脂蛋白测定的制作方法

专利名称：：脂蛋白测定的制作方法脂蛋白测定本发明涉及用于确定样品，诸如血浆或血清中的脂蛋白浓度的测定系统。在本发明的一个方面中，该测定系统可以包括可以用于区分样品混合物中不同类型脂质分子的附加步骤。脂质是有生命生物中存在的多种不同组的有机化合物。它们在水中是不溶的，但是可溶于有机溶剂。将脂质广泛分类成两个类别(i)复杂脂质；和(ii)简单脂质。复杂脂质是长链脂肪酸的酯并且包括甘油酯类、糖脂类、磷脂类、胆固醇酯和蜡。不含有脂肪酸的简单脂质，包括类固醇(例如，胆固醇)和萜类。脂质可以与蛋白质结合形成脂蛋白，其为诸如胆固醇和甘油三酯的脂质在血液和淋巴中被输送的形式。在血浆中发现的脂蛋白属于三个主要分类(i)高密度脂蛋白(HDL)，(ii)低密度脂蛋白(LDL)，禾叩ii)极低密度的脂蛋白(VLDL)，以及中间密度脂蛋白(IDL)。充分记载的是，在血液血浆中不同脂蛋白的浓度和动脉粥样硬化风险之间存在有力的关系，动脉粥样硬化即在血管壁上发展有害斑块，其可以导致心脏病发作。同样己知，不同类别的脂蛋白(HDL、LDL禾QVLDL)在动脉粥样硬化中各自起不同的作用。例如，HDL被认为是抗致动脉粥样化的(anti-atherogenic)的，而已知LDL是高度致动脉粥样化的(它携带的胆固醇与动脉粥样硬化的发展密切相关)。因此，关于血液中多种脂质成分(即脂蛋白)的总脂蛋白含量以及多种脂质成分的每一种的相对浓度的知识，将是有利的，因为这将帮助临床医生治疗具有不适当的这些脂质血液浓度的患者。应当理解，具有患者脂蛋白分布的知识对于临床医生将是最有利的。已经开发了用于确定血液中一些脂质成分浓度的测定。这样的测定通常包括首先从患者取血样，然后将其送到临床实验室进行分析。这样的测定利用昂贵的装置进行，并且出于计算原因需要相当长的时间以产生结果。这耽误治疗。而且，所述测试是复杂的，并且因此是昂贵的。另外，在实验室中使用的装置不容易便携，并且因此不能由普通医师(GP)或护士在出诊时使用，或者甚至不能作为家用测试试剂盒使用。最近已经开发了试图在"治疗点(pointofcare)"重现实验室测定的装置，但是已经证明这些是昂贵的并且需要熟练的使用者操作。因此，存在对于提供用于分析血液血清中脂蛋白分布的改进方法的需要。血清是多种蛋白质的复杂混合物，并且虽然分离并直接测量不同类别脂蛋白浓度的方法是己知的，但是这样的方法是复杂而昂贵的。在WO01/53829A1中公开了用于确定血液血清的脂蛋白浓度的测定的实施例。该文件涉及特别的有机发光体，4-二甲基氨基-4'-二氟甲基-磺酰-亚苄基-苯乙酮(DMSBA)，作为荧光探针的使用。所述探针的式，确定为K-37，给定如下-探针K-37在水中不发光，但是在脂蛋白水溶液诸如血液血清中是高度发光的。特别是，荧光强度高度依赖于血液血清的脂蛋白含量，并因而可以将K-37用作荧光探针以测量可能存在的脂蛋白浓度，即当结合到脂蛋白的脂质上并在适当辐射波长激发时，K-37发荧光。因此，脂蛋白混合物的时间分辨(time-resoWed)荧光衰减的测量可用于产生关于在所述混合物中存在的不同脂蛋白(LDL、和VLDL滩对浓度的直接信息。然而，利用K-37时间分辨荧光衰减的问题是它的测量是复杂的并且需要昂贵的装备。而且，它涉及对所产生的数据的高度专业的计算机分析，其为了正确解释可能是耗时的。因此，当希望快速决定治疗过程而不是花费时间使用时间分辨荧光衰减以提供脂蛋白分析时，使用K-37时间分辨的荧光衰减以确定血液中脂质成分的浓度对于临床医生具有严重的局限性。因此，即使存在通过利用使用探针K-37的时间分辨荧光分析而确定样品中特定脂蛋白浓度的可用方法，应当理解该方法具有许多局限性。因此本发明实施方案的目的是排除或减轻现有技术的问题，并且提供用于确定样品中脂蛋白浓度的改进方法。本发明人决定研究他们是否能够开发基于使用荧光染料测量生物样品中脂蛋白的简化测定。该决定是在考虑针对研究这类测定的技术偏见的条件下作出的。生物样品，且特别是血样，含有在相对宽的波长范屈内自发荧光的分子，并且因此认为不可能开发基于简单荧光的测定。为了确定血样中总脂蛋白(即HDL、LDL、和VLDL)的浓度，本发明人认识到优选地，来自与多种脂蛋白类别结合的染料的荧光响应，对于给定的总脂蛋白浓度，即总脂蛋白浓度，必须是基本上相同的，而不考虑它的组成(即样品中HDL丄DL:IDL:VLDL的比例)。因此，本发明人相信，优选地，来自染料物质的荧光强度响应在脂蛋白分子的浓度范围内也应当基本上是线性的，认为所述脂蛋白分子来自临床测试中遇到的样品。虽然本发明人不希望受限于任何假设，但是他们相信来自染料物质的荧光强度将取决于它对于样品中特定脂蛋白分子(HDL、LDL、IDL或VLDL)的亲合性，依赖于脂蛋白分子络合物内的环境的荧光量子收率，以及还有由压紧在一起的染料分子之间的能量传递所引起的荧光猝灭的程度。因此，本发明人推断，可以选择适合的染料物质，所述染料物质可以通过简单的荧光测量，用于进行总脂蛋白的精确测量。本发明人因此进行一系列实验(在实施例1-3中论述)以研究是否可以在真实血清样中遇到的脂蛋白浓度范围内获得许多染料物质和各种脂蛋白颗粒类型(HDL、LDL和VLDL)的脂蛋白浓度之间的线性和相等的关系。令他们意外地是，他们发现对于特殊类型的染料，存在荧光和脂蛋白浓度之间的线性关系。因此，根据本发明的第一个方面，提供确定样品中总脂蛋白浓度的方法，所述方法包含下列步骤-(i)将亲脂性染料加入到样品的等分试样中，所述亲脂性染料与样品中6的脂蛋白结合，并且当其如此结合时在适当激发下发荧光；和(ii)利用荧光分析确定样品中总脂蛋白浓度。由术语"总脂蛋白"，我们指的是样品中VLDL、HDL、LDL、IDL和乳糜微粒的共同浓度。本发明人己经确定荧光、亲脂性染料可以有利地用于确定样品的总脂蛋白含量。它们意外地发现所述染料克服了现有技术的缺点，并可以用在基于精确快速简单荧光的测定中，所述测定可以在可在本领域中(例如，在商店，GP手术室或家庭随访中)使用的简单荧光计上操作，并且不需要专业知识进行操作。可以使用广泛多样的亲脂性染料。然而，本发明人已经确定按照本发明，双酚染料(即，包括两个酚基团的染料)是特别有效的。按照本发明第--方面的双酚染料可以包括两个酚基团，其由包括至少3个碳原子的碳链分开。该碳链还优选地包括至少一个不饱和键。应该理解所述染料可以在酚基团和碳链上具有取代。