制备个体全蛋白质组芯片的方法及其应用的制作方法

专利名称：制备个体全蛋白质组芯片的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物芯片技术领域,具体涉及一种个体全蛋白质组芯片(IndividualProteomic Microarray, IPM)的制备方法及其应用。
背景技术：
生物芯片具有微型化、高通量、自动化等特点，可分为基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片、组织芯片等。随着基因组计划完成，DNA与RNA的检测技术已逐步发展成熟；目前在生物芯片领域，以基因芯片为代表的各种技术平台，已经在细胞生命和代谢过程研究，疾病机理、诊断和预测，新基因的发现，新药开发，司法鉴定，环境污染监测和食品卫生监督等诸多领域获得了广泛应用。生物个体是复杂和谐的物质存在方式，而蛋白质则是生物组成结构和功能的最基本单位；因此系统性研究生物体内的全部蛋白质表达、相互作用及生物功能是当代生命科学研究的迫切需要。但是，当今国际上蛋白质芯片研究和应用总体上却大大落后于其对应的基因芯片，主要发展瓶颈是由于蛋白质样品的来源要比基因芯片困难许多。分析该局面的产生主要来自以下三方面原因首先是蛋白质组的数量要远远大于其对应的基因组数量。由于蛋白质具有复杂的剪切特性和个体化差异调节机制，而且机体不同细胞所表达的蛋白会随着所处器官、组织的不同，甚至环境状态的不同而改变甚大，研究显示人体蛋白质的数目理论上在20万以上(对应的基因组数量仅仅为3万左右)。原因之二是生物体很多蛋白质都有翻译后修饰现象以及结构不稳定以及易降解的性质，经过体外表达纯化方法得到的蛋白不但有相当一部分是缺乏正常生物功能的，而且还比较容易降解。原因之三为从原料合成层面分析，尽管理论可行，但实践中蛋白质很难在固相芯片表面合成，而基因芯片的原位合成技术在目前则已经发展得相当完善。由于上述三个主要原因，客观上造成了蛋白样品来源受限，并直接导致国际国内的蛋白质组芯片研究和应用均发展缓慢。在传统研究中，科学家往往通过克隆表达纯化的方法获得目标蛋白，但这种常规的逐一克隆表达纯化方法不仅费时费力，而且理论上也不可能完全将细胞内所有的蛋白质都表达出来。虽然现在已有通过表达纯化获得蛋白制备的蛋白质组芯片，如Life Technologies等公司推出的商业化蛋白质组芯片已经含有约9，400个蛋白质；而美国霍普金斯大学的药物和分子科学系也研发出了含有17，000个蛋白质的生物芯片，但是可以看出其芯片上所含有的蛋白质数远没有达到人体所含有的理论蛋白数。目前，哈佛大学的Josh LaBaer等利用体外无细胞表达系统制成了含有14，000个蛋白质的蛋白质组芯片，但这种基于高密度点样的无细胞表达技术极易造成交叉污染从而可能导致产生信号偏差的错误。显然，通过以上各种方法都不能制备得到真正科学意义上的全蛋白质组芯片。
在本发明中，我们从细胞或组织中直接分离获得大量天然表达的活性蛋白质，并以此为基础提供生物芯片点样用原料；其优点是整合蛋白质分离、测试和序列分析技术于一体，从而有效解决现有蛋白质芯片制备所遇最大瓶颈，即蛋白样品来源问题。采用本发明所述技术，可以快速、高效制备针对于不同物种，包括动植物、微生物各个生物层次及生理层次，包括单一个体、器官、组织、细胞、体液及各种复杂生物材料所对应的特殊蛋白质组芯片。本发明还涉及以上所述的个体全蛋白组芯片在蛋白质组研究、抗体特异性检测、蛋白翻译后修饰检测、蛋白与蛋白、蛋白与核酸及小分子相互作用、自身抗原抗体的筛选与检测、药物靶点预测、酶底物谱筛选鉴定、酶活位点鉴定、疾病与生命活动监测、“个性化”医疗等方面的应用。实践已经证明，该方法的确是一种高效快速制备蛋白质组芯片的新策略。

