上为圆形，其中的周边301为环形圈，且偏压区也为圆形，且具有对应于部件12的样品储槽14的入口(例如，在凸缘16的位置处)的内径的直径。如可在图17中看到的那样，这样确定偏压区302的尺寸允许偏压区302的外周缘与部件12的内壁密封地接合。如图18中所示，在某些实施例中，储槽/交换部件12的凸缘16的顶表面包括盖收纳部分305。盖收纳部分从凸缘16的顶表面的剩余部分沿轴向略微凹入且包括按钮306，该按钮306向上延伸超过凸缘16的顶表面的剩余部分。按钮306在形状上对应于盖300的周边301中的孔口 307，该孔口 307形成在周边部分308中，该周边部分308从周边301 (图16)的剩余部分沿轴向略微凹入(以肩部311，312的高度)。如图16和图17中所示，第二孔口 313从周边部分308沿径向向内限定。在某些实施例中，按钮306的顶表面316比孔口 307 (在图19和图21中最佳可见)的宽度更宽，因而阻止了盖300无意间从储槽/交换部件12移出。凸缘16还包括沿径向凹入区307，沿径向凹入区307的形状和位置定位成与隔膜盖300上的沿轴向延伸的凸片309协作来允许隔膜盖300咬合到部件12上。因此，当隔膜盖300处于如图17中所示的封闭位置时，沿轴向延伸的凸片309定位在凸缘16的凹入区307中。在某些实施例中，沿径向凹入区307定位成与盖收纳部分305相对，且沿轴向延伸的凸片309类似地定位成与周边部分308相对。凸片309和凹入区307协作来使得隔膜盖能够单手操作。例如，使用者可将隔膜盖从其封闭位置移动至其开启位置，同时通过将他们的拇指的顶部放置在凸片的底部自由端下方且使凸片向上升高直到凸片从凹入区307释放来简单地保持装置。图20和图21示出了处于开启位置的隔膜盖20。在开启位置上，隔膜盖300经由按钮306保持联接到凸缘16上。孔口 313限定径向轴线，盖300可围绕径向轴线在开启位置与封闭位置之间枢转，因而限定活铰链。图22示出了包括较大的过滤器(如15ml的过滤器50')的实施例的分解视图。在所示的实施例中，尽管可存在组件支座，但并未使用组件支座。偏压部件或隔膜302由可变形的挠性材料制成，且因而在隔膜盖处于其封闭位置上的适当位置时，可容易地沿轴向偏斜，如通过使用者的食指偏斜。以此方式促动部件302在装置内创造出力，该力抽出供给管的内腔和远端管的内腔中的滞留流体，且因而减少或消除了滞留体积。隔膜盖300允许具有或没有处于适当位置的螺纹盖70的装置组件的离心作用。隔膜或偏压部件可为弹性体的或热成型的。实例I :亲和去除在该规程中，样品的主要污染物有选择地结合到介质上，同时相关的成分保持在溶液中。当完成结合步骤时，获取溶液来用于进一步的分析。添加结合白蛋白和IgG两者的珠粒来完全地组装结合、清洗、抽提和浓缩(BWEC)装置(例如，图9)。然后，添加血清样品且允许血清样品与珠粒相互作用，然后，珠粒通过经 由与固定抗白蛋白抗体和固定蛋白质A相互作用而将白蛋白和IgG吸收到珠粒的表面上来有选择地除去白蛋白和IgG。在孵育步骤之后，珠粒通过离心作用与液体中的未结合的成分分离。通过BWEC装置中的玻璃料阻拦珠粒，同时包含相关分析物和生物标记的溶液传递至下方的室。该室可简单地为测试管，或其可为过滤装置(如Amicon Ultra-O. 5离心过滤单元)，该过滤装置提供样品中的蛋白质生物标记可在珠粒除去时在相同的离心步骤中浓缩的利益。由于将除去的白蛋白和IgG处于很高的浓度且需要接触较大体积的珠粒来达到完全除去，故在珠粒孵育之前血清样品通常地需要10倍的稀释时，这对于亲和去除就尤其重要。一旦从稀释的样品中除去大量蛋白质，则剩余的相关目标通常地需要浓缩。因此，珠粒除去/分离的步骤和样品浓缩的步骤的联接减少了工艺流程中所需要的处理。实例2:亲和纯化本文阐明的是亲和珠粒如何用来纯化相关分析物的通常实例。在此情况下，珠粒用于有选择地结合目标，清洗掉污染物，且然后通过改变缓冲剂系统来从珠粒中抽提相关的分析物。装有铜的固定金属亲和色谱(IMAC)珠粒与样品一起载入BWEC装置中，该样品包含联结至6X His亲和纯化标记上的融合蛋白质。已知的是就是6X His标记结合到装有铜的IMAC珠粒(也称为his标记珠粒)上。