专利名称：抗h9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物病毒与动物传染病学检测技术领域，具体地说，本发明涉及抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，本发明还涉及抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体在在制备H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒中的应用及双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒和检测方法。
背景技术：
1975年，Kohler G和Milstein C在Nature杂志上发表了细胞融合法建立杂交瘤技术，创建了具有划时代意义的杂交瘤单克隆抗体技术。经克隆后产生结构和各种特性完全相同的高纯度抗体，称为单克隆抗体(Monoclonal Antibody, McAb),简称单抗。单克隆抗体技术的发现和使用，对现代生命科学研究的发展起到了巨大的推动作用，已经成为生物技术领域的一个重要方面。迄今，该技术的应用已经广泛应用于基础研究、疾病诊断、治疗、预防等方面。禽流感(Avianinfluenza, Al)是由 A 型流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的病毒性烈性传染病，是目前危害世界及我国养禽业最重要的疫病之一。H9亚型禽流感病毒最早由Hommee and Easterday (1970)从火鸡体内分离到。1994年，陈伯伦等(陈伯伦等，1994)从病蛋鸡体内分离到H9亚型AIV。此后，H9亚型AIV在我国广泛存在，多呈低致病性感染，并呈逐渐蔓延之势。至1997年，H9亚型AIV广泛分布于各大洲。韩国、爱尔兰、意大利等国都有H9禽流感暴发的报道，说明其已在家禽中建立了稳定的种系。1998年从香港的家猪体内分离到2株H9亚型流感病毒，这是首次从哺乳动物体内分离到H9亚型流感病毒。1999从香港患流感的女孩体内分离到两株H9流感病毒，对这两株病毒的分析表明其所有的基因片段与AIV — A / Quail / Hong Kong / Gl / 97 (H9)高度同源，是典型的禽源 流感病毒，该毒株是香港人感染H5N1和H9亚型密切相关的分支代表株。2000-2001年，对中国南方地区的水禽(主要是家鸭)进行流感病毒监测发现约10%水禽被H9感染，感染率是20世纪70年代的4倍。同样对这些H9毒株的基因片段进行克隆和测序分析，结果证明，对于HA和NA基因片段大多数与DK/ Y280/ 97亚群毒株关系密切从而证明这些毒株HA和NA基因片段的陆禽起源。而其6个内部基因片段遗传演化上则证实来自水禽并且这6个内部基因片段与2001年香港暴发的H5N1病毒内部基因片段关系紧密。据报道，A/ Quail/ Hong Kong / Gl/ 97株很可能参与了 H9亚型之间的基因重排从而产生了可感染人类的新型毒株。在猪体内也曾分离出了类人型的和类禽亚型的毒株，二者很有可能在猪体内发生基因重排，从而产生更加适应人源和禽源的毒株从而能突破种间屏障感染人。尽管还没有充分的证据表明H9亚型流感病毒能在人与人之间传播但其已经成为目前严重危害人类健康的重要传染病之一。藏鸡是世界上独一无二的宝贵遗传资源，近年来，随着西藏农牧业产业结构的调整，藏鸡场集约化程度不断提高，藏鸡养殖已经成为西藏地区农牧民增收致富的重要途径之一。但由于缺乏全面、系统的鸡病防治技术，致使鸡的各种传染性疾病发病率很高，尤其是全球流感暴发和流行，给藏鸡养殖业带来很大的经济损失，严重挫伤了农牧民养殖的积极性。西藏地处我国西南边疆，边境线漫长，与多个国家接壤，处在鸟类迁徙路线上，是我国野生鸟类重要聚集地之一，其中有的国家的野鸟中已经检测到AIV，这对西藏地区养禽业带来了严重的威胁。因此，对藏鸡、鸭等禽类进行H9亚型AIV分子流行病学调查及生物特性研究为AIV的预测预警提供理论依据是非常必要的。1971年瑞典的Engvall等人分别以纤维素和聚丙乙烯试管作为固相载体吸附抗原/抗体，建立了酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosrbent Assay,简称ELISA方法)。1974年Voller等人改用聚苯乙烯微量反应板作为固相免疫吸附载体，使ELISA方法得以推广应用，使得用于抗原定位的酶标记抗体技术发展成为液体标本中微量物质的测定方法，并逐渐成为抗原抗体检测中最为常用的一种方法。它将酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度。同时它又是一种非均相免疫分析方法，即在反应的每一步都有洗涤过程，从而除去了未反应物和干扰物质。由于ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测迅速、非放射性以及可以批量测定等诸多优点，使得ELISA方法得到了越来越广泛的应用。(焦奎等.酶联免疫分析技术及应用[M].北京化学工业出版社，2004，84 141 ;李文敏.酶联免疫吸附反应的技术进展及应用[J].湖北职业技术学院学报，2003，4 (6) : 65 69)
