目标粒子的检测方法

目标粒子的检测方法
【专利摘要】一种目标粒子的检测方法，具有：(a)将被检试样浓缩以提高前述被检试样中的目标粒子的浓度的工序；(b)调制包含被浓缩的被检试样和用以与前述目标粒子结合的发光探针的试样溶液，使前述目标粒子与前述发光探针在前述试样溶液中结合的工序；和(c)通过扫描分子计数法计数前述试样溶液中存在的、与发光探针结合的目标粒子的个数的工序；在前述发光探针与前述目标粒子结合的状态下、与前述发光探针单独存在的状态下发出的光的发光特性不同。
【专利说明】目标粒子的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及使用共聚焦显微镜、多光子显微镜的光学系统等能够检测到来自溶液中的微小区域的光的光学体统而检测在试样溶液中分散并随机运动的粒子的方法。
[0002]本申请基于2011年6月27日在日本提交的日本特愿2011-142033号主张优先权，本文援引其内容。
【背景技术】
[0003]随着近年来光学测量技术的发展，使用共聚焦显微镜的光学系统和能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测定单光子或单分子荧光水平的微弱光。因此，提出了使用这样的微弱光的检测技术，进行生物分子等分子间相互作用或者分子间的结合/解离反应的检测的各种装置或方法。例如，对于荧光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如，参见专利文献 1、2、非专利文献I?3)中，使用激光共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测定来自在试样溶液中的微小区域(显微镜的激光聚光而成的焦点区域，被称为共焦体积。)内出入的荧光分子或进行了荧光标记的分子(荧光分子等)的荧光强度。然后基于由测定的荧光强度的自相关函数的值决定的、微小区域内的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)以及滞留的分子个数的平均值，能够取得荧光分子等的运动速度或大小、浓度这类信息，或者检测到分子的结构或大小的变化、分子的结合/解离反应或分散/聚集的各种现象。此外，利用荧光强度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如，专利文献 3)或光子计数直方图(Photon Counting Histogram:PCH。例如:专利文献4)与FCS同样地，生成检测到的出入共焦体积内的荧光分子等的荧光强度的直方图，对于该直方图的分布拟合统计学模型式，由此算出荧光分子等固有的明亮度的平均值和滞留于共焦体积内的分子个数的平均值。接着，根据上述信息，推测分子结构或大小的变化、结合/解离状态、分散/聚集状态等。此外，专利文献5、6中提出了:基于使用共聚焦显微镜的光学系统测定出的试样溶液的荧光信号的时程来检测荧光性物质的方法。专利文献7中提出了一种信号运算处理技术，其用于:使用光子计数技术，测量在流式细胞仪内流过的荧光微粒或固定在基板上的荧光微粒所发出的微弱光，检测液流中或基板上存在的荧光粒子。
[0004]特别的是，通过应用FCS、FIDA等、使用了共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术的微小区域的荧光测定技术的方法，测定所必需的试样的浓度比以前低得多且可以是微量(每次测定使用的量最多数十UL左右。另外，测定时间大幅地缩短(每次测定中可重复进行数次的秒数量级时间的测定))。因此，特别在对于医学/生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或高价的试样进行分析的情况下或者在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等被检体多的情况下，这些技术与现有的生物化学的方法相比较，可以期待用作能够低廉或迅速地进行实验或检测的强有力的工具。
[0005]另一方面，解析对象为核酸分子的情况下，已知有在检测作为目标对象的核酸分子之前，提高试样溶液中的核酸浓度的技术。已知例如，使溶剂由试样溶液蒸发浓缩之后，由该试样溶液测定目标核酸分子的方法(参照例如:专利文献8。)。另外，已知有使用具有将目标的成分分离/浓缩的旋转机构、和为了测定该特定的成分的浓度进行荧光发光检测的检测机构的化学分析装置，测定前述试样溶液中的核酸浓度的方法(参照例如专利文献
9。)。除了将试样溶液进行浓缩的方法以外，也可以通过从试样溶液中分离/精制核酸分子，而提高核酸浓度。作为该方法，已知有例如，通过向试样中添加阴离子性洗剂和离液盐而使核酸分子沉淀，回收核酸分子被浓缩而成的沉淀物的方法(参照例如专利文献10。)。另外，使用将核酸分子固定化的膜、阴离子交换基质，捕捉试样中的核酸分子之后，从该膜或基质将核酸分子放出的方法(参照例如专利文献11或12。)。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1:日本特开2005-098876号公报
[0009]专利文献2:日本特开2008-292371号公报
[0010]专利文献3:日本专利第4023523号公报
[0011]专利文献4:国际公开2008-080417号公报
[0012]专利文献5:日本特开2007-20565号公报
[0013]专利文献6:日本特开2008-116440号公报
[0014]专利文献7:日本特开平4-337446号公报
[0015]专利文献8:日本特开2008-000045号公报
[0016]专利文献9:日本特开2003-344288号公报
[0017]专利文献10:日本特表2006-526591号公报
[0018]专利文献11:日本特表2002-528093号公报
[0019]专利文献12:日本特表2009-518020号公报
[0020]非专利文献
[0021]非专利文献1:金城政孝、蛋白質核酸酵素、1999年、第44卷、第9号、第1431?1438 页。
[0022]非专利文献2:Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy>R.Rigler著、Springer、柏林、2000 年、第 204 ?224 页。
[0023]非专利文献3:加藤则子等4名、遺伝子医学、2002年、第6卷、第2号、第271?277 页。

【发明内容】

[0024]发明要解决的问题
[0025]上述FCS、FIDA、PCH等光分析技术简而言之是通过统计学处理计算所测量的荧光强度随时间波动的大小，根据该波动的大小确定在试样溶液中的微小区域内出入的荧光分子等的各种特性。因此，为了在上述的光分析技术中得到有意义的结果，作为试样溶液中的观测对象的荧光分子等的浓度或数密度适合调制成:在平衡状态下在秒数量级长度的一次测量时间中有能够统计学处理的个数的荧光分子等出入微小区域内；优选调制成在微小区域内经常地存在有一个左右的荧光分子等(典型地，共焦体积的体积为IfL左右，所以荧光分子等的浓度优选为InM左右或其以上。)。换言之，试样溶液中的观测对象粒子的浓度或数密度大幅地低于能够统计学处理的程度时(例如，大幅地低于InM时)，产生测量时间内只有稀少的观测对象物进入微小区域内的状态。于是，在荧光强度的测量结果中包括:观测对象物在微小区域内完全不存在的状态长时间地存在，并且显著的荧光强度的观测量变少。结果，通过如上所述的基于荧光强度的统计学波动的光分析技术难以获得有意义的或精度良好的分析结果。
