专利名称：一种血液同型半胱氨酸的检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种血液同型半胱氨酸的检测方法及试剂盒。
背景技术：
近十多年的研究证实,血液中高浓度的同型半胱氨酸(Homocysteine, HCY)是冠状动脉疾病、脑血管及外周血管疾病的独立危险因素。HCY是由蛋氨酸去甲基生成的一种含硫氨基酸，它在体内主要通过再甲基化、转硫作用两种途径进行代谢其一，在蛋氨酸合成酶的催化作用下，以维生素B12为辅酶，以N5-甲基四氢叶酸为甲基供体，HCY被甲基化生成蛋氨酸。此过程的关键酶是以维生素B2为辅酶的亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)，该酶使N5，NlO-亚甲基四氢叶酸还原为N5-甲基四氢叶酸，其作用非常重要；其二，HCY与丝氨·酸结合，在胱硫醚-β-合成酶(CBS)催化作用下，以维生素Β6为辅酶，生成胱硫醚，后者再裂解为半胱氨酸和α -酮丁酸，参与代谢，形成转硫化途径。当上述代谢途径受阻时，HCY在细胞内蓄积，并进入血液循环，引起慢性病理损害。参与HCY代谢的酶(如MTHFR和CBS)如有遗传缺陷可导致严重的高HCY血症，而由于营养因素导致的维生素B6、B12和叶酸的缺乏同样可产生高HCY血症。除遗传、营养因素外，年龄、种族、生活习惯(如吸烟、饮酒、高蛋氨酸食物等)、药物和某些疾病因素等也可以不同程度地影响血浆HCY水平。血浆中约75%的HCY与白蛋白结合，形成结合型HCY，其余的则主要以二硫键结合的HCY-HCY、HCY-半胱氨酸化合物形式存在，游离型只有I 2%以还原型HCY存在于血浆中。通常测定的是血浆中所有形式HCY总和，即总HCY(total Homocysteine, tHCY)。一般认为，血浆tHCY正常值参考范围为5 151111101/1(高效液相色谱法)，当血楽· tHCY ^ 15 μ mol/L 时，即为高 HCY 血症(Hyperhomocysteinemia, HHcy);当血衆tHcyMOymol/L时即超出肾阈值，可出现同型半胱氨酸尿，这种情况主要见于遗传病。研究发现，男性血浆tHCY浓度介于9. O 14. 9 μ mol/L者，其患冠心病的危险性是低于9. O μ mol/L者的2倍，而高于14. 9 μ mol/L者，其危险性则增加6倍，因此，1995年建议理想的血衆tHcy浓度应低于10 μ mol/L2006年，美国高血压协会(ASH)和脑卒中协会(ASA)发布了对于缺血性脑卒中和短暂脑缺血发作患者的卒中预防指南。在该指南里，高Hcy血症被列为脑卒中的重要风险因子之一，并定义Hcy>10 μ mol/L即为高Hcy血症，建议给予患者补充维生素B6、B12和叶酸。目前Hcy检测方法有(I)同位素法通过14C标记的腺苷与tHcy缩合后，经色谱分离，液体闪烁计数放射强度来测定tHcy浓度。该法灵敏度高、特异性强，但由于操作繁琐且有放射污染，虽经改良也未能推广使用。(2)高效液相色谱法(HPLC)是目前比较成熟且可推广使用的方法，方法学包括柱前衍生-HPLC-荧光检测法，HPLC-柱后衍生-紫外检测法或荧光检测法和HPLC-电化学检测法。目前已有tHcy全自动的HPLC-荧光检测仪问世。但是操作较为复杂，不适用大样本快速分析。(3)荧光偏振免疫检测(FPLA)法，该方法灵敏度高，检测速度快，但价格昂贵，故短时期内不易普及。检测时，首先用二巯基苏糖醇将结合型HCY还原出来，然后通过特异性的S腺苷HCY合成酶催化HCY转变为S腺苷HCY，与作为示踪物的荧光素标记S腺苷HCY类似物一起与特异性单克隆抗体竞争性结合，引起示踪物偏光性改变，从而检测出HCY浓度。(4)酶免疫测定法，这种方法也需要将HCY先转化为S腺苷Hcy，然后加入辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，最后加入辣根过氧化物酶的底物，并在450nm处检测。加入蛋氨酸与半胱氨酸对检测结果均无影响，无交叉反应。这种方法的检测结果与HPLC检测结果的相关系数达O. 