一旦完成结合，则装置进行离心分离来除去保持在溶液中的污染物，同时珠粒由装置中的玻璃料保持。珠粒可用附加的载入缓冲剂清洗来获得较清洁的纯化。然而，在没有过滤装置(例如，没有Amicon Ultra-0. 5ml装置)的情况下完成最初的分离和清洗，且将未结合的溶液和洗出物作为废物收集在离心管的底部中。一旦清洗完成，则过滤装置(例如，Amicon Ultra-O. 5装置)附接到BWEC装置的出口上，且添加将目标与珠粒分开的抽提缓冲剂。然后，在不需要附加转移步骤的情况下，在单次转动中在过滤装置中收集和浓缩纯化的目标。实例3 :缓冲剂交换实例I和实例2仅利用了 BWEC装置的珠粒处理功能。现在描述的是缓冲剂交换能力。超过滤装置已经用于缓冲剂交换很久了。这通过简单地浓缩样品(例如，从500UL下降10倍至50UL)来完成，且然后用新的缓冲剂稀释回原始体积。在单个步骤中，这将引起大约10倍或90%的缓冲剂交换。这在最佳大概99. 9%的缓冲剂交换的情况下通常是不足的，大概99. 9%的缓冲剂交换将需要用通常的超过滤装置(如Amicon Ultra-O. 5装置)进行三次单独的转动。此外，如果人们在单次转动中用完全的体积(在该实例中为1.5ml)来简单地稀释样品，则这将不如分别在0. 5ml (99. 9% )下的三次转动那样有效(96. 7% )0尽管96. 7%可能看起来接近99.9%，但实际上样品(其交换至96. 7%)中存在33倍多的剩余缓冲剂。成功的单次转动的关键在于计量混合而非单次较大的稀释的情况下缓慢地进入样品中的新缓冲剂。首先，将包含叠氮化物或一些其它非期望的缓冲剂或盐的蛋白质/DNA样品加入完全组装好的装置(BWEC加上过滤装置，例如，Amicon Ultra-O. 5)中。然后，其进行离心作用且浓缩至50yL。接下来，将1.5ml的新缓冲剂添加到装置中，且其又进行离心作用。该装置缓慢地计量进入样品中的新缓冲剂，且冲走不期望的老缓冲剂，从而将浓缩样品保留在新缓冲剂中。实例4 :亲和纯化与缓冲剂交换的组合
在亲和纯化或去除的样品除浓缩外还需要缓冲剂交换的情况下，这可通过将纯化步骤与缓冲剂交换步骤简单地组合来实现。IMAC珠粒与样品一起载入BWEC装置中，该样品包含联结至6X His的融合蛋白质。一旦结合完成，则装置进行离心作用来除去保持在溶液中的污染物，同时珠粒通过装置中的玻璃料保持。珠粒可用附加的载入缓冲剂清洗来获得较清洁的纯化。一旦清洗完成，则过滤装置(例如，Amicon Ultra-O. 5装置)附接到BWEC装置的出口上，且添加将目标与珠粒分开的抽提缓冲剂。然后，在不需要附加转移步骤的情况下，在单次转动中在过滤装置中收集和浓缩纯化的目标。为了除去通常在抽提缓冲剂中使用的咪唑，人们可将I. 5ml的PBS添加至装置中且又转动。PBS将不会对珠粒有影响，且反之亦然。PBS将缓慢地计量进入先前抽提的样品中，冲出咪唑，且用PBS替换咪唑。实例5 :滞留体积用结合-清洗-抽提-浓缩(BWEC)装置和隔膜盖来评估滞留体积。该装置用I. 5mlBSA (lmg/ml的PBS)在4000xg下预清洗2分钟，且然后，在与0. 5 y m过滤器装置(可从EMDMillipore 公司获得的 AMICON ULTRA 0. 5ml IOK)组装之后，0. 5ml 的 BSA (lmg/ml 的 PBS)添加至各装置中，随后在4000xg下进行离心作用15分钟。通过促动隔膜之前和之后的装置的重量差异来计算滞留体积。图26中示出了结果，且该结果证实隔膜的促动相比于没有隔膜，将导致多于I. 5 y L的样品的回收。实例6在缓冲剂交换时评估结合-清洗-抽提(BWE)装置。50ii L的pH7. 5的IOmM Tris,IM NaCl分送至过滤器装置(可从EMD Millipore公司获得的AMICON ULTRA 0.5ml 10K)，且集合到(assemble into)交换管中，且在将I. 5ml的pH7. 5的IOmM Tris添加至交换管中之后，在4000xg下离心作用15分钟。通过在IOOOxg下反向转动2分钟来收集滞留物，且用IOmM Tris将最终体积调整至IOOii L。在添加4. 9mlMilli_Q水之后，测量传导率。对于3次转动控制，通过用0. 5ml的3次连续清洗来执行缓冲剂的交换。图27示出了虽然仅单次转动的结合-清洗-抽提方法，其相当于执行了 3次转动的方法。