[0026]专利文献5、6中所述的、使用共聚焦显微镜的光学系统的荧光性物质的检测方法中公开有:不进行如上述的涉及荧光强度波动的统计学处理，根据数秒的测量时间内有无显著强度的荧光信号的产生，判断试样中的观测对象的荧光分子等的有无，而得到显著强度的荧光信号的频率与试样中的荧光分子等的粒子数的相关性。特别是在专利文献6中，提出了产生搅拌试样溶液的随机流动时，检测灵敏度提高。然而，即便是这些方法，也只停留在检测通过扩散或随机的流动概率地进入微小区域内的荧光分子等的存在。即，不能把握微小区域内的荧光分子等的粒子行为，对于例如:粒子的计数、定量地算出粒子的浓度或数密度的技术没有公开。此外，专利文献7中记载的技术是逐个检测流式细胞仪的液流中的荧光微粒或固定在基板上的荧光微粒的存在的技术，而不是用于检测试样溶液中在通常的状态下溶解或分散的分子或胶体等的粒子，即不是用于对于在试样溶液中随机运动的粒子进行检测的技术。即，对于定量地算出在试样溶液中溶解或分散的粒子的浓度或数密度的技术并没有公开。另外，专利文献7的技术包含流式细胞仪中的测量或者荧光粒子向基板上的固定化处理的过程。因此可以认为，检测所需要的试样量远大于FCS、FIDA、PCH等的光分析技术的情况，并且对实施者要求复杂的高难度的操作技术。
[0027]因此，本发明的目的在于提供一种检测方法，不包含FCS、FIDA、PCH等光分析技术中进行那样的统计学处理，对于观测对象粒子的浓度或数密度低于上述的光分析技术中处理水平的试样溶液中的观测对象粒子的状态或特性也能够检测的新型的光分析技术，在更短的测定时间内检测试样溶液中分散并随机运动的目标粒子。
[0028]用于解决问题的方案
[0029]此处，对于在试样溶液中分散并随机运动的粒子发现:以由与该粒子结合的发光探针发出的光作为指标间接地进行检测的情况下，通过使用扫描分子计数法进行与发光探针结合的粒子的检测，即便试样溶液中的观测对象的粒子的浓度比通过FCS等现有的光分析技术检测的情况下低时，也能够灵敏度良好地检测与发光探针结合的粒子。进一步发现，通过在利用扫描分子计数法测定之前预先提高试样溶液中的观测对象粒子的浓度，能够在更短的测定时间内检测目标粒子。
[0030]此处，扫描分子计数法是日本特愿2010-044714中提出的新型光分析技术。
[0031]根据本发明的第一方式，目标粒子的检测方法为检测在试样溶液中分散并随机运动的粒子的方法，具有:
[0032](a)将被检试样浓缩以提高前述被检试样中的目标粒子的浓度的工序；
[0033](b)调制包含前述工序(a)中被浓缩的被检试样和用以与前述目标粒子结合的发光探针的试样溶液，使前述目标粒子与前述发光探针在前述试样溶液中结合的工序；和
[0034](C)计数前述工序(b)中调制的试样溶液中存在的、与发光探针结合的目标粒子的个数的工序；
[0035]在前述发光探针与前述目标粒子结合的状态下、与前述发光探针单独存在的状态下发出的光的发光特性不同，
[0036]前述工序(C)中的与发光探针结合的目标粒子的个数的计数通过如下工序进行:
[0037]使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统,在前述试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置的工序；
[0038]一边在前述试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置，一边检测由前述光检测区域中的与前述目标粒子结合状态的前述发光探针发出的光信号，逐个检测与发光探针结合的目标粒子的工序；和
[0039]将前述逐个检测的与发光探针结合的目标粒子的个数进行计数而计数所述光检测区域的位置的移动中检测到的前述目标粒子的个数的工序。
[0040]根据本发明的第二方式，在本发明的第一方式的目标粒子的检测方法中，前述工序(C)的试样溶液中的目标粒子的数密度是相对于前述光检测区域的体积(Vd)为I分子以下。
[0041]根据本发明的第三方式，在本发明的第一方式或第二方式的任一方式的目标粒子的检测方法中，前述目标粒子为核酸分子，前述工序(a)为从前述被检试样中精制核酸分子并浓缩的工序。
[0042]根据本发明的第四方式，在本发明的第一方式或第二方式的任一方式的目标粒子的检测方法中，前述工序(a)为从前述被检试样中特异地回收目标粒子并进行浓缩的工序。
[0043]根据本发明的第五方式，在本发明的第一方式至第四方式的任一方式的目标粒子的检测方法中，在前述移动光检测区域的位置的工序中，以规定的速度移动前述光检测区域的位置。
[0044]根据本发明的第六方式，在本发明的第一方式至第五方式的任一方式的目标粒子的检测方法中，在前述移动光检测区域的位置的工序中，以快于前述与发光探针结合的目标粒子的扩散移动速度的速度移动前述光检测区域的位置。
[0045]根据本发明的第七方式，在本发明的第一方式至第六方式的任一方式的目标粒子的检测方法中，在由前述检测到的光检测来自每个与发光探针结合的目标粒子的光信号而逐个检测与前述发光探针结合的目标粒子的工序中，根据检测到的按照时间顺序的光信号的形状，检测到一个与发光探针结合的目标粒子进入了前述光检测区域。
[0046]根据本发明的第八方式，在本发明的第一方式至第七方式的任一方式的目标粒子的检测方法中，前述发光探针具有相互接近时产生荧光共振能量转移现象的能量供体部位和能量受体部位，并且，在前述发光探针与前述粒子结合的状态以及前述发光探针不与前述粒子结合的状态之间，前述能量供体部位与前述能量受体部位的距离不同；在前述发光探针与前述目标粒子结合的状态下、与前述发光探针单独存在的状态下，由前述发光探针发出的光的发光特性不同。
[0047]根据本发明的第九方式，在本发明的第一方式至第八方式的任一方式的目标粒子的检测方法中，前述目标粒子为核酸分子，前述发光探针与前述目标粒子特异地杂交，并且前述目标粒子为单链核酸分子，该单链核酸分子上结合有荧光共振能量转移现象中的成为能量供体的荧光物质以及成为能量受体的物质的至少一者。
[0048]根据本发明的第十方式，目标粒子的检测方法为检测在试样溶液中分散并随机运动的粒子的方法，具有:
[0049](a’ )调制包含被检试样、和用以与目标粒子结合的发光探针的试样溶液的工序；
[0050](b’)使所述目标粒子与所述发光探针在所述工序(a’)中调制的试样溶液中结合的工序；和
[0051](c’ )计数所述工序(b’ )中调制的试样溶液中存在的、与发光探针结合的目标粒子的个数的工序；
[0052]前述发光探针在与前述目标粒子结合的状态下以及单独存在的状态下发出的光的发光特性不同；
[0053]前述工序(c’ )中的与发光探针结合的目标粒子的个数的计数通过如下工序进行:
[0054]使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，在前述试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置的工序；
