专利名称：一种用免疫比浊法测定载脂蛋白c2的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学免疫体外诊断试剂领域，具体涉及一种用免疫比浊法测定载脂蛋白C2 (AP0C2)的试剂盒。
背景技术：
人Apo CII为含79个氨基酸残基的单链多肽，分子量为9. lkD。先合成的Apo CII 含101氨基酸残，其中22个氨基酸构成信号肽，除去信号肽后则转变为成熟Apo CIL·对 Apo CII的氨基酸序列进行Chuo-Fasman分析表明Apo CII的第13-22, 29-40,43-52氨基酸残基为双性α螺旋，具有与脂质结合的功能，第9-12、23-26、53-56氨基酸残基为β转角结构，第61-74ΑΑ残基为α-双性螺旋，是与脂质结合的区域，第1_39、54_69氨基酸残基为转角结构。对Apo CII溴化氰水解片段或合成片段的研究表明Apo CII激活低密度脂蛋白的肽段为羧基端56-79氨基酸残基，其激活作用可被具有结合磷脂活性的第44-55 氨基酸残基段加强；切除Apo CII羧基末端3个氨基酸残基，Apo CII激活低密度脂蛋白的活性完全丧失。
低密度脂蛋白是乳糜微粒和极低密度脂蛋白水解的关键酶。研究表明ApoCII是低密度脂蛋白不可缺少的激活剂，Apo CII缺乏时，低密度脂蛋白活性极低；Apo CII存在时，低密度脂蛋白活性可增加10-50倍，因此Apo CII具有促进乳糜微粒和将极低密度脂蛋白降解的作用。Apo CII激活将低密度脂蛋白的机理可能是:Apo CII从"酶-底物"中间体接受脂酰基，然后将其转移到白蛋白上。Apo CII还具有抑制肝脏对乳糜微粒和极低密度脂蛋白摄取的作用。在体外试验中发现，Apo CII还可抑制肝甘油三酯脂肪酶活性，抑制程度与Apo CII浓度呈线性关系。由于肝脂酶可催化经将低密度脂蛋白作用后脂蛋白残粒中三酰甘油水解，因此Apo CII亦可能参与血浆中脂蛋白残粒的清除过程。因此，Apo CII 对脂蛋白的结构、功能和代谢至关重要，可以为诊断脂质代谢疾病提供有价值的指标。
现有的AP0C2检测技术存在诸多不足如需要特殊的设备，样本需要预处理，不能上全自动生化分析仪进行批量检测分析等。酶联免疫法应用比较普遍，其原理是将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体；洗涤除去未结合的抗体及杂质；加待测样品，使之与固相抗体反应一段时间，让样品中抗原与固相载体上的抗体结合；洗涤除去未结合的物质； 加酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合；洗涤除去未结合的酶标抗体; 此时固相载体上的酶量与样品中的待测物质的量正相关；加入底物反应显色。根据颜色反应的程度对测定物质进行定性或定量测定。该方法为非均相免疫检测系统，测定过程较为繁琐，耗时长，缺少单位测试运行时间；自动化程度不高，批间差和重复性相对较大；需要配备多种专门设备，一定程度上增加了成本。发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用免疫比浊法测定载脂蛋白C2的试剂盒，其操作简单、准确度高、重复性好、可进行批量 样本全自动化检测，从而消除上述背景技术中缺陷。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是
一种用免疫比浊法测定载脂蛋白C2的试剂盒，该试剂盒包含试剂R1、试剂R2和校 准品，其中，
试剂Rl包含缓冲液10 500mM、表面活性剂I 100g/L、电解质5 50g/L、高分 子加速剂2 100g/L、稳定剂I 50g/L、防腐剂I 10g/L ；
试剂R2包含缓冲液10 500mM、抗人AP0C2抗体15% 30% (w/v)、电解质5 50g/L、防腐剂 I 10g/L ；
校准品包含缓冲液10 500mM、AP0C2抗原O 100mg/L、稳定剂I 50g/L、防腐 剂I 10g/L、抗氧化剂O. 01 10g/L。
上述缓冲液10 500mM，即为10 500mmol/L ;抗人AP0C2抗体15% 30% (w/ V)，即为抗人AP0C2抗体浓度为150 300g/L。
作为一种改进，上述试剂盒中，
所述缓冲液为磷酸盐、硼酸、甘氨酸、TRIS、PBS、CAPS0、HEPES缓冲液中的一种或几 种；