发明内容
本发明制备个体全蛋白质组芯片的方法包括以下步骤
1.样品制备，提取样品的全蛋白质组，将获取的全蛋白质组样品进行高丰度蛋白的去除与低丰度蛋白的富集，获得蛋白质样品混合液；
2.使用蛋白质高通量分离技术，使蛋白质样品混合液分别按照一定的物理、化学和/或生物性质分离成多个蛋白质组份；如果需要，在蛋白质通过高通量分离技术后，回收蛋白质样品；
3.将分离的多个蛋白质组份根据其来源进行排序，制备出具有可寻址性质的蛋白质组芯片；
4.芯片表面的生物反应/实验；
5.根据芯片生物反应实验结果对特定蛋白质进行结构解析和功能测定。在一种实施方式中，个体样品可以是器官、组织、体液、或细胞。在样品制备时，可以根据本领域常规技术，对器官、组织、体液、细胞样品进行操作。例如，器官与组织样品进行液氮研磨与裂解液裂解后离心提取上清；细胞直接使用裂解液裂解后离心提取上清；体液如血清与组织液等则直接可用。将获取的全蛋白质组样品进行高丰度蛋白的去除与低丰度蛋白的富集，具体操作时根据实验目的不同可分别选择使用GE公司的去血清/血浆白蛋白/IgG等高丰度蛋白亲和柱、Agilent的多重亲和去除离心小柱、BIO-RAD的六肽柱等等。在高通量蛋白质分离技术中，全蛋白质组分离的技术主要有双向凝胶电泳技术、双向荧光差异凝胶电泳、高效液相色谱技术、二维液相色谱技术或毛细管电泳技术。使用双向凝胶电泳分离全蛋白质组时，首先将提取的全蛋白质组样品溶于上样缓冲液经过水化、除盐、升压、聚焦完成第一向等电聚焦凝胶电泳后取出IPG胶条放入平衡缓冲液中平衡，然后将IPG胶条放入第二向电泳SDS-PAGE的凝胶上层，使用琼脂糖封胶后即进行第二向SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后使用考马斯亮蓝染液进行染色。使用双向荧光差异凝胶电泳分离全蛋白质组时，首先将获得的全蛋白组样品进行荧光标记，例如Cy3或Cy5标记，然后溶于上样缓冲液，接着进行第一向等电聚焦凝胶电泳，经过水化、除盐、升压、聚焦完成第一向电泳后，取出IPG胶条放入平衡缓冲液中平衡后将IPG胶条放入第二向电泳SDS-PAGE的凝胶上层，使用琼脂糖封胶后进行第二向SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后无需染色直接放入扫描仪中进行结果观察。
使用高效液相色谱分离全蛋白质组时，一般可以选用C18、CS等反相色谱柱进行分离，其中具体分离条件可以是本领域中常规的蛋白质分离系统，例如流动相A可以为95%水5 %乙腈(含有O.1 %三氟乙酸)，流动相B为5 %水95 %乙腈(含有O. 085 %三氟乙酸)，洗脱梯度为(Γ60 %流动相B, 60 min,流速为2 mL/min,使用紫外进行蛋白分离的检测。使用二维液相色谱分离全蛋白质组时，首先全蛋白质组样品脱盐后溶于第一维液相色谱(HPCF)的上样缓冲液中上样并进行色谱聚焦分离，使用pH梯度进行洗脱，常规每隔
O.05、. 5 pH收集一份样品，根据实验要求不同，间隔pH可以具体调整，例如每隔O. 3 pH收集一份样品，PH的梯度为2 10、4. (Γ8. 5,3. 5^7. 5、或4. (Γ6. O ;收集的样品直接进行第二维的高效液相色谱的分离，例如使用C18柱进行分离，其中流动相A为O.1 %三氟乙酸的水溶液，流动相B为含有O. 08 %三氟乙酸的乙腈溶液，洗脱梯度为(Γ100 %流动相B，时间为I 60分钟、5 55分钟、10 50分钟、15 45分钟、或20 40分钟，最后变为5 %的流动相B保持I 30分钟，5 20分钟，或10 15分钟，流速均为O. Γ10 mL/min，使用紫外进行蛋白分离的检测。