[0055]一边在前述试样溶液内移动前述光学系统的光检测区域的位置，一边检测由前述光检测区域中的与前述目标粒子结合状态的前述发光探针发出的光信号，逐个检测与发光探针结合的目标粒子的工序；和
[0056]将前述逐个检测的与发光探针结合的目标粒子的个数进行计数而计数前述光检测区域的位置的移动中检测到的前述目标粒子的个数的工序；
[0057]在前述工序(a’ )之后或前述工序(b’ )之后进行浓缩处理以提高前述试样溶液中的目标粒子的浓度。
[0058]发明的效果
[0059]上述的目标粒子的检测方法中应用的扫描分子计数法不实施计算荧光强度波动这样的统计学处理。因此，通过上述的目标粒子的检测方法，即便试样中仅微量存在通过FCS等现有的光分析技术不能检测程度的作为解析对象的目标粒子时，也能够检测试样中的前述目标粒子。进而，上述的目标粒子的检测方法中，在利用扫描分子计数法测定之前，通过浓缩处理使试样溶液中的目标粒子的浓度提高，所以相比于不进行浓缩处理的情况，能够在更短的测定时间内检测目标粒子。
【专利附图】

【附图说明】
[0060]图1A是用于扫描分子计数法的光分析装置的内部结构的示意图。
[0061]图1B是共焦体积(共聚焦显微镜的观察区域)的示意图。
[0062]图1C是改变镜子7的方向，在试样溶液内部移动光检测区域的位置的机构的示意图。
[0063]图2A是说明用于扫描分子计数法的基于光分析技术的光检测原理的示意图。
[0064]图2B是通过用于扫描分子计数法的光分析技术测量的光强度的时间变化的示意图。
[0065]图3A是观测对象粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时的示意图。
[0066]图3B是表示观测对象粒子边进行布朗运动边横穿光检测区域时的光子计数(光强度)的时间变化的例子的图。
[0067]图4A是以快于观测对象粒子的扩散移动速度的速度移动试样溶液内的光检测区域的位置、从而观测对象粒子横穿光检测区域时的示意图。
[0068]图4B是以快于观测对象粒子的扩散移动速度的速度移动试样溶液内的光检测区域的位置、从而观测对象粒子横穿光检测区域时的光子计数(光强度)的时间变化的例子的图。
[0069]图5是以流程图的形式显示根据扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时间变化进行粒子的计数的处理次序的图。
[0070]图6A是说明在根据通过扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时间变化进行粒子计数的处理次序中的、检测信号的信号处理工序的例子的图。
[0071]图6B是说明在根据通过扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时间变化进行粒子计数的处理次序中检测信号的信号处理工序的例子的图。
[0072]图7表示通过扫描分子计数法测量的光子计数数据的实测例(柱状图)、和将数据平滑化后获得的曲线(虚线)、和峰存在区域中拟合的高斯函数(实线)(图中，标记了“噪音”的信号作为由噪音或异物产生的信号而被无视)。
[0073]图8A为表示实施例1的各试样溶液中被计数的光子数的图。
[0074]图8B为表示实施例1的各试样溶液中被计数的峰数的图。
[0075]图9为表示实施例2的各试样溶液中被计数的峰数的图。
[0076]图10为表示实施例3的各试样溶液中所计数的峰数对应于每个荧光标记核酸分子的浓度的图。
[0077]图11为表示实施例4的各试样溶液中被计数的峰数的图。
【具体实施方式】
[0078]首先，对于扫描分子计数法进行说明。扫描分子计数法为如下技术:一边通过微小区域扫描试样溶液内，一边当在试样溶液中分散并随机运动的发出光的粒子(以下，称为“发光粒子”。)横穿微小区域内时，检测由微小区域中的发光粒子发出的光，一个一个逐个检测试样溶液中的发光粒子，获得与发光粒子的计数、试样溶液中的发光粒子的浓度或数密度的相关信息。扫描分子计数法与FIDA等光分析技术同样地，检测所需的试样可以是微量(例如，数十4 1左右)。另外，扫描分子计数法的测定时间短，并且与FIDA等光分析技术的情况相比，对于更低浓度或数密度的发光粒子，可以定量检测其浓度或数密度等特性。
[0079]需要说明的是，发光粒子是指通过荧光、磷光、化学发光、生物发光、光散射等发出光的粒子。本发明的目标粒子的定量方法中，目标粒子与发光探针结合而成的粒子为发光粒子。
[0080]本发明和本说明书中，共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指在这些显微镜中检测光的微小区域。当由物镜照射照明光时，该照明光聚光的区域相当于微小区域。需要说明的是，在共聚焦显微镜中，该微小区域尤其根据物镜与小孔(pinhole)之间的位置关系确定。
[0081]边在试样溶液内移动光检测区域的位置、即通过光检测区域扫描试样溶液内边逐次地进行光的检测。于是，当移动的光检测区域包含了与随机运动的粒子结合或缔合的发光探针时，检测到来自发光探针的光。结果，检测到一个粒子的存在(根据实验的方式，也包含如下情况:发光探针与希望检测的粒子(目标粒子)暂时结合后，在进行光的检测时与希望检测的粒子解离。)。接着，在逐次检测到的光中逐个检测来自发光探针的光信号，由此，一个一个地逐个逐次地检测到粒子(与发光探针结合的粒子)的存在，能够得到关于粒子在溶液内的状态的各种信息。具体而言，例如，在上述构成中，可以计数逐个检测到的粒子，从而计数在光检测区域的位置移动中检测到的粒子的个数(粒子的计数)。根据上述构成，通过组合粒子的个数与光检测区域的位置的移动量，能够获得与试样溶液中的粒子的数密度或浓度相关的信息。特别是通过任意手法如以规定速度移动光检测区域的位置来确定光检测区域的位置移动轨迹的总体积，就能够具体计算粒子的数密度或浓度。当然，并不是直接确定绝对数密度值或浓度值，可以计算相对于多个试样溶液、或者相对于成为浓度或数密度基准的标准试样溶液的相对的数密度或浓度之比。另外，扫描分子计数法中，采用改变光学系统的光路而移动光检测区域的位置的构成。因此，光检测区域的移动是迅速的，并且在试样溶液中实质上不产生机械振动、流体力学的作用。结果，作为检测对象的粒子能够不受力学的作用的影响而以稳定的状态进行光的测量。需要说明的是，在试样溶液中有振动或流动作用时，有粒子的物理性质变化的可能性。并且，由于流通试样溶液的构成不是必需的，因此能够用与FCS、FIDA等情况下同样微量(I?数十μ L左右)的试样溶液进行测量和分析。
[0082]在逐个地检测上述的粒子的工序中，由逐次检测到的光信号判定与一个粒子结合的发光探针是否进入光检测区域时，可以根据按照时间顺序检测到的光信号的形状而进行。需要说明的是，在逐个检测上述的粒子的工序中，也包括:一个发光探针与一个粒子结合的情况；多个发光探针与一个粒子结合的情况；以及根据实验方式的、与一个粒子结合之后从粒子解离的发光探针的情况。本实施方式中，典型地，当检测到具有比规定阈值大的强度的光信号时，可以检测到与一个粒子结合的发光探针进入了光检测区域。