986。(5)循环酶法是近年发展起来、可用于自动生化分析仪的一种技术，它使tHCY检测更加快速、方便。其原理是结合的HCY (氧化形式)被还原成游离的HCY，在胱硫醚-β -合成酶的催化下和丝氨酸反应生成L-胱硫醚，后者被胱硫醚-β -裂解酶分解成HCY和丙酮酸，丙酮酸参与NADH显色反应，生成的HCY再次参与第一步反应，如此循环。该方法与HPLC法相关性良好，无需样本预处理，目前正被国内外广泛采用。但是显色反应，易受血液一些成分的干扰。本发明中应用的酶为阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)的甲硫氨酸 Y -裂解酶(Methionine gamma-lyase),同通过 基因改造，构建原核表达系统，经纯化制备而成，对HCY具有特异性，取名HCY特异性转化酶(rHCYase)，经色谱纯化技术，制备了高纯度的rHCYase，rHCYase稳定性好，活性高，可用于HCY的检测分析，反应简单，检测试剂稳定，适用于临床HCY的分析。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种血液同型半胱氨酸的检测方法及试剂盒。本发明方法的HCY检测其原理是利用HCY特异性转化酶(rHCYase)分解血中的HCY产生H2S,生产的H2S与试剂二甲基对苯胺反应生产甲基蓝，通过检测甲基蓝生成量反应血液中HCY的含量,如式(I)所示。
COOH
ICOCH
H2N-CHrHCYaseI-,
士H 十 H2Oγ=。 4* H2S + NH3
I,2CH2
CH2I
ICH^
SH“
TT,|)...........................III II
顧 +圆—、人
MICl—I式(I)一种血液中同型半胱氨酸的检测方法，包括以下步骤(I)准备工作将HCY标准品用缓冲液溶解分别配置浓度为50 μ mol/L、25 μ mol/L、10 μ mol/L、5 μ mol/L、2· 5 μ mol/L,O μ mol/L 的 HCY 溶液，临用前 15 分钟内配制；将还原剂用缓冲液溶解配制成浓度为I μ mol/L还原剂工作液^fHCY特异性转化酶用缓冲液配制成浓度为O. 4-0. 6mg/ml的HCY特异性转化酶工作液；(2)检测在96孔板中分别加入HCY标准品和样品，加入还原剂工作液还原Ih ；加入HCY特异性转化酶工作液反应5min ;加入显色液A，反应5min ;加入显色液B，反应IOmin ；(3)标准曲线制备根据标准品浓度溶液在670nm的吸光度值制备标准曲线，然后计算样品中HCY含量；或根据标准品浓度溶液在激发波长615nm，发射波长685nm的荧光强度制备标准曲线，计算样品中HCY含量。所述HCY特异性转化酶为阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)的甲硫氨酸Y-裂解酶。所述还原剂为二硫苏糖醇。所述缓冲液为250mM的磷酸盐缓冲溶液，pH为8. 3，其中含磷酸吡多醛的浓度为 IOuM, Triton X-100的浓度为O. 05wt%，三羧乙基膦(TCEP)的浓度为ImM。所述显色液A为浓度为I. 5M的H2SO4溶液，其中含二甲基对苯胺浓度为20mM。所述显色液B为20mM磷酸缓冲液，其中含铁氰化钾浓度为5mM。根据上述检测方法制备的血液同型半胱氨酸的检测试剂盒，此试剂盒包括盒体以及在盒体内的96孔板、HCY标准品、HCY特异性转化酶、还原剂、缓冲液、显色液A和显色液B0上述的检测试剂盒中，所述HCY特异性转化酶为阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)的甲硫氨酸Y _裂解酶，所述还原剂为二硫苏糖醇，所述缓冲液为250mM的磷酸盐缓冲溶液，pH为8. 3，其中含磷酸吡多醛的浓度为10uM，Triton X-100的浓度为0. 05wt%,三羧乙基膦(TCEP)的浓度为1禮，所述显色液A为浓度为I. 5M的H2SO4溶液，其中含二甲基对苯胺浓度为20mM，所述显色液B为20mM磷酸缓冲液，其中含铁氰化钾浓度为5mM。本发明的有益效果为本发明的方法测试血液中HCY的含量，操作简单，试剂稳定性好，重复性高，方法灵敏，其试剂盒适用于实验室和临床快速检测HCY。