此外，毛细管电泳是另一种可用于蛋白质分析的新型技术，其兼有电泳和色谱技术的双重优点——高效、高速、高灵敏度、高分辨率和高自动化。其中毛细管凝胶电泳具有抗对流、减少溶质扩散、降低电渗、避免管壁吸附及主动参入分离过程等优点而被用于蛋白质分离鉴定。当使用其进行全蛋白质组分离时，例如使用O. 5 psi进样25 S, 25 kV恒压分离10 min 30 min即可完成分离。如果需要，可接下来进行分离样品的回收。使用双向凝胶电泳与双向荧光差异凝胶电泳分离所得的凝胶按照物理位置标记后分割回收，根据实验目的不同，具体分割的样品数量亦不同，例如100*100=10,000 (样品块)或500*500=250，000 (样品块)等。换句话说，通过这一方法，可以使原来的一份蛋白质样品混合液分别按照一定的物理、化学和生物性质分成多个组份，即由I变成 了乂*10"(11=3飞，Χ=Γ9)0然后使用浸泡回收法进行回收、复性和富集将胶块放在离心管中，磨碎浸泡，透析复性后超滤浓缩保存。根据设定模式回收样品；一个回收样品里面可以含有不止一个蛋白或者仅仅是空白。使用高效液相色谱和二维液相色谱分离所得的样品则按照出峰时间进行分割回收，根据实验目的不同，具体回收的样品数量亦不同，例如I min或0.5 min回收一份样品等。如使用毛细管电泳分离的样品，则可以在其检测器后添加一个自动化的收样设备按照电泳时间如10 s、15 s等进行回收。使用经上述高通量分离技术获得的生物样品作为点样基质，然后根据上述生物样品的来源例如物理位置等进行排序，从而制备出具有可寻址性质的蛋白质组芯片。在机械点样制备芯片时，首先制备样品点样液，使用浸泡回收法从双向凝胶电泳和双向荧光差异凝胶电泳回收的分离样品可直接取出10 μ L与点样液进行等比例混合制成样品点样液，剩余样品-80 °C留存；而从高效液相色谱以及二维液相色谱中洗脱回收的分离样品，则需先将其等分为三份并同时进行干燥处理，之后取出一份加入10 UL PBS将样品溶解后与点样液进行等比例混合制成样品点样液，剩余两份-80 °C留存；另外使用毛细管电泳分离回收的样品需先进行透析，再取出10 μ L与点样液进行等比例混合制成样品点样液，剩余样品-80 °C留存。样品点样液制备完成后便可进行点样，点样方式可选用接触式点样和喷墨式点样。接触式点样条件为点样湿度为2(Γ100 %，点间距为10(Γ1500μ m,预点样个数为1(Γ 50个,使用纯水洗针,条件为抽干10 S后进行如下8个循环清洗10 S，超声10 S，清洗10 S，抽干10 S。喷墨式点样条件为点样湿度为20 100 %，点间距为800 1500 μπι，预喷点数为10 100个，预喷时间为10 250 μ S，喷样时间为10 400 μ S，选择工作液模式进行喷样，选用纯水洗针，先排空4 S，再进行如下8个循环清洗4 S，排空4 S，最后进行抽干4 S。点样结束后即进行荧光扫描确认点样的效果，其中双向凝胶电泳分离回收所得样品由于双向凝胶电泳使用的是考马斯亮蓝染色所以具有红色荧光信号；另外双向荧光差异凝胶电泳分离回收所得的样品由于其本身已进行了荧光标记因此也具有相应的荧光信号；而高效液相色谱、二维液相色谱以及毛细管电泳分离回收所得的样品则无相应的荧光信号。接着即可进行常规的室温干燥固定制成蛋白质组芯片。该方法不仅能快速得到大量天然表达蛋白，还可以使一次蛋白分离实验如双向凝胶电泳结果转变为 (Γιοο片甚至更多具有更好均一性的蛋白质组芯片，使其可以同时利于多方面的实践应用。通过这种方法，可以制备得到在生物体生命过程中体内所产生的全部蛋白，包括所有亚型以及修饰的蛋白。