[0083]此外，在上述移动光检测区域的位置的工序中，可以根据与粒子结合的发光探针的特性或试样溶液中的数密度或浓度，适当改变试样溶液内部的光检测区域的位置的移动速度。由与粒子结合的发光探针所检测到的光的形态，可能会根据其特性或试样溶液中的数密度或浓度而改变。特别是，光检测区域的移动速度过快时，由与一个粒子结合的发光探针得到的光量降低。因此，为了精度良好或灵敏度良好地测量来自与一个粒子结合的发光探针的光，优选适当地改变光检测区域的移动速度。
[0084]进一步，在上述移动光检测区域的位置的工序中，适当的是将试样溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定为高于与作为检测对象的粒子结合的发光探针(即，本发明的目标粒子的定量方法中，与目标粒子结合的状态的发光探针)的扩散移动速度(由布朗运动造成的粒子的平均移动速度)。如上述说明，通过扫描分子计数法，当光检测区域通过存在有与一个粒子结合的发光探针的位置时，检测由该发光探针发出的光，逐个检测发光探针。然而，当与粒子结合的发光探针在溶液中由于布朗运动而随机移动，在光检测区域中出入多次时，由于多次检测到来自一个发光探针的(表示希望检测的粒子存在的光信号)光信号。因此，难以将检测到的光信号与一个希望检测的粒子的存在对应起来。因此，如上述，将光检测区域的移动速度设定为高于与粒子结合的发光探针的扩散移动速度。具体而言，设定为以快于与目标粒子结合的状态的发光探针的扩散移动速度的速度进行移动。由此，能够使与一个粒子结合的发光探针对应于一个光信号(表示粒子的存在的光信号)。需要说明的是，扩散移动速度随着与粒子结合的发光探针而改变，所以如上述，优选根据与粒子结合的发光探针的特性(特别是扩散常数)，适当改变光检测区域的移动速度。
[0085]可以以任意方式，进行用于移动光检测区域的位置的光学系统的光路改变。
[0086]例如，可以利用激光扫描型光学显微镜中采用的检流计镜改变光路，使光检测区域的位置发生变化。光检测区域的位置的移动轨迹也可以任意地设定。例如，光检测区域的位置的移动轨迹可选自圆形、椭圆形、矩形、直线和曲线。
[0087]扫描分子计数法中，其光检测机理自身与FIDA等光分析技术的情况相同，采取对来自共聚焦显微镜或多光子显微镜的光检测区域的光进行检测的构成。因此，试样溶液的量与FIDA等光分析技术情况下同样地为微量即可。然而，扫描分子计数法中，不实施计算荧光强度的波动这样的统计学处理。因此，扫描分子计数法的光分析技术可以适用于粒子的数密度或浓度比FIDA等光分析技术所需要的水平大幅地低的试样溶液。
[0088]另外，扫描分子计数法中，在溶液中分散或溶解的每个粒子被逐个检测出。因此，使用该信息，可以定量地进行粒子的计数、试样溶液中的粒子的浓度或数密度的计算、或者取得与浓度或数密度相关的信息。即，通过扫描分子计数法，使通过光检测区域的粒子与检测到的光信号一一对应，粒子被一个一个地检测出，所以能够进行溶液中分散并随机运动的粒子的计数。所以，相比于以往，能够精度良好地确定试样溶液中的粒子的浓度或数密度。实际上，根据逐个检测与目标粒子结合的状态的发光探针等并计数其数目、确定粒子浓度的方法、即上述的目标粒子的检测方法，即使试样溶液中的与目标粒子结合的发光探针的浓度是比通过荧光分光光度计或酶标仪测量的荧光强度能够确定的浓度更低的浓度，也能够检测目标粒子。
[0089]进一步，改变光学系统的光路、利用光检测区域扫描试样溶液的方式，不对试样溶液产生机械振动或流体力学作用，使试样溶液在均一的状态或试样溶液机械上稳定的状态下进行观察。因此，例如，与试样中发生流动的情况相比较，定量检测结果的可靠性提高。另外，对于试样溶液中的成为检测对象的粒子，能够在不施加力学作用的影响下或不赋予人为影响的状态下进行测量。需要说明的是，对于试样引起流动时通常难以引起均匀的流速，并且装置结构复杂化。另外，必要的试样量大幅地增大，并且由流动导致的流体力学的作用，溶液中的粒子、发光探针或结合体或者其他的物质存在变质或变性的可能性。
[0090]<用于扫描分子计数法的光分析装置的构成>
[0091]如图1A中示意性的示例，可以通过由能够实施FCS、FIDA等的共聚焦显微镜的光学系统和光检测器组合而构成的光分析装置实施扫描分子计数法。如图1A所示，光分析装置I是由光学系统2?17、和用于控制光学系统的各部分的行为并获得、分析数据的计算机18构成的。光分析装置I的光学系统可以为与通常的共聚焦显微镜的光学系统同样的构成。自光源2放射的在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的射出端以固有的NA规定的角度放射为发散的光。激光通过准直仪4成为平行光，该平行光在分色镜5、反射镜6、7处发生反射，入射至物镜8。在物镜8的上方，典型地配置有分注了 I?数十μ L的试样溶液的试样容器或排列有孔10的微孔板9。自物镜8射出的激光在试样容器或孔10内的试样溶液中聚集为焦点，形成光强度强的区域(激发区域)。试样溶液中，分散或溶解有作为观测对象物的粒子、与这样的粒子结合的发光探针、典型地带有荧光色素等发光标记的分子。与发光探针结合或缔合的粒子(根据实验的方式，与粒子暂时结合后与粒子解离的发光探针)进入激发区域时，发光探针就在其中被激发而发出光。发出的光(Em)通过物镜8、分色镜5，在镜子11处反射，在聚光镜12处聚光，通过小孔13，透过二次滤片14。此时，只选择特定的波长范围的光成分。进而，发出的光被导入至多模光纤15而到达光检测器16，转换成按照时间顺序的电信号之后，输入至计算机18。接着，按照后面说明的方式实施用于光分析的处理。需要说明的是，在上述的构成中，小孔13配置于与物镜8的焦点位置共轭的位置上。因此，仅自图1B中示意地所示的激光的焦点区域即激发区域内发出的光通过小孔13，而来自激发区域以外的光被挡住。图1B所例示的激光的焦点区域通常是具有I?IOfL左右的实际体积的、位于本光分析装置中的光检测区域，被称为共焦体积(典型地，光强度呈现以区域的中心为顶点的高斯型分布或洛伦兹型分布。实际体积是以光强度为l/e2的面为界面的略椭球体的体积。)另外，扫描分子计数法中，检测到来自一个粒子与发光探针的结合体或来自发光探针的光，例如，来自一个或数个荧光色素分子的微弱光。因此，光检测器16优选使用能够用于光子计数的超高灵敏度的光检测器。此外，为了改变欲进行观察的孔10，在没有图示的显微镜的平台上可以设有用于移动微孔板9的水平方向位置的平台位置变化装置17a。可以通过计算机18控制平台位置变化装置17a的动作。通过上述的构成，即使被检体为多个，也能够实现快速的测量。
[0092]进一步，上述的光分析装置的光学系统中，设置有改变光学系统的光路、通过光检测区域扫描试样溶液内的机构，即，用于在试样溶液内移动焦点区域(光检测区域)的位置的机构。这样的用于移动光检测区域的位置的机构，例如如图1C示意性示例的，也可以采用改变反射镜7的方向的镜转向器17。这样的镜转向器17也可以为与装备在普通的激光扫描型显微镜中的检流计镜装置相同的构成。另外，为了实现预期的光检测区域的位置移动模式，镜转向器17是在计算机18的控制下，与通过光检测器16的光检测协调而被驱动的。光检测区域的位置的移动轨迹可任意地选自圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合。或者，光检测区域的位置的移动轨迹也可以从计算机18的程序中的各种移动模式中选择。需要说明的是，图中没有显示但也可以通过上下移动物镜8而使光检测区域的位置沿上下方向移动。如上所述，上述的光分析装置不具备移动试样溶液的构成，而具备改变光学系统的光路而移动光检测区域的位置的构成。因此，试样溶液内实质上不发生机械振动或流体力学的作用，能够排除对于观测对象物的力学作用的影响，能够进行稳定的测量。
