专利名称：地塞米松elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测动物源性食品中地塞米松的试剂盒。
背景技术：
地塞米松(dexamethasone,Dex)是糖皮质激素可的松类的衍生物,也叫氟美松,也是医学临床运用最广泛的强效皮质激素。可的松类激素通常用来治疗过敏性和严重感染性疾病，具抗炎和抗过敏的作用。这类激素尚有剌激食欲，增加肝糖原合成，升高血糖等作用。但这种激素在食物中残留，对人有潜在的危害，故欧盟等国都禁止地塞米松，氟美松等作为牲畜的促生长剂，在畜牧业中使用。欧盟在动物源性食品最高残留限量规定地塞米松的最高残留限量为牛、猪、马科 的肌肉 O. 75μ g/kg，肝 2-(^8/1^，肾0.75 48/1^，牛奶0.3 48/1^。我国农业部 235 号公告规定地塞米松的最高残留限量为牛/猪/马的肌肉O. 75μ g/kg，肝2. 0μ g/kg，肾
O.75 μ g/kg,牛奶 0. 3 μ g/kg。目前关于糖皮质激素类常用的检测方法有薄层色谱、免疫分析法、液相色谱、气相色谱、气-质、液-质等技术。GB/T 20741-2006畜禽肉中地塞米松残留量的测定液相色谱-串联质谱法，本标准规定了牛肉、猪肉、羊肉和鸡肉中地塞米松残留量的液相色谱-串联质谱测定方法，方法检出限为O. 2 μ g/kg。GB/T 22978-2008牛奶和奶粉中地塞米松残留量的测定液相色谱-串联质谱法，本标准中规定了牛奶和奶粉中地塞米松残留量的液相色谱-串联质谱测定方法，方法检出限为牛奶O. 2 μ g/kg,奶粉I. O μ g/kg。农业部958号公告-6-2007猪可食性组织中地塞米松残留检测方法高效液相色谱法，本标准规定了猪肌肉和肝脏中地塞米松残留检测的制样和高效液相色谱测定方法，本方法在猪肌肉组织中检测限为O. 75 48/1^，定量限为14 8/1^，在猪肝脏组织中检测限为14 8/1^，定量限为2. O μ g/kg。回收率为60% 120%。SN/T 1970-2007进出口动物源性食品中地塞米松、倍他米松、氟羟泼尼松龙和双氟美松残留量测定方法酶联免疫法，本标准规定了动物源性食品中地塞米松、倍他米松、氟羟泼尼松龙和双氟美松残留量的酶联免疫测定方法，测定低限为地塞米松、倍他米松、氟轻泼尼松龙O. 3 μ g/kg,双氟美松I. 5 μ g/kg。本发明的地塞米松酶联免疫试剂盒具有灵敏度高(O. 05μ g/kg)、操作简单、成本低，可满足食品中地塞米松残留的快速监测。
实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的地塞米松残留检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中地塞米松残留量的测定，减少了检测样本所需要的时间。本实用新型的技术方案是一种检测动物源性食品中地塞米松残留量的酶联免疫试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于采用96孔聚苯乙烯酶标板作为固相载体，酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，在试剂盒酶标板微孔条上预包被地塞米松偶联抗原制成检测板，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，以塑料硬膜为盖板膜，将6瓶2ml梯度浓度的标准品溶液、2ml高浓度标准品溶液、12ml酶标二抗、7ml地塞米松抗体工作液、7ml底物液A液、7ml底物液B液、7ml终止液、40ml浓缩洗涤液、50ml浓缩复溶液试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质检报告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的地塞米松将和酶标板微孔条上预包被的地塞米松偶联抗原竞争抗地塞米松抗体，力口入酶标二抗后，用底物液显色，样本吸光度值与样本中所含地塞米松的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中地塞米松含量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒检测地塞米松残留，具有很高的灵敏度鸡肉样本的最低检测限为O. I μ g/kg,回收率为80%±15% ;牛奶样本的最低检测限为O. 3μ g/kg，回收率为80%± 15%。相对于其他地塞米松检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、均质器、·氮气吹干装置、离心机、振荡机和微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于动物源性食品中地塞米松残留量的检测。
图I为本实用新型酶标板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本实用新型酶标板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本实用新型酶标板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实用新型固定泡沫模具俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具侧视图。参见附图酶标反应微孔条(2)预包被地塞米松偶联抗原(3)固定于酶标板的外框支撑架(I)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装50ml浓缩复溶液；白色帽的白色塑料试剂瓶(6 )用于封装7ml底物液A液，红色帽的黑色塑料试剂瓶(6)用于封装7ml底物液B液，黄色帽的白色塑料试剂瓶(6)用于封装7ml终止液，红色帽的黄色塑料试剂瓶(7)用于封装12ml酶标二抗，绿色帽的黄色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml地塞米松抗体工作液，黑色帽的棕色玻璃瓶(8)用于封装2ml/瓶的标准品溶液及2ml高浓度标准品溶液；盒体为(9)是硬纸盒；泡沫塑料模具(10)有15个下凹瓶位，放置位置依次为40ml浓缩洗涤液瓶位(18)，50ml浓缩复溶液瓶位(11 )，7ml底物液A液瓶位
(14)，7ml底物液B液瓶位(13)，7ml终止液瓶位(12)，7ml地塞米松抗体工作液瓶位(16)，12ml酶标二抗瓶位(15)，6种2ml/瓶各种浓度的标准品溶液及I瓶2ml高浓度标准品溶液瓶位(17)。
具体实施方式
一、样本的前处理 I.配液配液I: 2mol/L氢氧化钠称取8g氢氧化钠固体加入去离子水定容到100ml。配液2:复溶工作液用去离子水将2 X浓缩复溶液按I: I体积比进行稀释(I份2 X浓缩复溶液+1份去离子水)用于提取样本的复溶，复溶工作液在4°C环境可保存一个月。配液3 :洗涤工作液用去离子水将20 X浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释(或按需量稀释)(I份20 X浓缩洗涤液+19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。2.样本处理步骤( I)鸡肉样本前处理方法用均质器均质组织样本；称取2. 0g±0. 05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，力口入8ml乙酸乙酯,用振荡器振荡5min ;室温放置20min,3000g以上,室温离心5min ;取4ml上清液到50ml聚苯乙烯离心管中，加入2ml 2mol/L氢氧化钠溶液，振荡IOmin (此步骤较关键)，3000g以上，室温离心5min ;取上层Iml有机相至IOml玻璃试管中；于50_60°C水浴流下氮气吹干。