在本发明的优选实施方案中，优选地，所述染料物质包括荧光单元(即，荧光化学部分)，其称为查耳酮或benzalideneacetophenone。该单元具有下述通式査耳酮或benzalideneacetophenone染料具有取代到查耳酮基团的酚环上的官能团。这些官能团的性质能够对染料的性质具有大量影响，所述染料的性质包括(a)使激发和发射波长改变到更长的波长；(b)赋予这样的优势，即用于激发染料的波长应该产生很少的来自血液血浆的许多紫外(波长〈400nm)可激发成分背景荧光；7(c)对溶剂(环境)的极性的灵敏性；(d)电荷转移作用导致光谱的改变；和(e)通过系统间过渡到三重态而在非-极性溶剂中引起猝灭。应该理解K-37是取代的查耳酮染料的一个实例。我们的同时待审的、未公开的申请PCT/GB2005/004794涉及基于K-37的改进测定。因此，在本发明第一方面的一些实施方案中，即考虑参考基于査耳酮的染料，本发明的第一方面意欲排除K-37。然而，当按照本发明的第一方面使用K-37时，优选地，如下所讨论地和如连同本发明的第二方面--起讨论地对其进行使用。4-二甲氨基甲基査耳酮也可以按照本发明的第一方面的这一实施方案进行使用。该染料具有如下的式4-二甲氨基甲基査耳酮包括在对位添加了二甲氨基基团和甲基基团的査耳酮单元。4-二甲氨基甲基查耳酮的最大激发在420nm，且最大发射在490nm。因此，应该理解这些波长使得所述染料特别适合于测定血清或血浆样品。在本发明第一方面的另一个优选实施方案中，亲脂性染料是包括荧光单元(即，荧光化学部分)的染料物质，所述荧光单元具有化学结构Ph-[C-C=C]n-C-Ph。n优选地可以是2-6。包括这样的荧光单元的优选染料是二苯己三烯(DPH)和二苯辛四烯(Diphenyloctatetrene,DPO)。DPH具有通式:8DPO具有通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>ph-[c-oc]n-c-Ph染料可以在酚环上具有取代。作为关于基于査耳酮的染料的情形，这些取代可以调节染料物质的荧光性质。按照本发明的Ph-[C-C=C]n-C-Ph染料还可以在碳链上被取代。其他优选的Ph-[C-OC]n-C-Ph染料包括本领域中己知的衍生物，并且对于与它们共价结合的膜成分是可用的(例如胆固醇，磷脂，甘油三酯，鞘磷脂等)。DPH在约380nm处具有最大激发，且在440nm出具有最大发射，尽管它到约400nm仍可激发。因此，应该理解基于DPH的染料适合于按照本发明使用，因为它可以通过在约400nm处激发和在440nm处读数来避免与基于血液的样品(血清或血浆)有关的许多污染性荧光背景。DPO具有与DPH类似的性质，但是甚至是更优选的，因为它在约430nm处具有最大激发。在本发明第一方面的另一个优选实施方案中，亲脂性染料是香豆素染料或其衍生物。所述染料是本领域中众所周知的。优选的香豆素染料是香豆素30，其具有如下结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>香豆素30有利地具有下列特征1.在PBS(磷酸盐缓冲液)'中的低荧光2.在delipified血浆中和因此在蛋白质中的低荧光3.在脂质中非常高的荧光合适地，加入到样品中的亲脂性染料的浓度可以在大约0.01-20.0mM之间，更合适地，在大约0.05-10mM之间，和甚至更合适地，在大约0.1-1.6mM之间。应该理解最优选的染料浓度对所用的染料应该是唯-一的。作为实例，当染料是査耳酮染料时，加入样品中的K-37染料的浓度可以在大约0.2-1.0mM之间，更合适地，在大约0.3-0.9mM之间，和甚至更合适地，在大约0.5-0.8mM之间。优选地，加入样品中的K-37的浓度在大约0.65-0.75mM之间。0.65mMK-37是特别优选的浓度。作为进一步的实例，当染料是基于Ph-[C-C=C]n-C-Ph的染料时，加入样品中的染料浓度可以在大约0.01-20mM之间(取决于所用的具体染料)。例如当染料为取代的DPH时，0.05-5mM是优选的浓度，且特别优选的浓度是约0.4mMDPH。备选地，当染料是DPO时，加入样品中的染料浓度可以在大约0.1-5.0mM之间，更合适地，在大约0.2-1.0mM之间，和甚至更合适地，在大约0.3-0.7mM之间。优选地，加入样品中的DPO浓度是大约0.4-0.5mM。应该理解按照本发明第一方面的方法包括在激发波长处激发样品和然后在另一个发射波长处观察荧光。激发和发射波长的选择应该取决于所选染料的性质。为了本发明的目的可以使用许多常规荧光计装置。技术人员应该理解用于确定样品中总脂蛋白浓^的仪器可以包括用于进行脂蛋白测定的反应储存器；适合于容纳按照本发明第一方面的方法所需试的剂的容纳装置；可操作地用于激发样品以使它发荧光的激发装置(例如光源，诸如与任何需要的滤光器相结合的处于理想波长处的发光二极管)，和可操作地用于检测由该样品发射的荧光的检测装置(例如光电二极管或光电倍增管一其优选地是黄-红灵敏的)。优选染料的激发和发射波长避免由血样成分引起的自发荧光(其能在10约300nm以下干扰)。通常，、染料的激发波长应该在约350nm-500nm之间，和更优选地在约400nm-470nm之间。本发明第一方面的方法可以包括在高于约400nm的发射波长处，和更优选地,在约440nm处或高于约440nm处(例如440nm、490nm或550nm)观察荧光。在优选的实施方案中，利用K-37，本方法包括在约400nm-500nrn之间，和更优选地，在约420nm-480nm之间，和甚至更优选地，在约440nm-470nm之间的激发波长处激发样品。可以使用特别优选的约450nm的激发波长，尽管在约450-470nm之间任意波长处的激发也是特别优选的。优选地，本方法包括在约500-650nm之间，和更优选地，在约520nm-600nm之间的发射波长处观察荧光。可以使用特别优选的约540nm(或更高)的发射波长，在该波长处可以观察到用于确定总脂蛋白浓度(即HDL,IDL,LDL和VLDL的浓度，还有乳糜微粒，如果存在的话)的最精确读数。在另一个优选实施方案中，利用4-二甲氨基甲基查耳酮,激发波长可以是约420nm，且发射波长是约490nm。在另一个优选实施方案中，利用DPH,激发波长可以是350-400nm(和优选地约400nm)，且发射波长约440nm。由术语"荧光分析"，我们指的是脂蛋白测定产物的荧光测量，通过首先激发样品以致它发荧光，然后观察所述荧光。