[0093]当粒子与发光探针的结合体或发光探针通过吸收多光子而发光时，上述光学系统作为多光子显微镜使用。在此情况下，仅在激发光的焦点区域(光检测区域)中发出光，因此可以去除小孔13。此外，当粒子与发光探针的结合体或发光探针通过化学发光或生物发光现象而不依赖激发光发光时，可以省略用于产生激发光的光学系统2?5。当粒子与发光探针的结合体或发光探针通过磷光或散射发光时，直接使用上述共聚焦显微镜的光学系统。另外，在光分析装置I中，如图所示，可以为如下构成:设置有多个激发光源2，根据用于将粒子与发光探针的结合体或发光探针激发的光的波长，选择适当的激发光的波长。同样地，设置有多个光检测器16，当试样中包含波长不同的多种粒子与发光探针的结合体或发光探针时，可以根据波长分别检测来自它们的光。
[0094]<扫描分子计数法的光分析技术的原理>
[0095]FIDA等分光分析技术与现有的生物化学分析技术相比,其优点是必需的试样量非常少，并且可以快速实施检查。然而，在FIDA等分光分析技术中，原理上根据荧光强度波动计算观测对象粒子的浓度或特性。因此，为了获得精度良好的检测结果，要求试样溶液中的观测对象粒子的浓度或数密度是如下水平:在荧光强度测量中，在光检测区域CV内总是存在一个左右的观测对象粒子，在测量时间内总是检测到显著的光强度(光子计数)。如果当观测对象粒子的浓度或数密度低于上述时，例如，当观测对象粒子只是偶尔进入光检测区域CV内的水平时，仅在一部分测量时间内出现显著的光强度(光子计数)，因而难以以良好的精度计算光强度的波动。此外，在观测对象粒子的浓度大幅地低于测量中通常在光检测区域内存在一个左右的观测对象粒子的水平时，光强度波动的运算易受背景的影响，为了获得对运算而言为充分量的显著的光强度数据，测量时间延长。与此相对，即使当观测对象粒子的浓度低于FIDA等分光分析技术要求的水平时，用扫描分子计数法也能够检测观测对象粒子的数密度或浓度等特性。
[0096]扫描分子计数法的光分析技术中，直接了当地说，驱动用于移动光检测区域的位置的机构(镜偏向器17)而改变光路，如图2A和图2B中不意地描述,一边在试样溶液内移动光检测区域CV的位置即利用光检测区域CV扫描试样溶液内，一边实施光检测。
[0097]如此一来，例如，如图2A和图2B所示，在光检测区域CV移动期间(图2B中，时间t0?t2)，当通过存在有I个粒子(图2A中，发光探针结合有荧光色素)的区域时(tl)，检测到如图2B所述的显著的光强度(Em)。如此，实施上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，通过一个一个地检测在此期间出现的图2B所例示的显著的光强度，逐个检测出结合有发光探针的粒子。接着，通过将其个数进行计数，能够得到与存在于所测量的区域内的粒子的个数或者浓度或数密度相关的信息。这样的扫描分子计数法的光分析技术的原理中，粒子一个一个地被检测出且不进行如荧光强度波动的计算这类统计学运算处理。因此，即便是欲观测粒子浓度低至无法用FIDA等以充分精度分析程度的试样溶液中，也能够得到关于粒子的浓度或数密度的信息。
[0098]另外，通过扫描分子计数法这类对试样溶液中的粒子逐个检测、计数的方法，与由通过荧光分光光度计或酶标仪测量的荧光强度来检测被荧光标记的粒子的浓度时相比，能够以更低的浓度进行测定。当通过荧光分光光度计或酶标仪来检测被荧光标记的粒子的浓度时，通常假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例。然而，该情况下，被荧光标记的粒子的浓度充分地降低时，噪音信号的量相对于由被荧光标记的粒子发出的光的信号量变大(S/N比恶化)。结果，被荧光标记的粒子的浓度与光信号量之间的比例关系瓦解，确定的浓度值的精度恶化。另一方面，扫描分子计数法在由被检测的光信号检测对应于各个粒子的信号的工序中，从检测结果中排除了噪音信号，只将对应于各个粒子的信号进行计数而计算出浓度。因此，与假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而检测浓度时相比较，能够检测至更低的浓度。
[0099]进而，当一个观测对象粒子结合有多个发光探针时，与传统的假定荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而确定浓度的方法相比，扫描分子计数法这类对试样溶液中的粒子逐个检测、计数的方法的情况下，粒子浓度高一侧的粒子浓度的测量精度提高。在一个观测对象粒子结合有多个发光探针的条件下，向试样溶液添加某一量的发光探针时，观测对象粒子的浓度升高时，相对而言与粒子结合的发光探针的个数降低。在此情况下，由于每一个观测对象粒子的荧光强度降低，因此，被荧光标记的粒子的浓度与光量之间的比例关系瓦解，所确定的浓度值的精度恶化。另一方面，扫描分子计数法在由检测到的光信号检测对应于各个粒子的信号的工序中，每个粒子的荧光强度降低的影响变少，由粒子数计算浓度，所以，与假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而检测浓度时相比较，能够检测至更高的浓度。
[0100]<通过扫描分子计数法的试样溶液的光强度的测定>
[0101]就扫描分子计数法的光分析中的光强度的测定而言，除了在检测中驱动镜转向器17，在试样溶液内移动光检测区域的位置(试样溶液内部的扫描)以外，可以以与FCS或FIDA中的光强度检测工序相同的方式实施光强度检测。在操作处理中，典型地，在微孔板9的孔10中注入试样溶液而载置于显微镜的平台上之后，使用者对计算机18输入测定开始的指示。于是，计算机18根据存储装置(没有图示)存储的程序(将用于在试样溶液内移动光检测区域的位置的光路进行改变的次序、和在光检测区域的位置的移动中检测来自光检测区域的光的次序)，开始试样溶液内光检测区域中的激发光的照射以及光强度的测量。进行这样的测量期间，在根据计算机18程序的处理操作的控制下，镜偏向器17驱动镜7(检电镜)，在孔10内进行光检测区域的位置的移动。同时，光检测器16将逐次检测到的光转换为电信号，传送给计算机18。计算机18以任意方式由送达的光信号生成按照时间顺序的光强度数据并保存。需要说明的是，典型地光检测器16为能够检测到单光子到达的超高灵敏度光检测器。因此，光的检测可以是以如下方式进行的光子计数:在规定时间内，间隔规定的单位时间(ΒΙΝ--ΜΕ)如每10 μ秒逐次地测量到达光检测器的光子的个数。另外，按照时间顺序的光强度的数据也可以为按照时间顺序的光子计数数据。
[0102]光强度测量中的光检测区域的位置移动速度可以是任意速度，可以设定为适合例如实验或分析目的的规定速度。当根据所检测到的观测对象粒子的个数获得与其数密度或浓度相关的信息时，光检测区域所通过的区域的大小或体积是必需的。因此，以移动距离受掌握的方式进行光检测区域的位置移动。需要说明的是，测量中的经过时间与光检测区域的位置的移动距离成比例关系的方式，能够容易地解释测定结果，所以，移动速度基本上优选为恒定速度。然而，移动速度不限定于此。