在一种实施方式中，在芯片上完成各种生物相关实验，然后通过鸟枪法LC-MS质谱等进行生物分子的功能鉴定和序列结构解析等工作。具体地，当采用个体全蛋白质组芯片通过具体生物学实验发现某个或某些分离回收的蛋白点，其可能含有I或多个蛋白组分，具有预期或特殊生物学功能时，为确定此蛋白的序列和种类则需对其进行进一步的鉴定，例如通过质谱。首先将需要检测的留存样品取出一份进行SD S-PAGE凝胶电泳，若为单一条带则进行肽指纹图谱的检测将凝胶对应条带切下，脱色后进行胰酶酶解、脱盐后使用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪(MALD1-T0F)进行肽指纹图谱的分析；若不是单一条带，则使用液相色谱与质谱联用技术进行检测将凝胶对应条带切下，脱色后进行胰酶酶解、脱盐后使用液相色谱-线性离子阱-轨道阱质谱联用仪(LTQ Orbitrap XL)进行分析，此时即可以大致确定蛋白点内是何种蛋白；此外，以上相关质谱技术的采用亦可对鉴定出的蛋白相关修饰进行进一步的验证与确定，如磷酸化修饰等。综上，该技术整合蛋白质分离、测试和序列分析技术于一体，从而有效解决现有蛋白质芯片制备所遇最大瓶颈，即蛋白样品来源问题。采用本发明所述技术，可以快速、高效制备针对于不同物种，包括动植物、微生物各个生物层次及生理层次，包括单一个体、器官、组织、细胞、体液及各种复杂生物材料所对应的特殊蛋白质组芯片。另一方面，本发明还涉及以上所述的个体全蛋白组芯片在以下相关研究中的应用1.抗体特异性检测现今在生物分析检测方面抗体是应用最广的生物试剂之一，其特异性直接影响着相关检测的准确度，所以在其制备生产时检测其特异性是非常必要的。现进行抗体特异性检测使用的主要方法是酶联免疫和免疫印迹，但这两个方法均无法使用全部的蛋白质进行筛选，虽然免疫印迹可以使用细胞裂解液等进行检测但其只能区分不同分子量的蛋白，若是同一分子量的蛋白具有交叉反应，则其就无法进行检测，而将抗体与此个体全蛋白质组芯片进行孵育检测，则可直接判断出其与所有蛋白质是否具有交叉反应以及交叉反应的强弱。
2.蛋白翻译后修饰检测生物体内的蛋白质具有翻译后修饰的特性，并且翻译后修饰影响着各蛋白的相关功能，所以其检测对于了解生命活动的奥秘是必不可少的，但若对每种蛋白都一一进行检测，将是十分浩大和繁琐的工程，而个体全蛋白质组芯片就可以用于蛋白质翻译后修饰检测，例如将可以识别蛋白翻译后修饰(磷酸化、糖基化等)的蛋白、抗体等与个体全蛋白质组芯片进行孵育检测，就可直接测出在同一条件下所有蛋白质的翻译后修饰状态，另外蛋白的翻译后修饰会因为生命状态的不同而改变，因此将不同时期的个体全蛋白质组芯片进行孵育检测就可建立生命活动的全部蛋白质翻译后修饰谱，其可用于如磷酸化蛋白组学等研究中。3.蛋白与蛋白、蛋白与核酸及小分子相互作用生命活动在分子形式上主要是蛋白与蛋白、蛋白与核酸及小分子相互作用，因此检测这些相互作用有助于从分子形式上了解生命活动的奥秘。个体全蛋白质组芯片就可完成此项任务，例如将需要进行检测的蛋白、核酸、小分子等直接与全蛋白质组芯片进行孵育检测，就可测出其与各个蛋白的相互作用以及作用强弱。4.自身抗原抗体的筛选与检测自身抗原抗体是现今如自身免疫病等众多疾病的诊断和治疗靶标，因此自身抗原抗体的筛选与检测将有助于现今如自身免疫病等疾病的早期诊断、治疗以及预后。而个体全蛋白质组芯片则可应用于自身抗原抗体的筛选与检测，例如使用自身免疫疾病的病人血清与正常人血清分别与各自的全蛋白质组芯片以及他人的全蛋白质组芯片进行孵育从而筛选和检测特异性抗原抗体。5.