专利名称：色谱试剂盒及色谱方法
技术领域：
本发明涉及进行用于提高检测灵敏度的信号放大操作的色谱试剂盒及色谱方法。
背景技术：
免疫测定方法中的免疫色谱法由于操作简便、在短时间内即可进行测定，因而通常被广泛利用。作为免疫色谱法中使用的免疫反应，广泛使用竞争反应或夹心型反应。其中，在免疫色谱法中夹心型反应为主流，在其典型例中，为了对试样中的由抗原构成的待测物质进行检测，进行以下的操作。首先，通过将利用针对作为待测物质的抗原的抗体进行了致敏的微粒作为固相微粒固定化在色谱载体上、或者将该抗体本身直接固定在色谱载体上，由此制备具有反应部位的色谱载体。另一方面，使能够与待测物质特异性结合的抗体致敏标记微粒，从而制备致敏标记微粒。使该致敏标记微粒与试样一起在色谱载体上色谱地移动。通过以上的操作，在形成于色谱载体的反应部位上，经固定化的抗体变为固定化试齐U，致敏标记微粒介由作为待测物质的抗原特异地结合在其上。结果变成致敏标记微粒被反应部位捕获，通过目视判定由此产生的信号的有无或程度，可以测定试样中待测物质的存在的有无或其量。免疫色谱法中，为了避免由于敏感度低而无法检测到抗原(假阴性)的问题，有时进行将检测信号放大的方法。作为信号放大的方法，有时使用碱性磷酸酶、过氧化物酶等酶作为标记，也有时通过使用含有银的化合物和用于银离子的还原剂对选自金属胶体标记及金属硫化物标记的标记进行敏化(银放大)来进行检测。使用了上述放大的免疫色谱记载于专利文献3及非专利文献I等中,特别是专利文献2及专利文献3中记载了使用2液的放大液来进行放大。但是，专利文献2及专利文献3中并未记载在使用2液的放大液进行放大时用于判断开始添加第2液的时机的方法。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2002-202307号公报专利文献2 :日本特开2010-71827号公报专利文献3 :日本特开2011-99724号公报非专利文献非专利文献1:Journal of Chromatography, 878 (2010) 271-27
发明内容
发明要解决的课题如上所述，在色谱法中，有时使用催化放大的溶液和进行放大的溶液这2液来进行放大。此时，色谱载体上的欲放大的部位必须被第I液充满，但随着支撑体的长度或流速及外部环境的温度等不同，第I液(还原剂等)的流动速度会发生变化。因此，当以时间指定第2液的添加时期时，则存在下述问题在被第I液充满之前添加第2液会发生放大故障，或者为了防止放大故障的发生而需要过分晚地设定第2液的添加时期。另外，当在屋外进行测定或者在短期间内测定大量检体等情况下，还可以预想到会有无法准备所需数量的钟表的状况。S卩，本发明要解决的课题在于提供可容易地确认色谱载体上的欲放大部位被第I液充满、可以防止发生由于在被第I液充满之前添加第2液所导致的放大故障的色谱试剂盒及色谱方法。用于解决课题的方法本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现在使用催化放大的溶液和进行放大的溶液这2液进行放大的色谱试剂盒及色谱方法中，通过设置用于在视觉上显示添加进行放大的溶液的时机的手段，成功地防止了放大故障的发生。本发明基于这些发现而完成。S卩，根据本发明，提供一种色谱试剂盒，其相对于含有待测物质的待测试样的展开方向从上游方向至下游方向依次具有下述区域(I)具有用针对待测物质的第一结合物质修饰过的标记物质的标记物质保持区域；和(2)具有针对·待测物质的第二结合物质或者针对上述第一结合物质的结合物质的标记物质捕获区域，且所述色谱试剂盒进一步具有(3 )具有显色试剂的区域，该显色试剂用于对在检测上述标记物质时为了放大标记物质的信号而使用的2种放大试剂中的第I放大试剂进行检测。优选具有显色试剂的区域位于上述标记物质捕获区域的下游。优选上述显色试剂是与离子发生反应而显色的化合物。优选上述显色试剂是与Fe2+离子发生反应而显色的化合物。优选上述显色试剂是具有菲绕啉骨架的化合物。优选上述显色试剂是与H+离子发生反应而显色的化合物。优选上述标记物质为金属胶体。优选上述金属胶体为金胶体。优选本发明的色谱试剂盒内置有为了放大标记物质的信号而使用的2种放大试剂。优选第I放大试剂是用于银离子的还原剂、第2放大试剂是含有银的化合物。优选第I放大试剂是含有2价铁离子的试剂。优选色谱试剂盒至少含有具有标记物质保持区域的标记物质保持衬垫、具有标记物质捕获区域的结合物质固定化膜以及吸水衬垫，且上述显色试剂被担载于结合物质固