[0103]此外，对于光检测区域的位置移动的速度，为了由测量的按照时间顺序的光强度数据逐个检测观测对象粒子，或以良好的精度定量实施观测对象粒子数的计数，优选将上述的移动速度设定为比观测对象粒子(更严密地，粒子与发光探针的结合体或者与粒子结合后分解而游离的发光探针、本实施方式中，为与发光探针结合的目标粒子)的随机运动即布朗运动导致的移动速度更快的值。扫描分子计数法的光分析技术的观测对象粒子是分散或溶解在溶液中的自由地随机运动的粒子，由于布朗运动，位置随时间而移动。因此，光检测区域的位置的移动速度比粒子的布朗运动导致的移动慢时，如图3Α示意地描述，粒子在区域内随机地移动。因此，光强度如图3Β所示随机地变化(如已知，光检测区域的激发光强度以区域的中心为顶点向外侧降低。)。结果，难以确定对应于各个观测对象粒子的显著的光强度的变化。此处，优选将光检测区域的位置的移动速度设定为快于粒子的布朗运动导致的平均的移动速度(扩散移动速度)。于是，如图4Α所示，粒子略直线地横穿光检测区域。因此，按照时间顺序的光强度数据中，如图4Β例示，对应于各个粒子的光强度变化的分布图大致一致(粒子略直线地通过光检测区域的情况下，光强度变化的曲线与激发光强度分布几乎相同。)。结果，能够容易地确定各个观测对象粒子与光强度的对应。
[0104]具体而言，由于布朗运动， 具有扩散系数D的观测对象粒子(更严密的是，粒子与发光探针的结合体，或与粒子结合后再分解、游离的发光探针)通过半径Wo的光检测区域(共焦体积)时所需的时间At是由均方位移的关系式
[0105](2ffo)2 = 6D/ Δ t (I)
[0106]推断出
[0107]At= (2ffo) 2/6D (2)
[0108]因此，观测对象粒子通过布朗运动移动的速度(扩散移动速度)Vdif大约是
[0109]Vdif = 2ffo/ Δ t = 3D/ffo (3)
[0110]此处，光检测区域的位置的移动速度可以参考前述Vdif而设定为比之更快的值。例如，假定观测对象粒子的扩散系数为D = 2.0X10-V/S左右的情况下，只要Wo为0.62 μ m左右，则Vdif为1.0X 10_3m/s。因此，光检测区域的位置的移动速度设定为其略10倍的15mm/s即可。此外，当观测对象粒子的扩散系数未知时，为了找到使在光检测区域的位置移动速度的各种设定下的光强度变化曲线成为预期曲线(典型的是与激发光强度分布几乎相同)的条件，可以重复进行预备实验，确定适当的光检测区域的位置的移动速度。
[0111]<通过扫描分子计数法的光强度的分析>
[0112]经上述处理获得试样溶液的按照时间顺序的光强度数据时，可以在计算机18中，根据存储在存储装置中的程序进行处理(由检测到的光逐个检测来自各个发光粒子的光信号的次序)，实施如下所述的光强度的分析。
[0113](i) 一个观测对象粒子的检测
[0114]在按照时间顺序的光强度数据中，当一个观测对象粒子通过光检测区域时的轨迹是如图4A所示几乎直线状时，与该粒子相对应的光强度变化如图6A示意性地所述具有反映光检测区域的光强度分布的曲线。需要说明的是，该光检测区域由光学系统确定。反映光检测区域的光强度分布的分布图通常表现为略钟形。因此，观测对象粒子的检测的手法之一中，对于光强度设定阈值1，超过该阈值的光强度持续时间宽度△ τ在规定的范围时，判定为该光强度的分布图与一个粒子通过光检测区域相对应，检测到一个观测对象粒子。对应于光强度的阈值1以及对应时间宽度△ τ的规定的范围是根据观测对象粒子与发光探针的结合体(或者与粒子结合后再分解而游离的发光探针)所发出的光的强度而预想的曲线决定的；所述观测对象粒子相对于光检测区域以规定的速度相对地移动。需要说明的是，具体的值可以根据实验任意地设定，也可以根据观测对象粒子与发光探针的结合体(或者与粒子结合后分解而游离的发光探针)的特性而选择决定。
[0115]此外，作为观测对象粒子的检测的其他方法，光检测区域的光强度分布假定为高斯分布:
[0116]I = A/exp (_2t2/a2) (4)
[0117]此时，对显著的光强度曲线(可以明确判断为非背景的曲线)，根据式⑷拟合计算的强度A和宽度a落入规定范围内时，该光强度曲线可判断为对应一个观测对象粒子通过了光检测区域，可以视为检测到一个观测对象粒子。当强度A和宽度a落在规定范围之外时，可以在分析中作为噪音或异物而无视。
[0118](ii)观测对象粒子的计数
[0119]观测对象粒子的计数，可以是通过任意方法计数通过上述观测对象粒子的检测方法检测到的粒子的个数。然而，当粒子的个数较大时，也可以通过例如图5和图6B所示例的处理来进行。[0120]参照图5和图6B，在根据按照时间顺序的光强度(光子计数)数据计数粒子数的方法的一个例子中，在通过上述说明的光强度测定、即用光检测区域扫描试样溶液内和进行光子计数，获得按照时间顺序的光信号数据(光子计数数据)后(步骤100)，对该按照时间顺序的光信号数据(图6B最上部分“检测结果(未处理)”)，进行SMOOTHING (平滑化)处理(步骤110，图6B中上部分“SMOOTHING”)。粒子和发光探针的结合体或发光探针发出的光是概率地发出的，所以在微小的时间内存在数据值产生欠缺。因此，通过这样的平滑化处理，可以无视如前述的数据值的欠缺。平滑化处理可以例如通过移动平均法而进行。需要说明的是，可以根据获得光信号数据时的光检测区域的位置移动速度(扫描速度)、BIN--ΜΕ，适当设定实施平滑化处理时的参数，例如，在移动平均法中一次取平均的数据点数或移动平均的次数等。
[0121]然后，为了检测在平滑化处理后的按照时间顺序的光信号数据中存在显著信号的时间区域(峰存在区域)，对平滑化处理后的按照时间顺序的光信号数据对时间进行一阶微分值运算(步骤120)。按照时间顺序的光信号数据的时间微分值，如图6B中下部分的“时间微分”所示信号值变化时间点处的值的变化变大，因此通过参考这样的时间微分值可以有利地确定显著的信号(峰信号)的起点和终点。
[0122]之后，在按照时间顺序的光信号数据中，逐次检测显著的信号(峰信号)，判断检测到的峰信号是否是与观测对象粒子相对应的信号。
[0123]具体而言，首先，在按照时间顺序的光信号数据的按照时间顺序的时间微分值数据基础上，逐次地参照时间微分值，搜索一个峰信号的始点和终点进行确定，从而确定峰存在区域(步骤130)。一旦决定了一个峰存在区域，就对该峰存在区域中的平滑化的按照时间顺序的光信号数据进行钟形函数拟合(图6B下部分的“钟形函数拟合”)，计算钟形函数的峰强度Imax、峰宽度(半高全宽(full width half maximum)) W、拟合中的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。需要说明的是，拟合的钟形函数典型的是高斯函数，也可以是洛伦兹型函数。由此，判断计算的钟形函数的参数是否落在一个粒子与发光探针的结合体或发光探针通过光检测 区域时检测到的光信号所描述的钟形曲线参数的规定范围内，即，峰强度、峰宽度、相关系数是否分别落在规定范围内等(步骤150)。这样，如图7左侧所示，计算的钟形函数的参数被判断为落在与一个粒子和发光探针的结合体或者与发光探针对应的光信号规定的范围内时，则该信号判定为与一个观测对象粒子对应的信号。结果，判断为检测到一个观测对象粒子，计数为一个粒子(粒子数的计数增加。工序160)。另一方面，如图7右侧所示，将计算的钟形函数的参数在预定范围内不存在的峰信号作为噪音而无视。