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体。本发明的第二个目的是提供抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的应用。本发明的第三个目的是提供一种包含所述的单克隆抗体的H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒。本发明的第四个目的是提供一种H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测方法。本发明是这样实现的申请人:所在的华中农业大学农业微生物国家重点实验室动物病原分离室从鸡群中分离得到的H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009，并制备了一种特异性强的单克隆抗体，它是抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白(HA)的单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株4D10，已于2012年11月8日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO :C2012152。申请人:利用所述的单克隆抗体制备成双抗体夹心ELISA核心试剂，建立了一种H9亚型流感病毒的双抗体夹心ELISA检测方法，并且组装了一种用于快速检测H9亚型流感病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒。本发明的试剂盒是由盒体和包含在盒体内的辣根过氧化物酶标记的由杂交瘤细胞株4D10所分泌的单克隆抗体作为酶标抗体；用保藏号为CCTCCNO C2012152的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体包被酶标板，以及样品处理液、洗涤液、底物显色A液、底物显色B液、终止液，阳性对照样品和阴性对照样品组成。更详细的技术方案如下所述。抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体的制备，它包括下列步骤
I)以从西藏病鸡中分离得到的H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009毒株为抗原，经过扩增和纯化，对5-8周龄BALB/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)进行免疫。2)细胞融合，取经加强免疫后的BALB/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)的脾脏，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(购自卫生部武汉生物制品所)融合。3)利用血凝抑制法(HI)(肖金晖等.RT-PCR法与血凝抑制法鉴定流感病毒的比较[J].中国热带医学，2005,5:401 402)，筛选出分泌抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白(HA)的抗体的阳性孔。对筛选出来的阳性孔立刻用有限稀释法(但汉并等.H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定[J].动物医学进展，2006，27 (8):67 69)进行克隆、筛选。经过3 5次克隆纯化，最终筛选出分泌抗H9亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4D10 (保藏编号为CCTCC N0:C2012152)。4)腹水的制备，取5-6周龄雌性BABL/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)腹腔注射弗氏完全佐剂O. 5ml/只，5天后腹腔注射IX IO6个杂交瘤细胞/只，9天后收取腹水，血凝抑制(HI)法检测腹水效价，-70 V保存。5)将单克隆抗体进行纯化和标记。上述抗体经过纯化和标记后可用于制备检测H9亚型流感病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒。一种H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括辣根过氧化物酶标记的由杂交瘤细胞株4D10所分泌的单克隆抗体作为酶标抗体；用杂交瘤细胞株4D10所分泌的单克隆抗体包被酶标板，以及底物显色A液、底物显色B液、终止液、10倍洗涤液、样品处理液A和样品处理液B，所述杂交瘤细胞株4D10保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: C2012152，其中底物显色A液0· 06%H202缓冲液；底物显色B液取Na2HP0412H20 14. 2g，柠檬酸10. 5g，用ddH20定容至500ml，配成
O.1mol · L磷酸盐柠檬酸缓冲液，pH5. 0，按终浓度为20mg/L添加联苯二胺；终止液40%氢氟酸625 μ L，用ddH20定容至IOOmL ；10 倍洗涤液NaCl 80g, KCl 2g, Na2HPO412H20 29g, KH2PO4 2g, Tween-20 5mL，用ddH20 定容至 lOOOmL，pH7. 4 ；样品处理液A :取 Na2B4O7 IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20 800ml，调pH值为8. 4后用蒸馏水定容至1000ml，在121 °C，高压蒸汽灭菌30分钟后分装，置4°C贮存，用于处理内脏组织；样品处理液B :取 Na2B4O7 IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20 800ml,调pH值为8. 4后用蒸馏水定容至1000ml，在121 °C，高压蒸汽灭菌30分钟后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40，混匀后分装，置4°C贮存，用于处理喉头拭子。本发明进一步提供了一种H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测方法，包括以下步骤 (I)用H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009作为免疫原；(2)用步骤(I)的免疫原制备保藏号为CCTCC NO: C2012152的杂交瘤细胞株4D10 ；