药物靶点预测现今药物的主要作用靶标是蛋白质，在进行临床试验之前使用个体全蛋白质组芯片进行药物筛选，如直接将药物与全蛋白质组芯片进行孵育检测，就可知道药物作用的相关蛋白，用以预测和证实药物治疗作用的可能性。6.酶底物谱筛选鉴定、酶活位点鉴定现今发现的酶均有特定类型的催化活性，其底物理论上是特定的一类物质如某类蛋白质等，但是如今对其进行一一的测试非常复杂和繁琐，所以不易得到酶的全部底物谱，而个体全蛋白质组芯片则可以轻松完成此项任务，例如将全蛋白质组芯片经过酶处理后再进行孵育检测并与未处理的芯片进行比较，即可得到酶的全部底物谱，此外由于全蛋白质组芯片上包含着个体的所有蛋白质以及它们翻译修饰后的种种亚型，所以其同时可用于鉴定相关的酶活位点。7.蛋白质组研究个体全蛋白质组芯片可用于蛋白质组的相关研究中，其中包括使用红色荧光值进行各蛋白质含量的测定、使用特异的抗体进行不同蛋白含量及性质的确定、将不同的蛋白质组样品与相应的全蛋白质组芯片进行孵育检测其中的相互作用蛋白等相关应用。8.疾病与生命活动监测使用个体全蛋白质组芯片检测疾病或生命活动不同发展时期的蛋白，以了解生命个体疾病不同发展时期的个体全蛋白组表达差异，从而对疾病与生命活动进行监测，并对疾病进行早期的预警、对药物治疗和预后进行指导。9. “个性化”医疗生命活动的主要执行者是蛋白质，所以使用个体全蛋白质组芯片进行个体的全蛋白组分析与比较，可有助于制定针对于个体的医疗方案。


图1 : (a)是人血清双向凝胶电泳图；(b)是胶内蛋白回收点样制成芯片的红色荧光扫描图；(c)是室温固定后使用兔抗人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)抗体孵育检测图；(d)是室温固定后使用兔抗载脂蛋白(Apoprotein)抗体孵育检测图。(X)是回收的第74份蛋白样品，可以被人血清白蛋白抗体(ant1-HSA)识别，而通过MALD1-1T-T0F检测也证明其就是人血清白蛋白。(Y)是回收的第64份蛋白样品，可以被人血清白蛋白抗体(ant1-HSA)识别，但通过LTQ Orbitrap XL检测却不是人血清白蛋白。(Z)是回收的第48份蛋白样品，可以被载脂蛋白抗体(ant1-apolipoprotein)识别，而通过MALD1-1T-T0F检测也证明其就是载脂蛋白。图2是图1中X组分的MALD1-1T-T0F肽指纹图谱。图3是图1中Z组分的MALD1-1T-T0F肽指纹图谱。图4是将生物素标记的羊IgG进行凝胶电泳后回收点样制成芯片，然后使用Cy3标记的链亲和素进行识别检测所得的结果图。图5是将经过免疫印迹验证的络氨酸(Tyrosine, Tyr)磷酸化蛋白进行凝胶电泳后回收点样制成芯片，然后经过碱性磷酸酶处理再使用Tyr磷酸化抗体识别检测所得的结果图。
具体实施案例
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。1、人血清全蛋白质 组芯片(Serum Individual Proteomic Microarray, S-1PM)的制备与检测
使用GE去血清/血浆白蛋白/IgG等高丰度蛋白亲和柱去除人血清中的高丰度蛋白后使用Bradford法对蛋白浓度进行测定。然后配制双向凝胶电泳的第一向等电聚焦电泳的上样样品450 μ L (1.3 mg蛋白样品，8 M尿素，4 % CHAPS，I % DTT, I %两性电解质)进行上样，从冰箱取出IPG预制胶条，室温放置10 min。在聚焦盘中连续、线性加样。槽两端各空I cm。去除IPG预制胶条的保护层，放入聚焦盘，室温放置45 min。在胶条背面均匀、连续覆盖矿物油即进行等电聚焦主动水化(50 V, 13 h)；.