[0124]上述的步骤130~160的处理中的峰信号的搜索和判定可以在按照时间顺序的光信号数据的整个领域内重复地进行。于是，每检测到一个观测对象粒子，则作为粒子而计数。因此，在结束对按照时间顺序的光信号数据全部区域的峰信号搜索后(步骤170)，将所获得的粒子计数值作为在按照时间顺序的光信号数据中检测到的观测对象粒子的个数。
[0125](iii)观测对象粒子的数密度或浓度的确定
[0126]进行了观测对象粒子的计数后，使用在获得按照时间顺序的光信号数据的过程中光检测区域所通过的区域的总体积，确定观测对象粒子的数密度或浓度。然而，光检测区域的实际体积依赖于激发光或检测光的波长、透镜的开口数、光学系统的调整状态而改变。因此，通常难以由设计值算出观测对象粒子的数密度或浓度。因此，计算光检测区域所通过的区域的总体积也不简单。在本文中，典型的是，可以在与所要检查的试样溶液的测定相同的条件下，对已知粒子浓度的溶液(参照溶液)进行上文说明的光强度测定、粒子的检测和计数，根据检测到的粒子的个数和参照溶液的粒子的浓度，确定光检测区域所通过的区域的总体积，即确定观测对象粒子的检测数和浓度之间的关系。
[0127]作为参照溶液的粒子，可以优选为与观测对象粒子所形成的粒子和发光探针的结合体(或与观测对象粒子结合后再游离的发光探针)具有相同发光特性的发光标记(荧光色素等)。具体而言，例如，对于粒子浓度为C的参照溶液，其粒子的检测数为N时，光检测区域所通过的区域总体积Vt则根据
[0128]Vt = N/C (5)
[0129]而得到。另外，准备多个不同浓度的溶液作为参照溶液，分别对其实施测定，将计算的Vt的平均值作为光检测区域所通过区域的总体积Vt而采用。因此，一旦获得Vt值，粒子的计数结果为η的试样溶液的粒子的数密度C就根据
[0130]c = n/Vt (6)
[0131]而获得。需要说明的是，可以不通过上述方法，而利用任意方法例如FCS、FIDA得到光检测区域的体积、光检测区域所通过区域的总体积。此外，本实施方式的光分析装置也可以如下构成，对于规定的光检测区域的移动模式，将各种标准粒子的浓度C和粒子数N之间的关系(式(5))的信息预先存储在计算机18的存储装置中，装置的使用者在实施光分析时可以适当利用存储的关系信息。
[0132]<目标粒子的检测方法>
[0133]扫描分子计数法为能够在分子离散的状况下测定每一粒发光粒子的测定方法。因此，对于PM级以下的浓度比较低的发光粒子也能够进行测定。因此，通过上述的目标粒子的检测方法，即使当试样溶液中的解析对象的目标粒子的浓度非常低时，也能够高灵敏度地计数与发光探针结合的目标粒子。
[0134]另一方面，扫描分子计数法通过在扫描的共焦区域(即，光检测区域)中捕捉来自发光粒子的信号而进行检测，在此基础上，在离散地存在有作为检测对象的发光粒子的溶液中进行检测。因此，存在直至在光检测区域中捕捉到发光粒子为止需要很多时间的情况。特别是，检测极度稀薄的发光粒子的情况下，需要持续地进行测定直至在前述光检测区域中捕捉到充分的信号为止。测定时间短的情况下，由作为解析对象的发光粒子获得信号的频率不足，难以正确地只测定该发光粒子。换言之，扫描分子计数法的测定时间依赖于测定对象的浓度，测定发光粒子极度稀薄的试样溶液时，测定时间延长。
[0135]上述的目标粒子的检测方法为检测试样溶液中分散并随机运动的目标粒子的方法。上述的目标粒子的检测方法中，使试样溶液中的目标粒子与发光探针结合而标记，进一步通过扫描分子计数法计数与发光探针结合的目标粒子，检测试样溶液中的目标粒子，此时试样溶液中的目标粒子的浓度通过浓缩处理而被提高。上述的目标粒子的检测方法中，在利用扫描分子计数法测定之前，通过浓缩处理，试样溶液中的观测对象粒子的浓度被提高，所以能够在更短的测定时间内检测目标粒子。
[0136]用于提高测定溶液中的目标粒子的浓度的浓缩处理，只要在利用扫描分子测量法的测定前即可，可以在任意的时点进行。具体而言，既可以对于与发光探针混合而调制试样溶液前的被检试样进行浓缩处理，也可以对于调制后的试样溶液进行浓缩处理。
[0137]具体而言，本发明的第一方式的目标粒子的检测方法(以下，第一检测方法)为检测在试样溶液中分散并随机运动的粒子的方法，具有下述工序(a)?(C)。
[0138](a)将被检试样浓缩以提高前述被检试样中的目标粒子的浓度的工序；(b)调制包含前述工序(a)中被浓缩的被检试样和用以与前述目标粒子结合的发光探针的试样溶液，使前述目标粒子与前述发光探针在前述试样溶液中结合的工序；和
[0139](C)计数前述工序(b)中调制的试样溶液中存在的、与发光探针结合的目标粒子的个数的工序；
[0140]另外，在前述发光探针与前述目标粒子结合的状态下、和以前述发光探针单独存在的状态下发出的光的发光特性不同。
[0141]本实施方式中，“在试样溶液中分散并随机运动的粒子”是指在试样溶液中分散或溶解的原子、分子或者它们的聚集体等粒子(可以为发光的粒子或不发光的粒子的任一者。)，是指非固定于基板等而在溶液中自由地进行布朗运动的粒子。
[0142]目标粒子为在试样溶液中分散并随机运动的粒子，是用于定量试样溶液中的浓度的粒子。作为目标粒子，可列举出例如:蛋白质、肽、核酸、核酸类似物质、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚集体等生物分子、病毒、细胞等粒子状的生物学的对象物或非生物学的粒子(例如:原子、分子、胶束、金属胶体等)等。核酸可以为DNA，也可以为RNA，也可以为cDNA这样的人工扩增物质。
[0143]核酸类似物质可列举DNA或RNA这类天然类型核苷酸(天然存在的核苷酸)的侧链等被氨基等官能团修饰的物质、用蛋白质或低分子化合物等标记的物质等。更具体而言，可列举出例如:交联核酸(BNA, Bridged nucleic acid)、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子取代的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2’位羟基被甲氧基取代的核苷酸、己糖醇核酸(HNA, Hexitol Nucleic Acid)、妝核酸(PNA)等。
[0144]本实施方式中使用的发光探针为与目标粒子特异地或非特异地结合或者吸附的物质，只要是在与目标粒子结合的状态与单独存在的状态下发出的光的发光特性不同的物质，就没有特别的限定。例如，也可以为使发光物质结合在与目标粒子特异地或非特异地结合或者吸附的物质上而成的物质。作为发光物质，典型地为荧光性物质，但也可以为通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等发出光的物质。作为荧光物质，只要是由特定波长的光照射就发出荧光的物质即可，没有特别的限定，可以从用于FCS或FIDA等的荧光色素中适当的选择使用。