定化膜。优选上述显色试剂是在将含有待测试样的水溶液或含有第I放大试剂的水溶液的任一者进行展开时实质上不会在结合物质固定化膜中移动的显色试剂。进而，根据本发明，提供一种色谱方法，其包含下述工序(I)在形成了待测物质和用针对上述待测物质的第一结合物质修饰过的标记物质的复合体的状态下进行展开、在具有针对上述待测物质的第二结合物质或针对上述第一结合物质的结合物质的标记物质捕获区域上将标记物质捕获的工序；(2)使为了将被上述标记物质捕获区域捕获的标记物质的信号进行放大而使用的2种放大试剂中的第I放大试剂从标记物质捕获区域的上游方向向标记物质捕获区域的下游方向展开的工序；(3)通过检测具有显色试剂的区域上的物理或化学变化来确认标记物质捕获区域被第I放大试剂充满的工序；以及(4)在确认到标记物质捕获区域被第I放大试剂充满后使上述2种放大试剂中的第2放大试剂充满标记物质捕获区域的工序。优选第I放大试剂是用于银离子的还原剂、第2放大试剂是含有银的化合物。优选第I放大试剂是含有2价铁离子的试剂。发明效果根据本发明的色谱试剂盒及色谱方法，通过设置用于在视觉上显示添加进行放大的溶液的时机的手段，可以防止放大故障的发生。
图1表示实施例1中使用的试剂盒的实施方式。在构成本发明试剂盒外部的上部的构件上设置有作为第2放大试剂的银离子溶液的填充孔。在下部的构件上，在粘合片材上依次配置有用于输送作为第I放大试剂的还原剂溶液的衬垫、作为标记物质保持区域的金胶体保持衬垫、具有作为标记物质捕获区域的抗体固定化线的抗体固定化膜、以及作为具有显色试剂的区域的吸水衬垫。如图1所示，相对于含有待测物质的待测试样的展开方向来定义为上游、下游。图2表示实施例2及实施例3中使用的试剂盒的实施方式。在构成本发明试剂盒外部的上部的构件上设置有作为第2放大试剂的银离子溶液的填充孔及作为第I放大试剂的还原剂溶液的添加孔。在下部的构件上，在粘合片材上依次配置有用于输送作为第I放大试剂的还原剂溶液的衬垫、作为标记物质保持区域的金胶体保持衬垫、具有作为标记物质捕获区域的抗体固定化线和作为具有显色试剂的区域的显色试剂固定化线的抗体固定化膜、以及吸水衬垫。与图1同样，相对于含有待测物质的待测试样的展开方向来定义为上游、下游。
具体实施例方式本发明的色谱试剂盒及色谱方法中，可以在视觉上判断添加在以提高待测物质的检测灵敏度为目的而进行放大操作时所使用的2种放大试剂的时机。1.用于检测第I放大试剂的显色试剂本发明的色谱试剂盒具有下述区域具有用于对为了放大标记物质的信号而使用的2种放大试剂中的第I放大试剂进行检测的显色试剂的区域。本发明中，作为用于对第I放大试剂进行检测的显色试剂，例如优选使用与离子发生反应而显色的化合物。对于第I放大试剂，会在本说明书中后面叙述，但例如当第I放大试剂为含有2价铁离子(Fe2+)的试剂时，作为其显色试剂，可以使用与Fe2+离子发生反应而显色的化合物。作为与Fe2+离子发生反应而显色的化合物，可以使用通过与Fe2+离子形成络合物而能够显色的化合物。作为与Fe2+离子发生反应而显色的化合物的具体例子，可以使用具有菲绕啉骨架的化合物[例如1，10-菲绕啉、5-甲基菲绕啉、5-硝基菲绕啉、红菲绕啉(4，7- 二苯基-1，10-菲绕啉)或红菲绕啉二磺酸等]或者具有联二吡啶骨架的化合物[例如2，2'-联二吡啶等]，可以优选使用具有菲绕啉骨架的化合物。另外，当含有待测试样的水溶液与含有第I放大试剂的水溶液的PH不同时，为了检测第I放大试剂，可优选使用通过质子引起结构变化、从而色调发生变化的试剂。特别是含有第I放大试剂的水溶液为酸性(pH小于7、质子浓度高)时，作为酸性区域用的pH指示剂而公知的作为显色试齐U的与H+离子发生反应而显色的化合物(例如甲基橙、甲基红、刚果红及甲基黄等重氮系的显色试剂，以及百里香酚蓝、溴甲酚绿、溴甲酚紫及溴百里香酚蓝等磺酸内酯系的显色试齐U)等可以根据含有放大试剂的水溶液的PH来适当选择使用。上述中，可以更优选地使用1，10-菲绕啉、红菲绕啉或溴甲酚绿。在将含有待测试样的水溶液或含有第I放大试剂的水溶液进行展开时，优选显色试剂不在结合物质固定化膜上移动，因而优选显色试剂的LogP (在水和辛醇中的分配系数)为4. 0以上、更优选为5. 0以上。作为LogP，可以使用实测值，但作为简便判断的方法，也可以使用由化学结构等获得的计算值。作为计算LogP的方法,优选在CambridgeSoft公司的ChemDrawPro version 12中使用的计算方法。将代表性的显色试剂的响应性及LogP (根据ChemDrawPro version 12)不于以下的表I中。表I