图I为HCY检测的显色图。图2为HCY测定的吸收光谱和发射光谱图。图3为测定的荧光强度-HCY浓度的标准曲线。图4为rHCYase的纯化电泳鉴定图；1为未经纯化的粗酶，2、4为经DEAE离子交换层析纯化后的蛋白，3、5为phenyl疏水层析纯化后的蛋白。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。实施例IHCY在重组的rHCYase催化下生成H2S, H2S与二甲基对苯胺在F3+氧化下反应生成蓝色甲基蓝，蓝色的深浅与HCY的浓度成正比，颜色越深，HCY浓度越高，由此原理制备试剂盒，如图I所示，为HCY检测的显色图，在孔板中加入浓度为O、10、15、20、25 μ M HCY和半胱氨酸，按显色检测方法进行检测，上排半胱氨酸无显色，下排显色，随着HCY浓度的升高，显色越深，吸光度与HCY浓度成正比。荧光检测法试剂盒组成一块96孔黑板，HCY标准品27. 03 μ g，HCY特异性转化酶3mg，稀释液50ml,还原剂O. 771 μ g,显色液AlOml,显色液BlOml。操作步骤1)HCY标准品用稀释液稀释至1ml，其浓度为200 μ mol/L，做系列倍比稀释后，分别稀释成 100 μ mol/L, 50 μ mol/L, 25 μ mol/L, 10 μ mol/L, 5 μ mol/L, 2. 5 μ mol/L, 0 μ mol/L，稀释液直接作为标准浓度O μ mol/L,临用前15分钟内配制。将还原剂用5ml稀释液溶解配制成还原剂工作液。将HCY特异性转化酶用5ml稀释液配制成将HCY特异性转化酶工作 液。2)在96孔黑板分别加入HCY标准品和样品100 μ 1，加入还原剂工作液10 μ I还原Ih ；3)加入HCY特异性转化酶工作液20 μ I反应5min ；4)加入显色液A50 μ I,反应5min ；5)加入显色液B30 μ I,反应IOmin ；6)在激发波长为615nm，发射波长为685nm下测定荧光强度，根据荧光强度与标准品浓度制备标准曲线，如图3所示，计算样品中HCY含量。如图2所示，在固定发射波长685nm，对吸收波长进行扫描，发现在615、685，745nm处有吸收峰，固定激发波长615nm，对发射波长进行扫描，发现只在685nm处有最大发生峰，所以突光检测波长定为激发波长为615nm,发射波长为685nm。实施例2比色检测法试剂盒组成一块96孔透明酶标板，HCY标准品27. 03 μ g，HCY特异性转化酶2mg,稀释液50ml,还原剂0. 771 μ g,显色液AlOml,显色液BlOml。操作步骤I)将HCY标准品用稀释液配制成Iml的溶液，其浓度为200 μ mol/L,做系列倍比稀释后，分别稀释成 100 μ mol/L, 50 μ mol/L, 25 μ mol/L, 10 μ mol/L, 5 μ mol/L, 2. 5 μ mol/L，0 μ mol//L，稀释液直接作为标准浓度0 μ mol//L,临用前15分钟内配制。将还原剂用5ml稀释液溶解。2)在96孔透明酶标板分别加入HCY标准品和样品100 μ 1，然后分别加入还原剂10 μ I 还原 Ih ；3)将HCY特异性转化酶用5ml稀释液溶解，然后加入HCY特异性转化酶溶液20 μ I到上述反应液中反应5min ；4)加入显色液A50 μ I,反应5min ；5)加入显色液B30 μ I,反应IOmin ；6)根据标准品浓度溶液在670nm的吸光度值制备标准曲线，然后计算样品中HCY含量。实施例3用本发明的检测方法测定血清样品的HCY，并用其结果与高效液相色谱法(HPLC)测定结果进行比较。
选用HPLC方法测定过的血清样品10份，用本发明的方法进行测定，测定结果与HPLC方法测定结果进行比较，结果如表I所示，计算符合率为O. 9998。表明本方法结果可
O表I测定结果比较
权利要求