(3)用步骤(2)的杂交瘤细胞株4D10制备单克隆抗体；(4)用辣根过氧化物酶标记步骤(3)得到的单克隆抗体，作为酶标抗体；(5)将待检测样品用样品处理液A或B进行处理得到待检测物；(6)对步骤(5)所述的待检测物进行双抗体夹心酶联免疫检测，其中样品处理液A 的配制取 Na2B4O7 IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20800ml，调pH值为8. 4后用蒸馏水定容至1000ml，在121 °C，高压蒸汽灭菌30分钟后分装，置4°C贮存，用于处理内脏组织；样品处理液B 的配制取 Na2B4O7 IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20800ml,调pH值为8. 4后用蒸馏水定容至1000ml，在121 °C，高压蒸汽灭菌30分钟后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40，混匀后分装，置4°C贮存，用于处理喉头拭子。与现有技术相比本发明具有如下优点1、本发明的试剂盒和检测方法能直接对H9亚型流感病毒进行检测，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短，检测样品范围宽(鸡胚尿囊液、内脏组织匀浆液)的特点。2、本发明的试剂盒和检测方法适用于对H9亚型流感病毒进行检测，而对其它亚型的流感病毒，如经典Hl亚型、H3亚型、H5亚型的流感病毒则不反应，具有很好的特异性。
3、本发明将所需的 各种试剂组装成试剂盒，操作简单易行，不需由专业人员操作。本发明的试剂盒稳定性好、保存期长，在4°C条件下放置半年不会影响其敏感性。4、本发明一次能同时处理多个样本，非常适合H9亚型禽流感病毒的临床大规模检测。并能够满足试验要求，也可作为科研使用。5、目前市场上还没有检测H9亚型禽流感病毒抗原的试剂盒。酶标记抗体技术是ELISA检测方法的关键技术，本发明中所用的酶标记抗体是本实验室自行生产研制的抗H9亚型流感病毒血凝素单克隆抗体，经过辣根过氧化物酶(简称HRP)标记，具有很高的酶活性，产量高及成本低。
图1 :是本发明总体技术路线图。图2 :是SP2/0细胞染色体计数。图3 :4D10细胞染色体计数。图4 :抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白(HA)单克隆抗体间接免疫荧光检测图。其中图4A为抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白(HA)单克隆抗体间接免疫荧光检测图；图4B为阴性对照。
具体实施例方式实施例1 H9亚型流感病毒的制备一、H9亚型流感病毒的分离1、分离过程用灭菌的咽拭子采集病鸡样，置于灭菌磷酸盐缓冲液(简称PBS，配方=Na2CO31. 59g, NaHCO3 2. 93g,用ddH20定容至1000ml)中，随后将咽拭子样本液O. 2ml接种9日龄无特定病原体(Specific pathogen Free, SPF)鸡胚(购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)，置35°C下孵育72h，收获尿囊液做血凝定性试验，血凝试验为阳性的样本，再经过RT-PCR试验定型。2、鉴定依据=RT-PCR检测为阳性的样本，扩增HA，送上海生工生物工程有限公司测序，对所得DNA序列与网上公布的序列(http://blast. ncb1. nlm. nih. gov/ )进行比对，以确定病毒亚型。3、H9亚型流感病毒株的病毒学特征经过HA-DNA序列比对，得出与藏鸡HA-NA核酸的同源性为99 %，氨基酸同源达99%，因此确定了我们获得的流感病毒为H9亚型流感病毒。二、H9亚型流感病毒的扩增、灭活及纯化1、将 H9 亚型流感病毒 A/Chicken / Tibet / Sl/2009 进行扩增；(I)严格筛选9 10日龄无特定病原体(Specific pathogen Free, SPF)鸡胚(购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)
每批鸡胚经过严格筛选。外检共4项白壳、大小、破损及脏胚，内检共9项去除沙壳、偏气室、游气室、倒置胚、无精蛋、终止胚、弱胚、污染胚、裂缝胚。(2)接种病毒(A/Chicken / Tibet / Sl/2009)于鸡胚尿囊腔选用9 10日龄SPF鸡胚，画出气室和胚位，在气室接近胚位处涂抹碘酊和酒精进行消毒，用钢锥穿一小孔，随后将Iml注射器针头沿此小孔插入(避开血管)，接种H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009。最后用石蜡封口，并置35°C下孵育72h。每天检查鸡胚生长情况，每12h翻卵并检卵一次。24h内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡并弃去，72h收取鸡胚，4°C下放置过夜。(3)含H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009尿囊液的收获用75%浓度的酒精消毒鸡胚气室端，用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，在绒毛尿囊膜无大血管处穿破。