抗人AP0C2抗体包括鼠抗人、兔抗人、羊抗人、鸡抗人、鸭抗人抗体中的一种或两 种；
抗人AP0C2抗体的种类包括单克隆抗体或多克隆抗体中的一种；
所述电解质包括氯化钠、氯化镁、氯化钾、硫酸镁中的一种或几种；
所述高分子加速剂包括聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇 8000中的一种或多种；
所述稳定剂包括牛血清蛋白、乙二胺四乙酸二钠、葡萄糖、海藻糖、甘露糖醇中的 一种或几种；
所述表面活性剂包括Triton系列、Tween系列、月桂醚、聚氧乙烯烧基苯基醚、聚 氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚中的一种；
所述抗氧化剂包括丁基羟基茴香醚、甘草抗氧化物、二丁基羟基甲苯、苯多酚、硫 代二丙酸二月桂酯系列中的一种或几种；
所述防腐剂包括叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、乙基汞硫代硫 酸钠中的一种或几种。
为了保证缓冲体系的一致性，作为一种优选的技术方案，所述试剂Rl和试剂R2中 的缓冲液种类相同。
作为一种优选的技术方案，该试剂盒中，
试剂Rl包含磷酸盐缓冲液10 IOOmM,聚氧乙烯月桂醚I 50g/L,氯化钠5 15g/L,聚乙二醇600050 100g/L,乙二胺四乙酸二钠5 15g/L,叠氮钠I 5g/L ；
试剂R2包含磷酸盐缓冲液10 IOOmM,羊抗人AP0C2多克隆抗体，氯化钠5 15g/L,叠氮钠I 5g/L ；
校准品包含甘氨酸缓冲液10 500mM，AP0C2抗原O 80mg/L，乙二胺四乙酸二 钠5 50g/L,叠氮钠I 10g/L, 丁基轻基茴香醚0. 01 10g/L。
所述校准品可以配制成高浓度单点校准品，在使用时用生理盐水稀释成5个不同浓度的参考校准品，也可以直接制备成5个不同浓度的参考校准品。本发明的免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法，其基本原理是样本中的 AP0C2抗原和试剂R2中的抗人AP0C2抗体发生相应的抗原抗体反应，形成不溶性的抗 原-抗体复合物，使反应液产生一定的浊度。反应液中抗-AP0C2抗体过量时，形成的免疫复 合物的量随着样本中AP0C2抗原量的增加而增加，反应液的浊度也相应增加。在特定波长 下测定该复合物的吸光值，与校准品标定的校准曲线比较，即可计算出样本中的AP0C2的 含量。由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是与现有技术相比较，本发明提供的试剂盒使用简便快速，能够直接采用全自动生 化分析仪进行检测，操作方法和步骤得到了简化，满足临床快速高通量检测样本的要求，检 测效率明显提高；试剂盒由于使用了筛选的最优化试剂组合，使得试剂的稳定性大大提高， 2-8°C可以稳定存放一年以上。因此本发明试剂盒具有很高的临床应用价值，适合临床推广。
图1为本发明实施例3、4和5检测AP0C2含量的方法流程示意图；图2为本发明实施例3的AP0C2校准品的标准曲线；图3为本发明实施例4与对比试剂相关性趋势图。
具体实施例方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例11.配制试剂试剂R1
甘氣酸(缓冲液)500 mM 聚氧乙烯烷基苯基醚(表面活性剂) 100 g/L 氯化纳和氯化後(电解质)50 g/L
聚乙二醇2000 (高分子加速剂)100 g/L
牛血清蛋白(稳定剂)50 g/L 对羟基苯曱酸(防腐剂)10 g/L试剂R2 兔抗人AP0C2多克隆抗体15% (w/v)甘氨酸(缓冲液)500mM氯化钾(电解质)50g/L对羟基苯甲酸乙酯(防腐剂)lg/L
校准品
磷酸盐(缓冲液)500mM
乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)50g/L
叠氮钠(防腐剂)lg/L
丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)O. OI g/L