除盐(200 V，快速30 min);除盐(500 V，快速 30 min);升压(1,000 V，快速 30 min);升压(4，000 V，快速 30 min);升压(10，000，线性3 10;聚焦(10，000，快速至60，00(^!0;保持(500 V，快速)。聚焦结束直接进行第二向SDS-PAGE电泳前的平衡，将IPG胶条取出，用水冲洗掉大部分的油，再把胶条有塑料板的一面放在滤纸上吸干。然后放入平衡缓冲液I (6 M尿素，20 %甘油，2 % SDS，0.375 M Tris-HCL (pH8. 8)，I % DTT)中15 min，取出胶条用水冲洗掉大部分的油，再把胶条有塑料板的一面放在滤纸上吸干。然后放入平衡缓冲液II (6 M尿素，20 %甘油，2 %SDS,0. 375 M Tris-HCL(pH8. 8)，4 %碘乙酰胺)中15 min。剪两个空白的小滤纸条一个空白滤纸条放在凝胶板边缘紧贴SDS-PAGE凝胶，另一个空白滤纸条点上Marker样本。取出IPG胶条，用水冲洗，用滤纸吸干，将胶条上塑料板一面紧贴放置在SDS-PAGE凝胶的长玻璃板上，短玻璃板向上，然后将溶好的低熔点琼脂糖封胶液(0. 5 mg/mL低熔点琼脂糖，0. 303mg/mL Tirs,1. 44 mg/mL 甘氨酸，0. 01 % SDS, 0.001 % 溴酚蓝)快速的倒在 SDS-PAGE 凝胶的封口处并迅速地将IPG胶条插入未凝固上的琼脂糖封胶液中，待凝固，取出空白滤纸条，换成有Marker样本的滤纸条。再用琼脂糖封胶液把空隙处补满，待凝固，放入SDS凝胶电泳槽中，短玻璃板面朝里。倒上电泳液(30 mg/mL Tirs, 144 mg/mL甘氨酸，I % SDS),进行电泳。电泳结束后，固定液(10 %乙醇，7 %乙酸)固定30 min;水洗3次(10 min)后，染色液(10 %磷酸，10 %硫酸铵，O. 12 %考马斯亮蓝G-250，20 %甲醇)染色2 h ;去离子水脱色至点清晰(图la)。先将染色明显的蛋白点先切下，在进行横向(X)与纵向(Y)标记后，将肉眼可见的含有染色蛋白的胶块切下，共取下胶块347份，其中有一份为空胶对照。然后使用浸泡回收法(浸泡、透析、超滤)进行回收将胶块放在1. 5 mL的离心管中，磨碎浸泡，透析复性后超滤浓缩保存。选用HSA、人IgG、兔IgG、人血清和鼠IgG作为阳性对照；PBS作为阴性对照；以及Cy5标记的羊抗鼠IgG作为点样对照；对照和回收的样品分别取出10 μ L与10 μ L点样液等比例混合后进行点样。点样湿度为50 %,点间距为330 μ m,预点样个数为50个，选用纯水洗针，条件为抽干10 s后进行如下8个循环清洗10 S，超声10 S，清洗10 S，抽干10 S，在所有样品点样结束后直接进行红色荧光扫描(图lb)，室温干燥固定即制成人血清蛋白质组芯片。固定后使用5 %的羊血清室温封闭2 h，0.1 % PBST洗涤(5 min*3);离心甩干后一个方阵加入兔抗HSA的抗体,另一方阵加入兔抗Apoprotein抗体,37 °C孵育30 min, O.1% PBST洗涤(5 min*3) ;离心甩干后加入Cy3标记的羊抗兔IgG，37 °C孵育30 min,O.1 %PBST洗涤(5 min*3);离心甩干，进行绿色荧光和红色荧光扫描。由图1可以看出有两个蛋白点(X，Y)被兔抗HSA的抗体识别(图lc)，有一个蛋白点(Z)被兔抗Apoprotein抗体识别(图1d)。首先将这三个留存的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，发现X与Z均是单一条带所以进行肽指纹图谱的质谱鉴定，而Y不是单一条带所以进行液相色谱质谱联用的检测。