用无菌移液管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。将鸡胚收获液3000r/min离心5min去除血液和细胞。然后进行红细胞凝集实验，确定鸡胚尿囊液血凝效价。2、H9 亚型流感病毒 A/Chicken / Tibet / Sl/2009 的灭活将含病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009尿囊液冻融3次后，按终浓度O. 8%的甲醛缓慢加入甲醛溶液，充分混合均匀，37°C灭活24小时，每隔6小时振摇I次。每个病毒灭活容器应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验。灭活容器的H9亚型流感病毒的尿囊液经检定合格。8000r/min,离心lOmin。弃去沉淀,上清备用。3、H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009浓缩及纯化(I)将H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009进行浓缩，方法是将H9亚型流感病毒鸡胚尿囊液于27000r/min，离心2h，弃去上清，沉淀用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，充分混勻备用。(2) H9 亚型流感病毒 A/Chicken / Tibet / Sl/2009 纯化在超速离心管中依次加入609^45^^30^^20%浓度蔗糖溶液形成密度梯度。将重悬好的病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009样品平铺于最上层，于32000r/min，离心lh。离心后取出45 %、30 %之间层面样品，用PBS重悬45%、30%之间层面样品取出样品，32000r/min,离心lh,取沉淀(即得所述的病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009)进行蛋白质含量测定。以此作为免疫原。实施例2抗H9亚型流感血凝素蛋白单克隆抗体的制备1、以纯化并灭活的H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009原毒株为抗原，加弗氏佐剂乳化(首免选用弗氏完全佐剂，二、三免选用弗氏不完全佐剂)免疫5-8周龄BALB/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)。首免剂量为20 μ g/只，每只小鼠颈背部皮下多点注射。二周后用相同剂量加强免疫一次，二周后再加强免疫一次，剂量为40 μ g/只，二周后断尾采集少量小鼠血，收集血清，用血凝抑制法检测小鼠抗体效价。待小鼠抗体达到试验要求，再经腹腔注射灭活及纯化的H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / S1/2009，注射剂量为40 μ g/只免疫一次。三天后，即可取免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞(购自卫生部武汉生物制品所)按实验室常规方法进行融合。2、细胞融合，取经过加强免疫的BALB/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75%浓度酒精中浸泡IOmin消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(购自卫生部武汉生物制品所)按I X IO7个SP2/0与IO8个免疫细胞(个数比1:10)的比例于50ml离心管中混匀，1500r/min，离心lOmin。弃去上清，管壁用灭菌的滤纸吸干，轻震管底，使细胞沉淀略有松动。将装有细胞混合物的离心管放置于37°C恒温水浴中。然后在Imin内慢慢滴入预温至37°C的50%聚乙二醇(PEG) O. 8ml (购自sigma公司),边加边轻轻用吸管尖搅拌,继续搅拌lmin。然后慢慢加入预温至37°C的1640 (购自sigma公司)细胞培养液40ml。融合具体步骤如下第一分钟逐滴滴入50%聚乙二醇(PEG)O. 8 ml，静置O. 5min ;第二分钟加1640细胞培养液lml，静置O. 5min (重复一次)；第四分钟加1. 5ml，静置O. 5min (重复一次)；第六分钟加5ml，静置O. 5min (重复一次);第八分钟加10ml，静置O. 5min (重复一次);每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。静置lmin, 1000r/min离心IOmin,弃上清，于37°C环境中放置8min。用HAT培养基(购自Sigma公司)悬浮，同时也用HAT培养基悬浮制备好的饲养脾细胞并与融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT培养基，分种于96孔培养板中，约200 μ I/孔。一次融合可接种4 8块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含IO4左右个SP2/0细胞。于37°C，5% C02培养箱中培养。融合后第二天开始观察96孔板内细胞有无污染，于第4天用HT培养基换HAT培养基IOOyl0待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体效价检测。