样品可以是需要知道其中总脂蛋白浓度的食品。优选地，所述样品是可以从待测试的受试者获得的生物样品。所述样品可以包含任何生物流体，例如，血液血浆或血清，或淋巴。特别优选的是所述样品包含血液血清或血浆。可以稀释所述样品，以使样品中总脂蛋白的预期浓度应该在大约0.1-50.0mM之间，更合适地，在大约0.5-20mM之间，和甚至更合适地,在大约1-10mM之间的区域内。技术人员应该理解本测定的目的是测量脂蛋白含量，尽管经验也应该指示这样的技术人员能够预测它们在所选样品中应该预期的浓度范围。因此，根据被测试样品的来源，进行该测定的人ii员可以选择在进行该测定前稀释所述样品(例如用磷酸盐缓冲液或类似的缓冲液)。然而，在本发明的优选实施方案中，可以在不需要进行任何稀释的条件下，将样品(例如，血清)直接引入到所述测定中。这具有优势，即所述测定程序可以保持简单，且可以易于在本领域中使用。本发明人认识到，如果它们能够区分被测试样品中的不同脂蛋白，则利用可以按照本发明第一方面方法产生的脂蛋白分布可以被进一步改进的和更加详细描述。因此，本发明人研究了除上述亲脂性染料以外的探针物质的应用，来查看其是否可以区分不同的脂蛋白分子。他们意外地发现许多在本文中被定义为区别性染料的染料是可用的，它们会与脂蛋白结合，并会表现出依赖于结合的具体脂蛋白而不同的荧光响应。利用这些染料的荧光测量使其可以区分样品中存在的脂蛋白类型。这通过下列比较而进行，将由脂蛋白混合物中一种特殊类型的脂蛋白引起的增强的或减弱的荧光和从校准曲线确定的其他脂蛋白(缺乏所述一种特殊类型的脂蛋白)的预期荧光和由按照本发明第一方面的测定给出的总脂蛋白含量的已知值进行比较。例如，本发明人在下文中描述了他们如何发现了荧光染料，即尼罗红(NileRed)在HDL中比在其它脂蛋白诸如LDL和VLDL中显示显著更高的荧光。因此，本发明人认识到区别性染料可以用于区分样品中脂蛋白的类别或亚类。在已经按照本发明第一方面确定总脂质浓度以后，这是可能的。因此，按照本发明的第二方面,提供了分析样品溶液脂蛋白含量的方法，所述方法包括下列步骤(a)将亲脂性染料加入到样品的第一等分试样中，所述亲脂性染料与所述样品中的脂蛋白结合，并且当其如此结合时在适当激发下发荧光；(b)利用荧光分析确定所述第一等分试样中的总脂蛋白浓度；(c)将区分性染料加入到样品的第二等分试样中，所述区别性染料与所述样品中的一种或多种特异性脂蛋白结合，并且当其如此结合时在适当激发下发荧光；(d)利用荧光分析确定所述第二等分试样中的总脂蛋白浓度；和(e)通过比较步骤(b)和(d)中确定的浓度计算脂蛋白含量。本发明第二方面方法的步骤(c)和(d)可以用于通过特对具体脂蛋白特异的染料荧光响应的改变来确定具体类别或亚类的脂蛋白的浓度。按照本发明第二方面方法的步骤(a)和(b)可以相当于按照本发明第一方面方法的步骤(i)和(ii)。因此，按照本发明第一方面的任何亲脂性染料可以按照本发明的第二方面使用。在本发明的一个实施方案中，优选地，当步骤(a)使用亲脂性染料K-37时，所述区别性染料是除尼罗红以外的染料。在本发明第二方面的优选实施方案中，所述亲脂性染料是K-37。K-37可以以许多浓度用于步骤(a)中。然而，本发明人发现使用处于0.1-1.0mMK-37浓度的染料是有利的。这些浓度对更精确地确定总蛋白质浓度是最佳的。意外地从处于这些浓度的步骤(b)的荧光测量分析获得相当小的信号失真。优选地，加入到样品中的K-37的浓度可以在大约0.2-1.0mM之间，更合适地，在大约0.3-0.9mM之间，和甚至更合适地，在大约0.5-0.8mM之间。优选地，加入到样品中的K-37的浓度在大约0.65-0.75mM之间。0.65mMK-37是特别优选的浓度。因此，在优选实施方案中，在本方法的步骤(a)中将大约0.65mM或0.7mM探针物质,即K-37加入到样品中，从而进行按照本发明第二方面方法的步骤(b)。当使用K-37时，按照第二方面方法的步骤(a)包括在约400nm-500nm之间，和更优选地，在约420nm-480nm之间，和甚至更优选地，在约440nm-470nm之间的激发波长处激发样品。可以使用特别优选的约450nm的激发波长，尽管在约450-470nm之间任意波长处的激发也是特别优选的。优选地，本方法包括在约500-650nm之间，和更优选地，在约520nm-600nm之间的发射波长处观察荧光。可以使用特别优选的约540nm(或更高)的发射波长，在该波长处可以观察到用于确定总脂蛋白浓度(即HDL,IDL,LDL和VLDL,还有乳糜微粒，如果存在的话，的浓度)的最精确读数。本发明人已经确定许多区别性染料可以用在本发明第二方面的步骤(c)中。本发明人意外地发现了存在能够区分脂蛋白的区别性染料。最优选地，染料浓度、激发波长和发射波长对特定染料是最优化的。然而，应该理解最优化的程度，如果需要任何优化的话，应该依赖于为了本发明所述的应用而选择的染料。优选的区别性染料能够选择性结合HDL。优选的选择性结合HDL的染料包含荧光单元，所述荧光单元包括与芳香结构相连并也与烷基相连的氮原子(即(垸基)2N(芳基))。所述烷基可以是甲基或乙基。所述芳基优选地包括至少两个芳香环结构。在一个实施方案中，步骤(c)包括将染料尼罗红、或其功能类似物加入到样品的等分试样中，从而测定样品中的HDL。尼罗红的式是优选地，为了利用尼罗红确定样品中HDL的浓度，由于存在HCL，所以必须由来自尼罗红的过量荧光进行计算。第一，通过亲脂性染料荧光和脂蛋白浓度(如通过步骤(b)确定的)的线性相关性测量总脂蛋白浓度(测量"A")。第二，然后用处于不同浓度的LDL(和/或VLDL，因为荧光对浓度的响应不是必须基本相同的)校准尼罗红荧光，以获得具有斜率"X"和截距"Y"的校准曲线。技术人员应该知道如何制备一定浓度范围的LDL(和/或VLDL),并对每种浓度确定各自的荧光。第三，然后对于一系列HDL浓度和LDL恒定浓度构建了另外的校准曲线，以给定斜率"Z"。第四，已知来自亲脂性染料测量的总脂蛋白浓度"A"和未知样品的过量尼罗红荧光"B",则能够通过下列等式确定未知样品中HDL浓度"C":-14C=(B-(AX-Y))/Z应该理解在本发明第二方面的实践中可以使用预制的或标准校准曲线。因此操作者不需要重复这样的校准(为了清楚的目的将其包括在本文中)。此外，为了产生脂质分布而开发的装置可以具有内部标准和/或具有容许在无使用者干涉的条件下自动计算HDL水平的处理装置。