首先将胶条用手术刀片切下，置于离心管中，把条带切成3-4 mm3大小,加入200 μ L超纯水(以液面没过胶粒体积为准)洗两次，10 min/次,吸干；加入200 yL乙腈/50 mM NH4HC03=2: 3，超声脱色5 min，吸干，重复此步，直至蓝色褪去；加200 μ L乙腈脱水至胶粒变白，吸干，真空抽干5 min;加入50 μ L 10 mM DTT (使用25 mMNH4HCO3配制)，56 °C水浴I h ;冷却至室温后，吸干，快速加入50 μ L 55 mM碘乙酰胺(使用25 mM NH4HCO3配制)，置于暗处45 min ;依次用25 mM NH4HCO3^50 %乙腈溶液和乙腈洗,脱水至胶粒完全变白为止,吸干,真空抽干5 min ;加入10 μ g/mL的酶溶液，加酶液量以完全润湿胶粒为准，稍微离心让酶液充分与胶粒接触，4 °C放置30 min，待溶液被胶块完全吸收，吸走多余的酶液，加25 mM NH4HCO3 30-45 yL，置37 °C水浴，消化过夜；加入10 %三氟乙酸终止反应，使溶液pH〈4，震荡混匀，离心。胶内酶解后的蛋白条带进行Ziptip C18脱盐；依次使用20 %乙腈(含O.1 %三氟乙酸)和60 %乙腈(含O.1 %三氟乙酸)进行洗脱，合并洗脱液。X与Z的洗脱液与25 mg/mL DHB混合均匀后点于靶板上进行基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪(MALD1-T0F)的肽指纹图谱检测分析；而Y则直接进行液相色谱-线性离子阱-轨道阱质谱联用仪(LTQ Orbitrap XL)的检测分析。由图2可以看出X确为HSA，而由图3也可以看出Z也为载脂蛋白类蛋白，但Y却与HSA无关。由此可以证明此种方法可以成功制备个体全蛋白质组芯片，并且用于抗体特异性检测。
2、生物素标记抗体的回收点样与识别
将生物素标记的羊IgG进行蛋白凝胶电泳，然后分别将大片段(50 kDa)、小片段(25kDa)和空胶(空白)进行回收将胶块放在1. 5 mL的离心管中，磨碎浸泡，透析复性后超滤浓缩保存。选用Cy5标记的羊抗鼠IgG作为点样对照，然后分别取出10 μ L与10 yL点样液等比例混合后进行点样。点样湿度为50 %,点间距为330 μ m,预点样个数为50个,选用纯水洗针，条件为抽干10 s后进行如下8个循环清洗10 S，超声10 S，清洗10 S，抽干10 S，点样结束后直接进行红色荧光扫描，室温干燥固定即制成芯片。固定后使用5 %的羊血清室温封闭2 h，0.1 % PBST洗涤(5 min*3);离心甩干加入Cy3标记的链亲和素进行孵育识别，O.1 % PBST洗涤(5 min*3);离心甩干，进行绿色荧光和红色荧光扫描。由图4可以看出，回收的生物素标记的羊IgG的大片段(50 kDa)和小片段(25 kDa)均可以被标记的链亲和素识别，而空白对照则无法识别。由此证明此种方法制备的芯片可用于蛋白翻译后修饰。
3、碱性磷酸酶(ALP)底物(磷酸化蛋白)回收点样测试
将经过WB验证的Tyr磷酸化蛋白进行凝胶电泳,将目标蛋白(40 kDa、24 kDa)和空胶(Blank)分别进行胶内蛋白回收将胶块放在1. 5 mL的离心管中，磨碎浸泡，透析复性后超滤浓缩保存。选用PBS作为阴性对照以及Cy5标记的羊抗鼠IgG作为点样对照，然后分别取出10 μ L与10 μ L点样液等比例混合后进行点样。点样湿度为50 %,点间距为330 μ m,预点样个数为50个,选用纯水洗针,条件为抽干10 s后进行如下8个循环清洗10 s,超声10 S，清洗10 S，抽干10 S，点样结束后直接进行红色荧光扫描，室温干燥固定即制成碱性磷酸酶底物验证芯片。