采用灭活H9亚型流感病毒A/Chicken / Tibet / Sl/2009作为筛选抗原，利用血凝抑制法(肖金晖等.RT-PCR法与血凝抑制法鉴定流感病毒的比较[J].中国热带医学，2005，5:401 402)筛选出分泌抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白(HA)抗体的阳性孔。对筛选出来的阳性孔立刻用有限稀释法(但汉并等.H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定[J].动物医学进展，2006，27 (8):67 69)进行克隆、筛选。经过3 5次克隆纯化，最终筛选出分泌抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白(HA)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4D10，于2012年11月8日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为 CCTCC NO C2012152o 3、腹水的制备，选用5-6周龄雌BABL/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)腹腔注射弗氏完全佐剂O. 5ml/只，5天后腹腔注射I X IO6个杂交瘤细胞/只，9天后收取腹水，血凝抑制法(HI)检测腹水效价，-70 V保存。4、腹水抗体的纯化辛酸-硫酸铵法具体步骤如下(I)将上述步骤3制备的腹水1000r/min离心10 min,用O. 45Mm滤膜过滤,滤液边搅拌边加入用4倍体积60mmol/L醋酸缓冲液(pH=4. 5)；(2)边搅拌边逐滴加入正辛酸至终浓度为33μ1/πι1，室温条件下搅拌30min，8000r/min离心30min,弃沉淀收集上清；(3)将步骤(2)的上清液经滤纸过滤一次，滤液pH调制7. 4 ；(4)向步骤(3)所得的滤液边搅拌边加入饱和硫酸铵溶液(硫酸铵体积/总体积兰45%)，待滤液呈白色浑浊液时，继续搅拌30min，然后于4°C静置5h。再于4°C条件12000r/min 下离心 30mi n ；(5)弃上清，沉淀用 IOmmol pH=9. O Tris-HCl 重悬；在 100 倍体积的 IOmmolpH=9. O的Tris-HCl中，于4°C条件下磁力搅拌透析,透析36h,期间3次(12h/次)更换新鲜Tris-HCl液。透析结束后，取上清，用SDS-PAGE电泳的方法鉴定抗体的纯度，用紫外分光光度计测定抗体浓度，分装、冻存。上述纯化抗体试验中所用试剂按照以下配方配制醋酸缓冲液(60mmol/L)=C2H3NaO2 2. 463g，用 ddH20 定容至 500 ml (ρΗ=4· 5)；饱和硫酸铵溶液每IOOml ddH20中加(NH4)2S04 90g,加热至80°C溶解，趁热滤纸过滤，降至室温即有结晶析出，所得带有结晶滤液即为饱和硫酸铵溶液。用25%氨水调pH值至7. 2，备用。5、辣根过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗体(I)取辣根过氧化物酶(HRP) 5. O mg溶于5 ml ddH20，溶液呈棕红色；随后滴加NaIO4 (60mmol/L) O. 5ml，使溶液呈草绿色，4°C条件放置30min ;滴加乙二醇(160mmol/L)
O.5ml,终止氧化反应,室温下避光放置30min,溶液呈棕黄色；(2)取本发明制备的单克隆抗体5ml (mg /ml)与上述步骤(I)所处理好的液体混合，IOmmol pH=9. 5碳酸盐缓冲液,4°C条件下磁力搅拌透析过夜。(3)向完成透析液体中加新鲜配制的浓度为5 mg /ml的NaBH4O. 2ml，于4°C下放置2h ;然后等体积加入饱和硫酸铵,于4°C下静置30min, 7000r/min离心lOmin,弃去上清。PB溶液(20mmol/L pH=7. 4，配制方法如后所述)3ml重悬，在1000倍体积的PB (20mmol/LpH=7. 4)中，4°C条件下磁力搅拌透析，透析36h，期间3次(12h/次)换液。(4)标记抗体完成透析后，加PB (20mmol/L ρΗ=7· 4)、甘油(终浓度30%)定容至5ml，于-20°C保存。标记抗体试验中所用试剂按以下配方配制NaIO4 (60mmol/L) =NaIO41. 283g，用 ddH20 定容至 IOOml ；乙二醇(160mmol/L):乙二醇13. 4μ1，用 ddH20 稀释至1. 5ml ；碳酸盐缓冲液IOmmol pH=9. 5 =Na2CO31. 59g, NaHCO3 2. 93g,用 ddH20 定容至1000ml (pH=9. 5)；NaBH4 (5 mg /ml) =NaBH4O. 05g,用 ddH20 定容至 IOml，现配现用；
饱和硫酸铵溶液 每100ml ddH20中加(NH4)2S04 90g,加热至80°C溶解，趁热滤纸过滤，降至室温即有结晶析出，所得带有结晶滤液即为饱和硫酸铵溶液。用25%氨水调pH值至7. 2，备用；PB (20mmol/L pH=7. 4) =Na2HPO412H20 3. 58g, NaH2PO41. 56 g，用 ddH20 定容至1000ml (pH=7. 4)；醋酸缓冲液(60mmol/L)C2H3NA022. 463g，用 ddH20 定容至 500ml (pH=4. 5)。实施例3抗H9亚型流感血凝素蛋白单克隆抗体的鉴定1、HI效价的鉴定采用本发明分离得到的H9亚型流感病毒作为抗原用血凝抑制法测定杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水的效价。结果见表I。表1:利用血凝抑制法(HI)测定杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水的效价