因此，按照本发明第二方面的方法还可以包括利用荧光分析确定样品中HDL的浓度。本方法包括步骤(c)和(d)，其中将区别性染料诸如尼罗红加入到样品的第二等分试样中。所述染料与HDL和其他脂蛋白结合，但是在适当激发下，尼罗红与样品中HDL的浓度成比例地越来越强烈地发荧光。当进行该另外的步骤时，可以产生所述样品甚至更详细的脂蛋白分布，其由总脂蛋白浓度、和HDL浓度组成，这对于临床医生非常有用。本发明人进行了一系列实验，以确定应该加入到样品中的尼罗红的最适浓度，从而提高样品中HDL测定的精确性，并且这需要相当多的创造性劳动。因此，加入到样品中的探针物质尼罗红的浓度可以在大约0.1-lmM之间。有利地，在该尼罗红浓度下，更精确的HDL浓度的浓度测定是可能的。合适地，加入到样品中的尼罗红浓度可以在大约0.1-0.9mM之间，更合适地，在大约0.2-0.8mM之间(例如0.2-0.7mM),和甚至更合适地，在大约0.3-0.7mM之间(例如0.3-0.6mM)。可以使用0.4mM尼罗红，尽管向样品中加入尼罗红直到约0.6mM的最终浓度是特别优选的。优选地，通过在约400nm-650nm之间的激发波长处激发该样品而诱导尼罗红荧光。优选地，激发波长是'400nm-650nm;优选地，在约420nm-620nm之间,更优选地，在约500nm-610nm之间和甚至更优选地，在约590nm-610nm之间。约600nm的激发波长可以与尼罗红联合使用，当与其他脂蛋白相比较时，所述尼罗红给出来自HDL中的尼罗红的荧光响应之间的最大区别性(>5X)。当使用这些激发波长时，优选地使用这样的试剂，该试剂如下所详述地，封闭人血清清蛋白(HSA)上的"脂肪酸和药物结合域"。然后，可以在约540-700nm之间，和更优选地，在570-650nm之间的发射波长处观察和测量由尼罗红产生的荧光。可以使用约620nm的优选发射波长，在该波长处可以观察到确定HDL浓度的最精确读数。本发明人研究了是否可能进一步提供按照本发明第一或第二方面的方法中使用的各个测定的精确性，并且由此将他们的注意力转移到人血清清蛋白(HSA)中，所述人血清清蛋白是血液血清的主要成分，具有大约30-50mg/ml的浓度。已知HSA具有至少两种类型的结合位点，所述结合位点能够结合不同的配体。本文中将第一种类型称为"疏水结构域"，而本文中将第二种类型的结构域称为"药物结合域"。这些结构域是本领域技术人员已知的，且在自然结构生物学(V5第827页(1998))中的一篇论文中对它们彼此进行了区分。该论文将疏水结构域确定为脂肪酸可以与之结合的那个结构域，而药物结合域能够结合许多可能与HSA相关的药物。从他们的实验中，本发明人意外地确定，能够在脂蛋白存在下发荧光的染料也可以与HSA的疏水结合位点/结构域相结合。因此，按照本发明使用的染料可以是HSA的配体。另外，令人惊讶地，本发明人发现所述染料(例如K-37和尼罗红)在与HSA结合时发荧光。因此，虽然本发明人不希望受限于任何假设，本发明人认为，在与HSA结合时的这种另外的荧光，可以导致大量背景信号，该信号在按照本发明第一或第二方面的脂蛋白浓度确定中可以失真并引起显著误差。作为结果，本发明人研究了抑制染料(例如K-37和尼罗红)与HSA结合的作用。具体地，他们试图封闭HSA的疏水结合位点，探针K-37和尼罗红结合在所述位点处并发荧光。实施例4和5中记述了这一工作。虽然本发明人不希望受限于任何假设，令他们惊讶地，他们发现，抑制染料与该疏水结合位点的结合导致在与脂蛋白分子(HDL,LDL,VLDL)结合时，探针物质的荧光成为比如果没有加入配体结合抑制剂更精确的样品中总脂蛋白的浓度的测量。本发明人还发现抑制配体尼罗红与HSA的结合提供HDL测定的精确性。因此，优选地，按照本发明的方法包括将配体结合抑制剂加入到样品中，所述配体结合抑制剂适合于充分抑制染料物质与HSA，优选地与HSA的疏水结合位点的结合。特别优选地，在按照本发明第一方面的步骤(i)16或本发明第二方面的步骤(a)和/或(c)之前或同时，也向样品中加入配体结合抑制剂。所述配体结合抑制剂可以是疏水的。该抑制剂可以是两亲性的。配体结合抑制剂可以包括脂肪酸或其功能衍生物，以及其他疏水分子。可以封闭HSA的疏水结合位点的合适的脂肪酸衍生物的实例，可以包括脂肪酸，它的酯、酰卤、羧酐、或酰胺等。优选的脂肪酸衍生物是脂肪酸酯。脂肪酸或其衍生物可以包括C,-C20脂肪酸或其衍生物。优选地，脂肪酸或其衍生物可以包括C3-C,8脂肪酸或其衍生物，更优选地,Q-C,4脂肪酸或其衍生物，和甚至更优选地,CVC9脂肪酸或其衍生物。特别优选地，所述配体结合抑制剂包括辛酸(Q)或其衍生物，例如,辛酸盐。优选地，作为碱金属辛酸盐，优选地I族碱金属辛酸盐，例如，辛酸钠或辛酸钾，加入配体结合抑制剂。优选地，在进行按照本发明第一或第二方面的测定之前，向样品中加入在约10-400mM之间的配体结合抑制剂，更优选地，加入在约20-200mM之间，和甚至更优选地，在约50-150mM之间的配体结合抑制剂。特别优选地，加入约100mM的抑制剂。因此，在本方法的优选实施方案中，可以在迸行本发明第一方面的步骤(i)或本发明第二方面的步骤(a)禾B/或(c)之前或同时，向样品中加入约100mM辛酸钠。在本发明第一方面的优选实施方案中，在进行本方法步骤(i)中的总脂蛋白浓度荧光测定之前，将配体结合抑制剂，例如，约100mM辛酸钠,与大约0.4mMDPH或0.5mmDPO—起，首先加入到获自样品的等分试样中，。在本发明第二方面的优选实施方案中，在进行本方法(步骤(c))中的HDL浓度荧光测定之前，将配体结合抑制剂，例如，约100mM辛酸钠,与大约0.4mMDPH—起，首先加入样品的第一等分试样中(步骤(a))，并且还将约100mM辛酸钠，与大约0.4mM或更优选地0.6mM尼罗红探针一起，加入到第二等分试样中。在本发明第二方面的另一个优选实施方案中，在进行本方法(步骤(c))中的HDL浓度荧光测定之前，将配体结合抑制剂，例如，约100mM辛酸钠，与大约0.5mMDPO—起，首先加入样品的第一等分试样中(步骤(a))，17并且还将约100mM辛酸钠，与大约0.1mM尼罗红一起，加入到第二等分试样中。本发明人另外发现了尼罗红也与以上提及的HSA上的药物结合域相互作用。该药物结合域的配体包括药物分子诸如甲状腺素、布洛芬、安定、甾类激素和它们的衍生物(药物)、血红素、胆红素、亲脂性前药、华法林(warfarin)、基于香豆素的药物、麻醉药、安定、布洛芬和抗抑郁药(例如硫代黄嘌呤(thioxanthine))。