权利要求
1.一种样品预处理装置，包括储槽/交换部件，所述储槽/交换部件具有样品储槽、从所述样品储槽沿轴向延伸的柱和与所述样品储槽间隔开且与所述样品储槽流体连通的出口 ；以及附接到所述储槽/交换部件上的过滤装置，所述过滤装置包括滤液室、密封地定位在所述样品储槽与所述滤液室之间的一个或多个间隔开的膜、限定所述膜下方死体积的滞留物室，其中所述储槽/交换部件的所述出口定位在所述死体积中。
2.根据权利要求I所述的样品预处理装置，其特征在于，所述样品预处理装置还包括组件支座，所述组件支座包括构造成用以收纳所述样品储槽的保持套筒；以及孔口，所述孔口通向沿轴向延伸的柱，所述沿轴向延伸的柱具有定形成用于所述过滤装置的开孔。
3.根据权利要求I所述的样品预处理装置，其特征在于，所述出口包括在从所述柱沿轴向延伸的茎部上的孔口。
4.根据权利要求3所述的样品预处理装置，其特征在于，所述茎部在所述死体积内可沿轴向延伸和可沿轴向收缩。
5.根据权利要求4所述的样品预处理装置，其特征在于，所述茎部通过所述样品储槽在一端处固定且包括弹性体一体模制部分，所述弹性体一体模制部分在所述死体积内可沿轴向延伸和可沿轴向收缩。
6.根据权利要求4所述的样品预处理装置，其特征在于，所述茎部包括一个或多个回旋部分，所述回旋部分允许所述茎部在所述死体积内可沿轴向延伸和可沿轴向收缩。
7.根据权利要求I所述的样品预处理装置，其特征在于，过滤装置包括两个间隔开的膜，且具有所述间隔开的膜之间的体积，并且其中所述柱包括定形为用以占据所述体积的室，使得所述室与各所述膜偏离移。
8.根据权利要求5所述的样品预处理装置，其特征在于，所述柱的所述室朝所述出口沿径向向内成锥形。
9.根据权利要求I所述的样品预处理装置，其特征在于，所述样品预处理装置包括隔膜盖，所述隔膜盖包括定位在所述储槽/交换部件中的偏压部件。
10.根据权利要求I所述的样品预处理装置，其特征在于，所述柱包括层析介质。
11.根据权利要求11所述的样品预处理装置，其特征在于，所述柱包括玻璃料。
12.根据权利要求11所述的样品预处理装置，其特征在于，所述玻璃料包括憎水性材料。
13.一种样品预处理的方法，包括提供样品预处理装置，所述样品预处理装置包括储槽/交换部件，所述储槽/交换部件具有样品储槽、从所述样品储槽沿轴向延伸的柱，所述柱包含介质，以及与所述样品储槽间隔开且与所述样品储槽流体连通的出口 ；以及附接到所述储槽/交换部件上的过滤装置，所述过滤装置包括滤液室、密封地定位在所述样品储槽与所述滤液室之间的一个或多个间隔开的膜、限定所述膜下方的死体积的滞留物室；使目标有选择地结合至所述介质、清洗结合到所述介质上的所述样品来除去污染物，以及通过在单个步骤中施加离心力来将所述目标从所述介质抽提到所述过滤装置中。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括提供处于所述储槽/交换部件中的偏压部件，以及通过沿轴向移动所述偏压部件来减少所述过滤装置中的所述样品的任何滞留体积。
全文摘要
本发明涉及一体化样品预处理装置及方法。该样品预处理装置允许在没有在若干装置之间转移样品的情况下执行完整的结合、清洗、抽提、缓冲剂交换和浓缩过程。该装置包括储槽，用于保持层析介质的柱、用于保持过滤装置的支座区以及出口。过滤装置插入离心装置的支座区中，且该组件可放置在可选的支座中。具有或没有可选的支座的组件可放置在用于离心作用的常规离心管中。可在没有任何移液管转移和相关样品损失的情况下，用该装置执行整个结合、清洗、抽提、缓冲剂交换和浓缩步骤。该样品预处理装置还可用于结合和清洗步骤，在此情况下，不需要过滤装置，且该样品预处理装置还可用于缓冲剂交换和浓缩步骤，在此情况下，不需要介质。
文档编号G01N1/28GK102967492SQ201210244790
公开日2013年3月13日 申请日期2012年7月12日 优先权日2011年7月13日
发明者C·A·斯科特, T·K·纳德勒, K·格林尼津, L·邦霍姆, S·D·古捷雷斯, M·马布基, D·布里格斯, P·克拉克, R·T·斯卡杜托 申请人:Emd密理博公司