按照需要的校准品浓度将相应量的AP0C2抗原添加到所述溶液中，制备得到AP0C2校准品。该校准品可以是高浓度单点校准品，在使用时用生理盐水稀释成5个不同浓度的参考校准品，也可以直接制备成5个不同浓度的参考校准品。本实施例配制5个不同浓度的参考校准品，分别为0mg/L、9. 4mg/L、18. 8mg/L、37. 5mg/Ij、75mg/L。然后用 0.22 μ m的滤膜过滤除菌，放置2 8°C保存。
实施例2
试剂Rl
权利要求
1.一种用免疫比浊法测定载脂蛋白C2的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含试剂 R1、试剂R2和校准品，其中，试剂Rl包含缓冲液10 500mM、表面活性剂I 100g/L、电解质5 50g/L、高分子加50g/L、防腐剂 I 10g/L ；500mM、抗人AP0C2抗体150 300g/L、电解质5 50g/L、防速剂2 100g/L、稳定剂I ' 试剂R2包含缓冲液10 腐剂I 10g/L ；校准品包含缓冲液10 , I 10g/L、抗氧化剂0. 01 -■ 500mM、AP0C2抗原O 100mg/L、稳定剂I 50g/L、防腐剂 10g/L。
2.如权利要求1所述的一种用免疫比浊法测定载脂蛋白C2的试剂盒，其特征在于所述缓冲液为磷酸盐、硼酸、甘氨酸、TRIS、PBS、CAPS0、HEPES缓冲液中的一种或几种。
3.如权利要求1所述的一种用免疫比浊法测定载脂蛋白C2的试剂盒，其特征在于 抗人AP0C2抗体包括鼠抗人、兔抗人、羊抗人、鸡抗人、鸭抗人抗体中的一种或两种；抗人 AP0C2抗体的种类包括单克隆抗体或多克隆抗体中的一种。
4.如权利要求1所述的一种用免疫比浊法测定载脂蛋白C2的试剂盒，其特征在于所述高分子加速剂包括聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的一种用免疫比浊法测定载脂蛋白C2的试剂盒，其特征在于所述稳定剂包括牛血清蛋白、乙二胺四乙酸二钠、葡萄糖、海藻糖、甘露糖醇中的一种或几种。
6.如权利要求1所述的一种用免疫比浊法测定载脂蛋白C2的试剂盒，其特征在于所述表面活性剂包括Triton系列、Tween系列、月桂醚、聚氧乙烯烧基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚中的一种。
7.如权利要求1所述的一种用免疫比浊法测定载脂蛋白C2的试剂盒，其特征在于所述抗氧化剂包括丁基羟基茴香醚、甘草抗氧化物、二丁基羟基甲苯、苯多酚、硫代二丙酸二月桂酯系列中的一种或几种。
8.如权利要求1所述的一种用免疫比浊法测定载脂蛋白C2的试剂盒，其特征在于所述防腐剂包括叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种。
9.如权利要求1 8任一项所述的一种用免疫比浊法测定载脂蛋白C2的试剂盒，其特征在于所述试剂Rl和试剂R2中的缓冲液种类相同。
10.如权利要求9所述的一种用免疫比浊法测定载脂蛋白C2的试剂盒，其特征在于 所述试剂盒中，试剂Rl包含磷酸盐缓冲液10 IOOmM,聚氧乙烯月桂醚I 50g/L,氯化钠5 15g/ L,聚乙二醇6000 50 100g/L,乙二胺四乙酸二钠5 15g/L,叠氮钠I 5g/L ；试剂R2包含磷酸盐缓冲液10 IOOmM,羊抗人AP0C2多克隆抗体，氯化钠5 15g/L， 叠氮钠I 5g/L ；校准品包含甘氨酸缓冲液10 500mM，AP0C2抗原O 80mg/L，乙二胺四乙酸二钠5 50g/L,叠氮钠I 10g/L, 丁基轻基茴香醚0. 01 10g/Lo
全文摘要
一种用免疫比浊法测定载脂蛋白C2的试剂盒，试剂R1含有缓冲液10～500mM、表面活性剂1～100g/L、电解质5～50g/L、高分子加速剂2～100g/L、稳定剂1～50g/L、防腐剂1～10g/L；试剂R2含有缓冲液10～500mM、抗人APOC2抗体150～300g/L、电解质5～50g/L、防腐剂1～10g/L；校准品含有缓冲液10～500mM、APOC2抗原0～100mg/L、稳定剂1～50g/L、防腐剂1～10g/L、抗氧化剂0.01～10g/L。本发明使用简便快速，能够满足临床快速高通量检测样本的要求，检测效率明显提高，批间差异小，试剂稳定。
文档编号G01N33/68GK103063848SQ20121057538
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者宿明明, 王庆国, 张洋, 王爱龙 申请人:潍坊三维生物工程集团有限公司