本发明人己经发现了所述试剂可以用于封闭该药物结合域，而且这导致用尼罗红的测定结果的进--步改善。上述药物，或对于该域具有亲合性的任何其它分子，可以用作封闭HSA的药物结合域的试剂。然而最优选的是，将苯甲酸或其衍生物(例如三氯苯甲酸或三碘苯甲酸)用于封闭所述药物结合域。描述于此的全部特征(包括任何附上的权利要求、摘要和附图)，禾口/或如此公开的任何方法或过程的全部步骤，可以以任何组合与任何以上方面相结合，其中至少一些所述特征和/或步骤的相互排斥的组合除外。为了更好理解本发明，并且为了显示本发明实施方案如何可以起作用，经由实例，现在将对附图进行参考，其中-图1是显示如实施例1中涉及的在HDL中处于三个浓度(0.4mM、0.65mM和0.9mM)的K-37相对于总脂质浓度的荧光强度的曲线图2是显示如实施例1中涉及的在LDL中处于三个浓度(0.4mM、0.65mM和0.9mM)的K-37相对于总脂质浓度的荧光强度的曲线图3是显示如实施例1中涉及的在VLDL中处于三个浓度(0.4mM、0.65mM和0.9mM)的K-37相对于总脂质浓度的荧光强度的曲线图图4是显示如实施例1中涉及的在HDL、LDL、和VLDL中的0.4mMK-37相对于总脂质浓度的荧光强度的曲线图5是显示如实施例1中涉及的在HDL、LDL、和VLDL中的0.65mMK-37相对于总脂质浓度的荧光强度曲线图6是显示如实施例1中涉及的在HDL、LDL、和VLDL中的0.9mMK-37相对于总脂质浓度的荧光强度曲线图7是显示如实施例1中涉及的在一系列HDL、LDL、和VLDL混合物中的0.65mMK-37相对于总脂质浓度的荧光强度曲线18图8是显示0.65mM的K-37相对于实施例2的6种样品溶液的荧光强度曲线图9提供一定浓度范围的4-二甲氨基甲基査耳酮相对于实施例2的6种样品溶液的荧光强度曲线图10提供一定浓度范围的二苯己三烯(DPH)相对于实施例2的6种样品溶液的荧光强度曲线图11提供图示实施例2中所述的0.5mMDPH相对于一定浓度范围的混合脂蛋白的荧光强度曲线图(a);和实施例2中所述的0.1mM、l.OmM和4.0mMDPH相对于一定浓度范围的混合脂蛋白的荧光强度曲线图(b);图12提供图示实施例2中所述的0.5mMDPO相对于一定浓度范围的混合脂蛋白的荧光强度曲线图(a);和实施例2中所述的O.lmM和l.OmMDPO相对于一定浓度范围的混合脂蛋白的荧光强度曲线图(b);图13是图示实施例2中所述的香豆素30相对于一定浓度范围的混合脂蛋白的荧光强度曲线图14是图示0.4mM尼罗红相对于实施例3的6种样品溶液的荧光强度曲线图15是图示尼罗红荧光相对于实施例3中涉及的HDL浓度的曲线图；图16是LDL浓度相对于实施例5中涉及的荧光强度的校准曲线；图17是过量荧光相对于实施例5中涉及的HDL浓度的校准曲线；图18是显示相对于实施例5中涉及的HDL浓度的误差的曲线图；图19是图示尼罗红荧光(ex460nnm和em620nm)相对于实施例5涉及的HDL浓度的曲线图20是图示尼罗红荧光(ex600nnm和em620nm)相对于实施例5涉及的HDL浓度的曲线图；禾口图21是在激发波长460nm和600nm处，存在HDL(+辛酸盐)或HSA(+辛酸盐)条件下的尼罗红荧光光谱分析曲线图。实施例1本发明人进行了一系列实验，以研究荧光染料是否可以按照本发明第一方面用于确定总脂蛋白的浓度。19本发明人注意到WO01/53829A1公开了已知浓度为约O.lmM的K-37对脂蛋白类别具有不同的荧光强度响应。这是因为染料-脂蛋白复合物具有不同的荧光寿命，因此由不同的量子产率。本发明人决定研究是否可能存在任何这样的测定条件，即其应该意味着可能使用K-37通过简单荧光测定检测样品中总脂蛋白的浓度(其等于总甘油三酯加上胆固醇加上胆固醇酯，因为假设全部脂质与脂蛋白结合)。1.1方法将溶于二甲基甲酰胺(DMF)中的染料K-37以一定范围的不同浓度加入到溶解在磷酸盐缓冲液中的一定浓度系列的HDL、LDL、禾PVLDL中。本实验的目的是在真实血浆或血清样品中会遇到的脂蛋白浓度范围内，获得各种颗粒类型(HDL、LDL、禾nVLDL)的荧光和脂蛋白浓度之间的线性和相等关系。在Perkin-ElmerLS50荧光计中，在450nm激发波长处，和540nm发射波长处测量荧光强度。1.2结果图1-3图解了在磷酸盐缓冲液中的HDL、LDL、和VLDL中处于三个浓度，即0.4mM、0.65mM和0.9mM的K-37的荧光强度对比总脂蛋白浓度。显示关于每个系列的线性拟合(0.4mM在顶部、0.65mM在中央禾口0.9mM在下面)的Fe值。图4-6中也绘制了相同的数据，且通过K-37的浓度将数据分组。来自这些实验的结果是-1)对于全部三种脂蛋白颗粒类型(HDL、LDL、禾QVLDL)，R显示K-37浓度为0.65mM时，总脂蛋白浓度和荧光强度之间存在良好的线性关系。对在LDL和VLDL中的0.9mMK-37也观察到了良好的线性关系，但是在HDL中的0.9mMK-37的线性度较差。对于全部脂蛋白使用0.4mMK-37的线性度较差。值得注意的是，虽然它在线性度较差的浓度仍起作用，但是它的准确性较低。然而，可以利用多项式拟合处理非线性度。2)认为影响线性度有两个因素。在低染料浓度，在高总脂蛋白浓度下存在响应的平化。虽然本发明人不希望受限于任何假设，但是他们相信20这是因为没有存在可用于充分占据所述脂蛋白颗粒的足够的染料而发生的。在高染料浓度，随着低的总脂蛋白浓度存在一个平面响应。这是当所述染料非常靠近地充满在所述颗粒中时由荧光的自猝灭所引起的。3)当在磷酸盐缓冲液中测量时，0.65mM的K-37浓度对于跨越适当范围的全部脂蛋白颗粒类型给出了线性的和非常类似的荧光响应。因此，然后将0.65mM的K-37加入到一系列HDL/LDL/VLDL混合物中，如上所述测量荧光强度。所述数据图解在图7中。如图可以看出，总脂蛋白浓度与荧光强度是高度相关的(R2^0.9983)，证实K-37的这一浓度(0.65mM)适于总脂蛋白浓度的高度精确性测量。当将这个应用到来自患者的生物样品时，本发明人在高脂质浓度观察到一些弯曲。因而，选择0.7mM浓度的K-37作为血清或血浆中使用的最理想的K-37浓度。因此，选择该浓度作为本发明所述方法所用的最适浓度。实施例2实施例1中描述的数据使得本发明人认识到具有与K-37的性质类似的性质的染料可以用在按照本发明第一方面的测定中。