1.一种血液同型半胱氨酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)准备工作将HCY标准品用缓冲液溶解分别配置浓度为50μπιΟ1/1、25μπιΟ1/1、10 μ mol/L,5 μ mol/L,2. 5 μ mol/L,0 μ mol/L的HCY溶液，临用前15分钟内配制；将还原剂用缓冲液溶解配制成浓度为I μ mol/L还原剂工作液^fHCY特异性转化酶用缓冲液配制成浓度为O. 4-0. 6mg/ml的HCY特异性转化酶工作液； (2)检测在96孔板中分别加入HCY标准品和样品，加入还原剂工作液还原Ih;力口入HCY特异性转化酶工作液反应5min ;加入显色液A，反应5min ;加入显色液B，反应IOmin ； (3)标准曲线制备根据标准品浓度溶液在670nm的吸光度值制备标准曲线，然后计算样品中HCY含量；或根据标准品浓度溶液在激发波长615nm，发射波长685nm的荧光强度制备标准曲线，计算样品中HCY含量。
2.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述HCY特异性转化酶为阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)的甲硫氨酸 Y-裂解酶。
3.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述还原剂为二硫苏糖醇。
4.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲液为250mM的磷酸盐缓冲溶液，pH为8. 3，其中含磷酸吡多醛的浓度为10uM，Triton X-IOO的浓度为0. 05wt%，三羧乙基膦的浓度为ImM。
5.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述显色液A为浓度为1.5M的H2SO4溶液，其中含二甲基对苯胺浓度为20mM。
6.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述显色液B为20mM磷酸缓冲液，其中含铁氰化钾浓度为5mM。
7.根据权利要求I所述检测方法制备的血液同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，此试剂盒包括盒体以及在盒体内的96孔板、HCY标准品、HCY特异性转化酶、还原剂、缓冲液、显色液A和显色液B。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述HCY特异性转化酶为阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)的甲硫氨酸Y -裂解酶,所述还原剂为二硫苏糖醇,所述缓冲液为250mM的磷酸盐缓冲溶液，pH为8. 3，其中含磷酸吡多醛的浓度为10uM，Triton X-100的浓度为0.05wt%，三羧乙基膦的浓度为ImM，所述显色液A为浓度为I. 5 M的％304溶液，其中含二甲基对苯胺浓度为20mM，所述显色液B为20mM磷酸缓冲液，其中含铁氰化钾浓度为 5mM。
全文摘要
本发明公开了生物检测技术领域的一种血液同型半胱氨酸的检测方法及试剂盒。此试剂盒包括盒体以及在盒体内的96孔板、HCY标准品、HCY特异性转化酶、还原剂、缓冲液、显色液A和显色液B，此试剂盒利用rHCYase分解血中的HCY产生H2S，生产的H2S与二甲基对苯胺反应生产甲基蓝，通过甲基蓝生成量反应血液中HCY的含量。本试剂盒操作简单，试剂稳定性好，重复性高，方法灵敏，适用于实验室和临床快速检测HCY。
文档编号G01N21/64GK102901720SQ201210369578
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者弓景波, 钱令嘉 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所