一张芯片使用碱性磷酸酶(ALP)处理30 min, O.1 % PBST洗涤(5 min*3);离心甩干后与另一张没经过处理的芯片一起加入鼠抗Tyr磷酸化抗体进行孵育，4 1过夜后，O.1% PBST洗涤(5 min*3);离心甩干后加入Cy3标记的羊抗鼠IgG，37 °C孵育30 min,O.1 %PBST洗涤(5 min*3) ;离心甩干，进行绿色荧光和红色荧光扫描。由图5可以看出回收的磷酸化蛋白在芯片与WB膜上均可以直接被Tyr磷酸化抗体识别，而经过ALP处理后的芯片与WB膜则不能被Tyr磷酸化抗体识别。证明此种方法制备的芯片可以进行酶底物的筛选。应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物意欲包含在所附的权利要求中。
权利要求
1.制备个体全蛋白质组芯片的方法，其包括以下步骤 (1)样品制备，提取样品的全蛋白质组，将获取的全蛋白质组样品进行高丰度蛋白的去除与低丰度蛋白的富集，获得蛋白质样品混合液； (2)使用蛋白质高通量分离技术，使蛋白质样品混合液分别按照一定的物理、化学和/或生物性质分离成多个蛋白质组份； (3)在蛋白质通过高通量分离技术后，回收每个蛋白质样品； (4)将分离的多个蛋白质组份根据其来源进行排序，制备出具有可寻址性质的蛋白质组芯片； (5)芯片表面的生物反应/实验； (6)根据芯片生物反应实验结果对特定蛋白质进行结构解析和功能测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是器官、组织、体液、或细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质高通量分离技术是双向凝胶电泳技术、双向荧光差异凝胶电泳、高效液相色谱技术、二维液相色谱技术或毛细管电泳技术或者其他高通量蛋白质分离技术。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述蛋白质高通量分离技术是双向凝胶电泳技术。
5.根据权利要求1所述的方法，其中通过机械点样制备所述具有可寻址性质的蛋白质组芯片。
6.根据权利要求1所述的方法，其中通过质谱方法进行特定蛋白质的结构解析和功能测定。
7.根据权利要求1-6任一所述方法制备的个体全蛋白质组芯片在以下的应用抗体特异性检测，蛋白翻译后修饰检测，蛋白与蛋白、蛋白与核酸及小分子相互作用，自身抗原抗体的筛选与检测，药物靶点预测，酶底物谱筛选鉴定、酶活位点鉴定，蛋白质组研究。
全文摘要
本发明涉及一种个体全蛋白质组芯片的制备方法及其应用，包括样品制备，提取样品全蛋白质组；使用蛋白质高通量分离技术，使全蛋白质组样品分别按照一定的物理、化学和/或生物性质分离成多个含有蛋白质的组份后，回收每个蛋白质样品；并根据其来源进行排序，制备出具有可寻址性质的蛋白质组芯片；根据芯片生物反应实验结果对特定蛋白质进行结构解析和功能测定。本发明还涉及上述方法制备的个体蛋白组芯片各项生物实验、功能鉴定及信号检测，包括自身抗原抗体筛选与检测、蛋白翻译后修饰检测、蛋白与蛋白、核酸及小分子相互作用检测、配体检测、药物靶点预测、酶底物谱筛选鉴定、蛋白质组比较、疾病与生命活动监测、个性化医疗等方面的应用。
文档编号G01N33/68GK103033628SQ201210550339
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者杜宏武, 李传宝, 荀一萍, 刘佳, 王丹阳, 刘晨 申请人:北京科技大学