实施例2中描述了进一步的实验，其举例说明了所有类别的亲脂性染料(如本发明第一方面中所定义的)可以用在样品总脂蛋白含量的荧光测定中。2.1方法实施例1中使用的方法适合于测试许多不同的染料。通过将一定浓度范围的染料(处于最终浓度0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mM)应用到6种含有如表1中所示的不同脂蛋白类别比例(全部具有6.0mmole/L的最终总脂蛋白浓度)的溶液每一种中，测试染料。然后如前所示测量溶液的荧光强度。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>通过针对给定的染料浓度，计算染料荧光强度相对于6种不同脂蛋白比的溶液的变化系数(CV)，评估按照本发明第一方面认为有效的染料。将CV定义为6种荧光强度测量的标准偏差除以测量的平均值并乘以100而给出的百分比数值。因此采用低值(<10%)表示染料不区分溶液中的不同类别脂蛋白，且因此按照本发明第一方面是有效的。具有3%或更低值的染料代表了按照本发明第一方面使用的最优选染料。2.2结果本发明人确定了许多染料不适合于按照本发明第一方面的方法使用。许多染料不能与脂蛋白结合并发荧光。然而，在会发荧光的那些中，许多应该(a)不发荧光，以使在样品1-6之间存在一致的读数，且具有〉10%的CV值；或(b)如果导致<10%的CV值，则需要在会受到来自生物样品诸如血清或血浆的荧光削弱的波长处激发或发射。因此，本发明人不承认许多染料适合于按照本发明第一方面使用。例如，利用染料芘进行实验。该染料能够结合至少一些脂蛋白，且在与其结合时发荧光(数据未显示)。然而，它在320nm处具有最大激发，且因此不适合于与生物样品一起使用(如果在该波长处激发样品，则生物样品中的许多分子，且不止是脂蛋白，也将发荧光)。然而，在测试的染料中，本发明人意外地发现亲脂性染料，并且具体地是具有两个酚基团的亲脂性染料在其最优化浓度下与K-37—样良好地测量样品中脂蛋白总含量。按照本发明第一方面的染料包括2.2.1基于査耳酮的染料0.65mMK-37引起2.78%的CV(见图8)。这说明浓度为0.65mM的染料不区分脂蛋白颗粒，并证明它在按照本发明第一方面的有效性。图9图解了对于4-二甲氨基甲基查耳酮(DMAMC)的实验发现。该染料具有充分低于10%的CV。该染料的最大激发是420nm，且最大发射是490nm。这些波长适合于血液血浆测定，且该染料代表按照本发明第一方面使用的优选亲脂性染料。2.2.2Ph-[C-C=C]n-C-Ph染料及其衍生物图10图解了DPH的实验结果。它不区分脂蛋白类别，并在0.4mM染料的浓度下给出最佳CV(1.7%)。这说明DPH在按照本发明的第一方面是有效的。DPH具有在350nm处的最大激发，和在440nm处的最大发射。然而，本发明人发现它能够在约400nm处激发。这避免了许多在约359nm(和更低)处与血液血浆有关的污染性荧光背景，并使得该染料是按照本发明第一方面有效的。DPH代表按照本发明第一方面使用的优选染料。技术人员应该理解，DPH是许多亲脂性染料中存在的基础荧光基团。可以对DPH分子进行不同的环取代，从而调节该染料的荧光性质。所述染料也可以按照本发明第一方面用于测量总脂蛋白。图11(a)图解0.5mMDPH相对于一定浓度范围的混合脂蛋白的荧光强度；和(b)图解O.ImM、l.OmM和4.0mMDPH相对于一定浓度范围的混合脂蛋白的荧光强度。这些曲线图还图解了荧光和脂蛋白浓度之间的线性关系，并由此证明了DPH对于按照本发明第一方面使用的适宜性。图12(a)和(b)显示对按照本发明第一方面使用的另一种优选染料DPO的类似数据，并且还证明了DPO对于按照本发明第一方面使用的适宜性。2.2.3香豆素染料图13是图示香豆素30相对于的一定浓度范围的混合脂蛋白的荧光强度曲线图。该曲线解了荧光和脂蛋白浓度之间的线性关系，并由此证明了香豆素30对于按照本发明第一方面使用的适宜性。2.3结论总而言之，这些结果证明了亲脂性染料，和特别是上述双酚染料，是按照本发明第一方面测定样品总脂蛋白含量的有效染料。实施例3为了产生实施例2的数据而进行的一系列实验也引起本发明人认识到一些染料能够区分脂蛋白类别，并且因此可以用在按照本发明第二方面方法的步骤(c)中。3.1方法重复了实施例2中使用的方法。3.2结果尼罗红当在460nm处激发，并且在620nm处监测发射时，HDL诱导尼罗红的荧光增强。在该激发处，HDL中的荧光增强是VLDL和LDL二者的两倍。然而，前3种样品的CV达到2.78。/。，且样品4-6为1.0%，这说明该染料不区分LDL和VLDL。对于HDL，当在600nm处激发尼罗红时，荧光增强为〉5倍更强。图14图解0.4mM尼罗红如何区分脂蛋白类别。图15显示尼罗红在PBS中几乎是非荧光性的，在血浆中由于蛋白质的结合仅是中度荧光的，且当加入6mmol/L脂蛋白时荧光强度进一步增加。当在恒定脂蛋白浓度下，随着HDL含量的增加，存在尼罗红荧光强度的强烈增加，这证明尼罗红区分HDL。本发明人相信该荧光增强由染料与HDL颗粒的蛋白质脂质界面的结合产生。HDL是超过50。/。蛋白质，主要是ApoA，其与VLDL、IDL和LDL相当不同地缠绕在该颗粒上，其中VLDL、IDL和LDL拥有表面结合的蛋白质ApoB的拷贝，形成在重量上远不及的颗粒，并提供较小的蛋白质/脂质界面。对这些初步的实验进行了延伸(见实施例5)，从而证实尼罗红是有效的区别性染料，其可以用在按照本发明第二方面的方法中。实施例4本发明人进行了进一步的研究，从而最优化本发明所述的方法。为了该目的，他们认识到HSA拥有疏水结合位点，染料结合在所述疏水结合位点中并发荧光。在与HSA结合时的这种另外的荧光，能够引起大量背景信号，其失真并由此在脂蛋白分子，即HDL、LDL和VLDL的测量中导致显著误差。因此，他们决定研究他们是否能够利用配体结合抑制剂，诸如辛酸钠封闭HSA中的疏水结合位点，从而查看是否能够最小化所述另外的荧光。设想以这种方式抑制染料和HSA的结合将提高利用染料荧光测量获得的结果的精确性。为了例证的目的，利用K-37进行了实验。然而，技术人员应该理解本实施例中出现的数据应该可适用于本发明所述的任何亲脂性染料和区别性染料。4.1方法在50mg/mlHSA的存在或不存在下，将染料K37以0.5mM的浓度加入到总脂质浓度为5mM的LDL中。