权利要求
1.一种抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C2012152的杂交瘤细胞株4D10所分泌的。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株4D10，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO C2012152。
3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒中的应用。
4.包含权利要求1所述的单克隆抗体的H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒。
5.—种H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括辣根过氧化物酶标记的由杂交瘤细胞株4D10所分泌的单克隆抗体作为酶标抗体、用杂交瘤细胞株4D10所分泌的单克隆抗体包被酶标板，以及底物显色A液、底物显色B液、终止液、10倍洗涤液、样品处理液A和样品处理液B，所述杂交瘤细胞株4D10保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: C2012152，其中 底物显色A液0. 06%H202缓冲液； 底物显色B液取Na2HPO4-12H20 14. 2g，柠檬酸10. 5g，用ddH20定容至500ml,配成O.lmol/L磷酸盐柠檬酸缓冲液，pH5. 0，按终浓度为20mg/L添加联苯二胺； 终止液40%氢氟酸625 μ L，用ddH20定容至IOOmL ；10 倍洗涤液NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4.12H20 29g, KH2PO4 2g, Tween-20 5mL，用 ddH20定容至 IOOOmL, pH7. 4 ；样品处理液 A :取 Na2B4O7 · IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20 800ml，调 pH值为8. 4后用蒸馏水定容至1000ml，在121°C，高压蒸汽灭菌30分钟后分装，置4°C贮存，用于处理内脏组织；样品处理液 B :取 Na2B4O7 · IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20 800ml，调pH值为8. 4后用蒸馏水定容至1000ml，在121°C，高压蒸汽灭菌30分钟后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40，混匀后分装，置4°C贮存，用于处理喉头拭子。
6.权利要求4或5所述的双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒在H9亚型流感病毒检测中的应用。
7.一种H9亚型流感病毒双抗体夹心酶联免疫检测方法，包括以下步骤 (1)用H9亚型流感病毒A/Chicken/ Tibet / S1/2009作为免疫原； (2)用步骤(I)的免疫原制备保藏号为CCTCCNO: C2012152的杂交瘤细胞株4D10 ； (3)用步骤(2)的杂交瘤细胞株4D10制备单克隆抗体； (4)用辣根过氧化物酶标记步骤(3)得到的单克隆抗体，作为酶标抗体； (5)将待检测样品用样品处理液A或B进行处理得到待检测物； (6)对步骤(5)所述的待检测物进行双抗体夹心酶联免疫检测， 其中 样品处理液 A 的配制取 Na2B4O7 · IOH2O 13. 3g，H3BO3 16. 08g，NaCl 8. 5g, ddH20800ml，调pH值为8. 4后用蒸馏水定容至1000ml，在121 °C，高压蒸汽灭菌30分钟后分装，置4°C贮存，用于处理内脏组织；样品处理液 B 的配制取 Na2B4O7 · IOH2O 13. 3g, H3BO3 16. 08g, NaCl 8. 5g, ddH20800ml，调pH值为8. 4后用蒸馏水定容至IOOOml，在121 °C，高压蒸汽灭菌30分钟后加入5gN-乙 酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40，混匀后分装，置4°C贮存，用于处理喉头拭子。
全文摘要
本发明公开了一种抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO: C2012152的杂交瘤细胞株4D10所分泌的。本发明还公开了一种H9亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒及检测方法。本发明试剂盒以抗H9亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体为二抗，公开了H9亚型流感病毒的分离、扩增、灭活和纯化方法及H9亚型流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及纯化方法。本发明的试剂盒和检测方法能直接对H9亚型流感病毒进行检测，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短，检测样品范围宽等特点。
文档编号G01N33/569GK103059132SQ201210550329
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者周红波, 金梅林, 陈焕春, 程艳青, 但汉并, 郭学波, 张艳, 黄慧敏, 刘小坤 申请人:华中农业大学