加入O. 5ml复溶工作液，润动2 3min,取100 μ I用于分析。(2)牛奶前处理方法取200 μ I牛奶样本加400 μ I复溶液工作液充分混匀。取100 μ I用于分析。二、使用试剂盒的操作步骤I、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20_25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品工作液/样本和抗体工作液加入标准品/样本100 μ I到对应的微孔中，随即加入抗体工作液50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应 30mino6、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μ I/孔，充分洗涤4 一 5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。7、加酶标二抗加入酶标二抗100 μ I孔，再用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应30min。取出后重复步骤六。8、显色加入底物液A液50μ I/孔，再加底物液B液50μ I/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min。9、测定加入终止液50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。三、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第I种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与地塞米松含量成负相关。I、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(μ g/L)。假设样本I的吸光度值为O. 203，样本2的吸光度值为O. 814，标准液吸光度值分别是0μ g/L为
I.953 ；0. 05 μ g/L % I. 614 ；0. 15 μ g/L 为 I. 235 ；0. 45 μ g/L 为 0. 721 ; I. 35 μ g/L 为 0. 339 ；4. 05 μ g/L为O. 129。则样本I的浓度范围是I. 35 μ g/L-4. 05 μ g/L,再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中地塞米松残留的浓度范围；样本2的浓度范围是O. 15μ g/L-0. 45 μ g/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中地塞米松残留的浓度范围。 2、定量分析(I)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸光度值，再乘以100%，即
B
V丨分吸光度仉(%) = - XIoo%
B0B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0-0μδ/ 标准溶液的平均吸光度值(2)标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以地塞米松标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中地塞米松实际含量。四、测定前的注意事项I、室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温(20-25°C )会导致所有标准的OD值偏低。2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、每加一种试剂前需要将其摇匀。4、反应终止液为2mol/L硫酸,避免接触皮肤。5、不要使用过了有效期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试齐U，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。6、储存条件保存试剂盒于2-8 °C，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7、试剂变质的迹象发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。O标准的吸光度(450/630nm)值小于O. 5 (A450nm<0. 5 )时,表不试剂可能变质。8、在加入底物液A和底物液B后，一般显色15min即可。若颜色较浅,可延长反应时间至20min,但不得超过25min。反之,则减短反应时间。9、该试剂盒最佳反应温度25°C，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。10、此药物与塑料瓶有一定的吸附作用，故用玻璃瓶保存。
权利要求1.一种地塞米松ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被地塞米松偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别6瓶标准品溶液、I瓶高浓度标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液和高浓度标准品溶液均用黑色帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗用红色帽的黄色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的黄色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被地塞米松偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶，2ml/瓶，浓度分别为 O μ g/L，O. 05 μ g/L，0. 15 μ g/L，0. 45 μ g/L，I. 35 μ g/L ,4. 05 μ g/L ；高浓度标准品溶液I瓶，2ml ;酶标二抗I瓶，12ml ;抗体工作液I瓶，7ml ;底物液A液I瓶，7ml ；底物液B液I瓶，7ml ;终止液I瓶，7ml ;浓缩洗涤液I瓶，40ml ;浓缩复溶液I瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种检测动物源性食品中地塞米松含量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗、地塞米松抗体工作液、6个浓度的标准品溶液、高浓度标准品、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的地塞米松将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗地塞米松抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中地塞米松的含量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在动物源性食品中地塞米松的含量检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/543GK202583217SQ201220228249
公开日2012年12月5日 申请日期2012年5月19日 优先权日2012年5月19日
发明者冯才伟, 吴鹏, 刘琳, 赵正苗, 彭鸽, 王建霞, 冯涓 申请人:北京勤邦生物技术有限公司