在有和没有加入0.1M辛酸钠的情况下进行测量，所述辛酸钠作为配体结合抑制剂。4.2结果对于全部样品测量荧光强度并总结在表2中表2:样品荧光强度K-37力卩5mMLDL213500K-37力B50mg/mlHSA79300K-37力Q5mMLDL+辛酸盐209700K-37加50mg/mlHSA+辛酸盐360025结果显示K-37在单独LDL中的荧光强度是213500单位。当辛酸盐加入到LDL中时K-37的荧光强度是209700单位(即与无辛酸盐的情况大致相同)，这表明辛酸盐的存在未有助于独自结合到LDL上的K-37的荧光强度。结合到HSA上的K-37的荧光强度是79300单位，然而在HSA和辛酸盐存在下，K-37的荧光强度是3600。这说明HSA有助于K-37荧光并且因此是干扰信号。辛酸盐的加入显著减少所述干扰，并从而消除HSA的破坏作用。因此，所述结果显示在辛酸盐存在下对K-37与HSA的荧光强度的显著抑制，但是对于LDL中的K37荧光的影响很小。这显示辛酸盐在封闭HSA上的K-37结合位点方面是显著成功的，使K-37荧光成为总脂蛋白浓度的真实测量。4.3结论因此，本发明人相信可以将结合HSA疏水性结合位点的配体结合抑制剂诸如辛酸盐在测量亲脂性染料荧光之前加入到血样中，以提高总脂蛋白浓度的准确性。另外，本发明人认为该技术还可以用于封闭其它配体对于HSA疏水性结合位点的结合，并且用于代替可能已经结合于其上的配体，并且所述配体具有比辛酸盐更低的对HSA的亲合性。实施例5本发明人延伸了实施例3中所述的实验，以证实区别性染料可以用于鉴别血样中存在的不同类型脂蛋白。为了例证的目的，本发明人选择使用尼罗红作为可以按照本发明第二方面使用的区别性染料的实例。5.1方法测量的原理是探针尼罗红在HDL中比在LDL和VLDL中更有荧光性，后者具有非常类似但是随浓度不同的荧光响应。所述测量比总脂蛋白的测量(本发明第一方面所述)更复杂，因为必须对来自HDL中尼罗红的过量荧光进行计算，而不仅仅是全部脂蛋白的总荧光。程序如下-265丄1校准将溶解在二甲基甲酰胺中的0.5mM尼罗红与处于通常在4和10mM之间变化的总脂蛋白浓度的LDL混合(典型地，将50微升染料与50微升脂蛋白和lml磷酸盐缓冲液混合)。将样品放在分光荧光计中并测量荧光强度(激发波长450nm，发射波长600nm)。将荧光强度相对于LDL总脂质浓度绘图，给出了具有斜率"X"和截距"Y"的校准直线，如图16中所示。然后对于LDL和HDL的混合物重复所述程序。HDL以0-3.0mM之间的浓度加入，加入LDL以将全部样品的总脂蛋白浓度保持在6mM(但是3-12mM将是界限)。然后测量这些样品的荧光强度。然后对由于HDL存在而产生的过量荧光进行绘图，给出了具有斜率"Z"的校准直线，如图17中图解。5丄2未知物的测量在研究下，将溶解在二甲基甲酰胺中的0.5mM尼罗红与样品混合。在与上述校准相同的条件下，将样品放入荧光计中并测量荧光强度。5丄3HDL浓度的计算HDL的计算需要知道总脂蛋白浓度"A"，其可以例如但非排他地从按照本发明第一方面的方法中使用的亲脂性染料的荧光强度测量。对于特定的样品，加果所述样品中不包含HDL而预期的荧光强度是从显示在图17中的校准线获得的。测量的荧光强度减去该计算的荧光强度是由于样品中存在的HDL而产生的过量荧光。然后可以利用图17中所示的校正线和下列等式，获得未知样品中的HDL的浓度"C":-C=(B-(AX-Y))/Z制备了一定浓度范围的HDL/LDL/VLDL混合物，意欲包括在实际临27床样品中将预期的浓度范围。将上面论述的校准数据用于计算来自所述混合物的HDL浓度。图18图解了真实HDL浓度和从尼罗红荧光确定的HDL浓度之间的误差，显示最大误差仅为大约0.15mM。本发明人还推敲出用于血清样品的尼罗红浓度是0.4mM.作为这些数据的结果，本发明人已经显示可以区分样品中存在的脂蛋白类型，并且可以利用染料尼罗红确定HDL浓度。5丄4与HSA封闭剂联合使用尼罗红在实施例4中描述的发现之后，关注于加入辛酸盐以封闭HSA的疏水性结合位点，本发明人然后观察到，尼罗红也与HSA结合并且发荧光。当结合到HSA上时，尼罗红的这一另外荧光也引起大量背景信号，其失真并从而引起HDL测量中的显著误差。他们因此决定用如用于K-37封闭的相同配体结合抑制剂即辛酸钠封闭HSA中的疏水性结合位点。用尼罗红和HSA进行的实验基于实施例4中所论述的那些，并且全部利用0.5mM尼罗红。表3:样品荧光强度尼罗红加5mMLDL187.532尼罗红加50mg/mlHSA58.905尼罗红加5mMLDL+50mM辛酸盐183.786尼罗红加50mg/mlHSA+50mM辛酸盐9.118PBS+50mM辛酸盐7.382表2中表示的结果显示，尼罗红在在单独的LDL中的荧光强度是187.532单位。当辛酸盐加入到LDL中时尼罗红的荧光强度是183.786单位(即与无辛酸盐的情况大致相同)，这表明辛酸盐的存在未有助于独自结合到LDL上的染料的荧光强度。结合到HSA上的尼罗红的荧光强度是58.905单位，而在HSA和辛酸盐存在下的尼罗红荧光强度是9.118。这说明HSA有助于尼罗红荧光并且因此是干扰信号。辛酸盐的加入显著减少28所述干扰并从而消除HSA的破坏作用。因此，所述结果显示在辛酸盐存在下对尼罗红与HSA荧光强度的显著抑制，但是对于LDL中的尼罗红荧光的影响很小。这显示，辛酸盐在封闭HSA上的尼罗红结合位点方面是显著成功的，使尼罗红荧光成为脂蛋白浓度的真实测量。因此，本发明人相信可以在测量尼罗红荧光之前，将适合于HSA疏水性结合位点的配体结合抑制剂诸如辛酸盐加入到血样中，以提高脂蛋白(:HDL)浓度的准确性。在该工作之后，本发明人发现0.4mM尼罗红和50mM或更优选约100mM的辛酸盐对于血清样品的分析是最佳的。5丄5进一步最优化利用尼罗红的测定在人血清样品上进行进一步测试以研究根据本发明的方法用于诱导指示HDL水平的荧光的最佳激发波长。本发明人测试了许多波长并且确定，当利用尼罗红时，600nm的激发波长和620nm的发射波长提供最佳结果(参见图19)。令本发明人意外的是，该激发波长是最佳的，因为它达到光谱的非常长的波长的边缘。对于某些样品，本发明人利用460nm激发波长和620nm发射波长观察到更多噪声(noisier)的图(参见图20)。本发明人相信，当在600nm激发时，尼罗红在HDL中的荧光比在VLDL和LDL中的多约5倍，与之相反，在460nm激发时，在那里它仅是约2倍多的荧光。