权利要求
1.一种色谱试剂盒，其相对于含有待测物质的待测试样的展开方向从上游方向至下游方向依次具有下述区域 (1)具有用针对待测物质的第一结合物质修饰过的标记物质的标记物质保持区域；和 (2)具有针对所述待测物质的第二结合物质或针对所述第一结合物质的结合物质的标记物质捕获区域， 所述色谱试剂盒进一步具有(3)具有显色试剂的区域，所述显色试剂用于对在检测所述标记物质时为了放大标记物质的信号而使用的2种放大试剂中的第I放大试剂进行检测。
2.根据权利要求1所述的色谱试剂盒，其中，所述具有显色试剂的区域位于所述标记物质捕获区域的下游。
3.根据权利要求1或2所述的色谱试剂盒，其中，所述显色试剂是与离子发生反应而显色的化合物。
4.根据权利要求1或2所述的色谱试剂盒，其中，所述显色试剂是与Fe2+离子发生反应而显色的化合物。
5.根据权利要求1或2所述的色谱试剂盒，其中，所述显色试剂是具有菲绕啉骨架的化合物。
6.根据权利要求1或2所述的色谱试剂盒，其中，所述显色试剂是与H+离子发生反应而显色的化合物。
7.根据权利要求1或2所述的色谱试剂盒，其中，所述标记物质是金属胶体。
8.根据权利要求7所述的色谱试剂盒，其中，所述金属胶体是金胶体。
9.根据权利要求1或2所述的色谱试剂盒，其内置有为了放大标记物质的信号而使用的2种放大试剂。
10.根据权利要求9所述的色谱试剂盒，其中，所述第I放大试剂是用于银离子的还原齐 ，所述第2放大试剂是含银的化合物。
11.根据权利要求9或10所述的色谱试剂盒，其中，所述第I放大试剂是含有2价铁离子的试剂。
12.根据权利要求1或2所述的色谱试剂盒，其至少含有具有标记物质保持区域的标记物质保持衬垫、具有标记物质捕获区域的结合物质固定化膜以及吸水衬垫，所述显色试剂被担载于结合物质固定化膜。
13.根据权利要求12所述的色谱试剂盒，其中，所述显色试剂是在将含有待测试样的水溶液或含有所述第I放大试剂的水溶液的任一者进行展开时不会在结合物质固定化膜中移动的显色试剂。
14.一种色谱方法，其包含下述工序 (1)在形成了待测物质和用针对待测物质的第一结合物质修饰过的标记物质的复合体的状态下进行展开、在具有针对所述待测物质的第二结合物质或针对所述第一结合物质的结合物质的标记物质捕获区域上将所述标记物质捕获的工序； (2)使为了将被所述标记物质捕获区域捕获的标记物质的信号进行放大而使用的2种放大试剂中的第I放大试剂从标记物质捕获区域的上游方向向标记物质捕获区域的下游方向展开的工序；(3)通过检测具有显色试剂的区域上的物理或化学变化来确认所述标记物质捕获区域被第I放大试剂充满的工序；以及 (4)在确认到所述标记物质捕获区域被第I放大试剂充满后使所述2种放大试剂中的第2放大试剂充满标记物质捕获区域的工序。
15.根据权利要求14所述的色谱方法，其中，第I放大试剂是用于银离子的还原剂，第2放大试剂是含银的化合物。
16.根据权利要求14或15所述的色谱方法，其中，第I放大试剂是含有2价铁离子的试剂。
全文摘要
本发明提供能够容易地确认色谱上欲放大的部位被第1液充满、能够防止发生在被第1液充满之前添加第2液所导致的放大故障的色谱试剂盒及色谱方法。本发明的色谱试剂盒相对于含有待测物质的待测试样的展开方向从上游方向至下游方向依次具有下述区域具有用针对待测物质的第一结合物质修饰过的标记物质的标记物质保持区域和具有针对所述待测物质的第二结合物质或针对所述第一结合物质的结合物质的标记物质捕获区域，所述色谱试剂盒进一步具有具有显色试剂的区域，所述显色试剂用于对在检测所述标记物质时为了放大标记物质的信号而使用的2种放大试剂中的第1放大试剂进行检测。
文档编号G01N33/543GK103033610SQ201210368059
公开日2013年4月10日 申请日期2012年9月28日 优先权日2011年9月29日
发明者和田淳彦, 森干永 申请人:富士胶片株式会社