当将其从LDL加VLDL的标准曲线减去时，为噪声提供了更好的信号。本发明人发现尼罗红的最佳浓度是约0.6mM。虽然本发明人不希望受限于任何假设，但是他们相信在460nm激发时在血清样品中观察到的"噪声"是信噪比的结果。本发明人注意到，尼罗红与HSA结合，并且特别是在低脂质浓度。他们因此在HDL(+辛酸盐)或HSA(+辛酸盐)存在下在460nm和600nm的两种激发波长进行尼罗红荧光的光谱分析(参见图21)。这些实验产生出乎意料的光谱行为，本发明人相信这可以由下列事实解释，即尼罗红是在刚性的但是极性的环境(HSA上结合位点)中，并且尼罗红显示扭曲的分子内电荷转移(TICT)(光化学和93(1996)57-64)，所述TICT使激发和发射位移至更长的波长。在这种激发状态中的分子具有不同的偶极矩，并且因此表现为如同是不同的种类。在600nm激发时，由于与其它脂蛋白相比较，在HDL中尼罗红之间信号中的较大差异而产生的更好的信噪比更多地补偿TICT状态的激发，因为TICT荧光通过620nm发射波长设置而被排除。换言之，虽然在600nm更佳地激发HSA/尼罗红，但是它的荧光受到仪器拒绝。这引导本发明人认识到，通过利用另外封闭剂可以进一步改善HDL/尼罗红测定。他们尝试封闭HSA药物结合域的试剂。令他们意外的是，他们发现试剂诸如苯甲酸以及它的三氯和三碘衍生物全部在大约5mM时对于从HSA置换尼罗红起作用，而不影响脂蛋白荧光。苯甲酸具有猝灭溶液中的尼罗红残留荧光中的约20%的附加优点。实施例6实施例1和2说明亲脂性染料的荧光测量如何可以用于确定样品中总脂蛋白浓度，而实施例3和5说明区别性染料的荧光测量如何可以用于确定样品中的HDL浓度。考虑这些结果，本发明人认识到可以产生单一平行方法用于分析患者血样的脂质组成以便产生该患者的脂蛋白分布。该方法代表本发明的第二方面，且由两个测定组成，这两个测定都可以在非常类似的条件下进行，并且由此，可以非常迅速地产生结果。以下提供了按照本发明第二方面的优选方法。方法最初从患者取血样，然后利用充分建立的常规方法离心，以便分离血清。然后将血清分成两个1ml的等分试样(a、和b)，将每个进行生物化学分析以确定脂质成分的浓度。将等分试样(a)用于确定总脂蛋白浓度；并且将等分试样(b)用于确定HDL浓度，如下所述。等分试样(a)-将HSA配体结合抑制剂，即辛酸钠加入到1ml血清中至浓度为100mM，如上面实施例4中所描述。然后将溶解在二甲基甲酰30胺(DMF)中的染料二苯己三烯(DPH)在搅拌下缓慢加入到样品中，至最终浓度为0.4mM。然后在约400nm激发样品以便引起该染料发荧光。在约440nm的发射波长处测量所述荧光，并且然后由此值可以确定样品中总脂蛋白(HDL、LDL、和VLDL)的浓度。等分试样(b)-将HSA配体结合抑制剂，即辛酸钠加入到1ml血清中至浓度为50mM或100mM，如上面实施例4中所描述。此外，可以将苯甲酸加入到所述血清中至浓度为5mM。然后在搅拌之下缓慢将探针尼罗红加入到样品中，至最终浓度为0.4mM。然后在600nm激发样品以便引起所述探针发荧光。在620nm的发射波长处测量所述荧光，并且然后由此值可以确定样品中HDL浓度，如上面实施例5中所描述。权利要求1.确定样品中总脂蛋白浓度的方法，所述方法包括下列步骤(i)将亲脂性染料加入到所述样品的等分试样中，所述亲脂性染料与所述样品中的脂蛋白结合，并且当其如此结合时在适当激发下发荧光；和(ii)利用荧光分析确定所述样品中总脂蛋白浓度。2.按照权利要求l的方法，其中所述亲脂性染料具有两个酚基团，所述酚基团可以是取代的或未取代的。3.按照权利要求2的方法，其中所述亲脂性染料是查耳酮染料。4.按照权利要求3的方法，其中所述查耳酮染料是4-甲氨基甲基査耳酮或K-37。5.按照权利要求2的方法，其中所述亲脂性染料是包括荧光单元Ph-[C-OC]n-C-Ph的染料。6.按照权利要求5的方法，其中所述染料是二苯己三烯或二苯辛四烯。7.按照权利要求1或2的方法，其中所述染料是香豆素染料。8.按照权利要求7的方法，其中所述染料是香豆素30。9.按照权利要求1-8中任一项的方法，其中所述方法包括在确定脂蛋白浓度前，将配体结合抑制剂加入到所述等分试样中，所述配体结合抑制剂充分抑制所述染料与人血清清蛋白上疏水结合域的结合。10.按照权利要求9的方法，其中所述配体结合抑制剂包括脂肪酸或其功能衍生物。11.按照权利要求10的方法，其中所述配体结合抑制剂包括辛酸(C8)或其衍生物。12.分析样品溶液中脂蛋白含量的方法，所述方法包括下列步骤(a)将亲脂性染料加入到所述样品的第一等分试样中，所述亲脂性染料与所述样品中的脂蛋白结合，并且当其如此结合时在适当激发下发荧光；(b)利用荧光分析确定所述第一等分试样中的总脂蛋白浓度-,(c)将区分性染料加入到所述样品的第二等分试样中，所述区别性染料与所述样品中的一种或多种特异性脂蛋白结合，并且当其如此结合时在适当激发下发荧光；(d)利用荧光分析确定所述第二等分试样中的脂蛋白浓度；和(e)通过比较步骤(b)和(d)中确定的浓度计算脂蛋白含量。13.按照权利要求12的方法，其中所述特异性脂蛋白是HDL。14.按照权利要求13的方法，其中所述区别性染料是尼罗红。15.按照权利要求14的方法，其中添加到所述样品中的尼罗红浓度是大约0.1-0.9mM之间。16.按照权利要求12-15中任一项的方法，其中如权利要求1-11中任一项所定义地进行步骤(a)和(b)。17.按照权利要求12-16中任一项的方法，其中将权利要求9-11中任一项所述的配体结合抑制剂加入到所述第二等分试样中。18.按照以上权利要求中任一项的方法，其中所述样品是生物流体。19.按照以上权利要求中任一项的方法，其中所述样品包括血液血浆或血清、或淋巴。全文摘要本发明涉及确定样品中总脂蛋白浓度的方法。该方法包括下列步骤(i)将亲脂性染料加入到所述样品的等分试样中，所述亲脂性染料与所述样品中的脂蛋白结合，并且当其如此结合时在适当激发下发荧光；和(ii)利用荧光分析确定所述样品中总脂蛋白浓度。本发明还公开了利用区分不同类型脂蛋白的染料分析样品溶液中脂蛋白含量的方法。文档编号G01N33/92GK101467049SQ200780022087公开日2009年6月24日申请日期2007年6月12日优先权日2006年6月15日发明者加雷斯·罗伊斯顿·琼斯,戴维·托马斯·克拉克申请人:L3技术有限公司