[0145]例如，目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，发光探针可列举出:使与目标粒子杂交的寡核苷酸结合荧光物质等发光物质而成的物质、结合有荧光物质等发光物质的核酸结合性蛋白质、与核酸结合的色素分子等。作为寡核苷酸，可以为DNA，也可以为RNA，也可以为cDNA这样的人工扩增物质。可以为包含部分或全部核酸类似物质的物质；所述核酸类似物质能够与天然的核酸碱基同样地形成核苷酸链或碱基对。另外，目标粒子为蛋白质的情况下，作为发光探针，可以使用将目标粒子的抗原或抗体、目标粒子的配体或受体用荧光物质等发光物质标记了的物质。需要说明的是，与核酸、蛋白质等目标粒子特异或非特异地结合或吸附的物质与发光物质的结合可以通过常规方法进行。
[0146]本实施方式中使用的发光探针可以为与目标粒子非特异地结合等的物质。从目标粒子的检测/定量的精度的观点出发，优选特异地结合等的物质。需要说明的是，作为与目标粒子特异地结合的发光探针，只要是与物理或化学的性质与目标粒子类似的其他物质相比更优先与目标粒子结合的物质即可，不需要与除了目标粒子以外的物质完全地不结合的物质。例如，目标粒子为核酸的情况下，被作为发光探针使用的发光物质标记的寡核苷酸既可以具有与目标粒子的喊基序列完全地互补的喊基序列，也可以具有与该目标粒子的喊基序列错配的碱基序列。
[0147]另外，在发光探针与目标粒子结合的状态以及发光探针单独存在的状态下发光探针的发光特性不同是指:在发光探针与目标粒子结合的状态以及发光探针单独存在的状态下，特定的波长的光强度不同。使发光探针单独存在的状态以及发光探针与目标粒子结合的状态下特定波长的光的强度不同(例如，使荧光强度不同)，由此能够在扫描分子计数法中区别地检测出两者。
[0148]目标粒子为蛋白质的情况下，与蛋白质结合且改变周围环境时荧光强度、荧光波长变化的色素(例如，疏水性探针ANS、MANS、TNS这类的荧光色素)可以作为发光探针使用。另外，发光探针也可以其自身不发光。例如，目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，使用与目标粒子杂交的寡核苷酸作为发光探针，即便在试样溶液中与发光探针一起添加与双链结构特异地结合的荧光性双链核酸结合物质，也能够在发光探针单独存在的状态以及发光探针与目标粒子结合的状态下使发光特性不同。作为与双链结构特异地结合的荧光性双链核酸结合物质，可列举出荧光性嵌入剂或结合了荧光物质的沟结合剂等。
[0149]其他的，可以使用例如:由至少两个构成要素形成的的、通过与目标粒子结合而使前述的至少两个构成要素的相互位置变化而发出荧光的物质作为发光探针。作为这样的物质的例子，可列举出:与某粒子结合时结构变化而发出强的荧光的荧光性蛋白质、或者与某粒子结合时聚集而形成荧光性金属络合物的分子(络合物的配体)。通过这样的构成，在所有情况下，单独的发光探针或不与目标粒子结合的发光探针均几乎不发光，或者即便发光与目标粒子和发光探针的结合体的波长不同，所以能够选择地检测由目标粒子和发光探针的结合体发出的光。
[0150]另外，通过利用荧光共振能量转移现象(FRET)，能够使试样溶液中单独存在的发光探针、和与目标粒子结合的状态的发光探针的发光特性不同。例如，作为发光探针可以使用如下物质:使在FRET中成为能量供体的荧光物质和成为能量受体的物质(荧光物质、猝灭物质)按照在发光探针单独存在的状态下产生FRET、在与目标粒子结合的状态下不产生FRET的方式在与目标粒子结合的物质上结合而形成的物质。与目标粒子结合后的发光探针不再产生FRET，所以由成为能量供体的荧光物质发出荧光。另外，从单独存在的核酸探针中，检测不到由成为能量供体的荧光物质发出的荧光，或检测到的荧光是减弱的。因此，通过检测由成为能量供体的荧光物质发出的荧光，能够与单独存在的发光探针区别地检测到与发光探针结合的目标粒子。
[0151]例如，目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，可以优选使用分子信标探针作为发光探针；该分子信标探针如下形成:使FRET中成为能量供体的荧光物质和成为能量受体的物质按照单链核酸分子的状态下产生FRET、与其他单链核酸分子杂交形成缔合体的状态下不产生FRET的方式在当为单链核酸分子的状态时形成分子内结构体的寡核苷酸上结合。本实施方式中优选的是:3’末端侧结合有成为能量供体的荧光物质或成为能量受体的物质、5’末端侧结合有剩余的另一者并且3’末端侧区域和5’末端侧具有彼此互补的碱基序列，这些碱基序列形成碱基对由此形成分子内结构(所谓的茎-环结构)的物质。需要说明的是，分子信标探针的形成分子内碱基对的彼此互补的区域，可以夹着与目标粒子杂交的区域而存在。因此，3’末端侧的区域和5’末端侧的区域既可以为分别包含3’末端或5’末端的区域，也可以为不包含3’末端或5’末端的区域。此外，就形成碱基对的区域的碱基数或碱基序列而言，为所形成的碱基对的稳定性低于与目标粒子的缔合体、且在检测条件下能够形成碱基对的程度即可。
[0152]另外，使用与双链结构特异地结合的荧光性双链核酸结合物质，即便荧光性双链核酸结合物质与标记了发光探针的荧光物质之间产生FRET，也能够区别单独存在的发光探针和与目标粒子结合的发光探针。即，荧光性双链核酸结合物质和标记了发光探针的荧光物质中的任一者成为FRET的能量供体，另一者成为FRET的能量受体。由单独存在的发光探针，检测到由标记所述发光探针的荧光物质发出的荧光。与此相对，与目标粒子结合的发光探针和荧光性双链核酸结合物质结合，所以由结合体能够检测到由FRET发出的荧光。结果，能够与单独存在的发光探针区別而检测。
[0153]此外，当进入发光探针与目标粒子的缔合体的碱基对之间的荧光性嵌入剂的量过多时，检测自FRET发出的荧光时的背景变得过高，存在影响检测精度的可能性。因此，优选将发光探针设计成在发光探针与目标粒子的缔合体中形成双链的区域为400bp以下。
[0154]其他的，本实施方式中，也可以使用两种发光探针。例如，在目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，将两种发光探针设计成相对于目标粒子相互邻接而杂交，将一者的发光探针用FRET中的成为能量供体的荧光物质标记，将另一者的发光探针用FRET中的成为能量受体的物质标记。该情况下，单独存在的发光探针不产生FRET，而通过与目标粒子结合，两种发光探针相互接近而产生FRET。因此，通过检测自FRET发出的荧光，能够检测出与发光探针结合的目标粒子。
[0155]另外，提供给本实施方式的被检试样，只要是预期包含目标粒子的试样，就没有特别的限定，既可以为生物试样，也可以为人工调制的试样。目标粒子为核酸分子的情况下，作为被检试样，可列举出例如:将细胞、组织、细菌可溶化并使核酸成分分散于液体中而成的溶液、包含通过PCR法扩增的核酸成分的溶液等。
[0156]以下，对于每个工序进行说明。
[0157]首先，作为工序(a)，将被检试样浓缩以提高被检试样中的目标粒子的浓度。对于浓缩方法，没有特别的限定，可以适宜使用将与目标粒子同种的物质浓缩、分离或精制时所应用的公知的化学/分子生物学的手法等。例如，通过加温/加热或减压等将溶剂蒸发或蒸散的方法、通过超滤去除溶剂的方法等只将被检试样中的溶剂去除而提高目标粒子的浓度即可。另外，从被检试样中只将目标粒子、或者将目标粒子和与目标粒子物理或化学性质近似的物质一起分离/精制之后，使之溶解或分散于体积比分离/精制前的被检试样的体积少的适当的溶剂中，由此能够调制被浓缩的被检试样。对于使被分离/精制的目标粒子溶解等的溶剂，没有特别的限定，优选不阻碍利用扫描分子计数法检测与目标粒子结合的发光探针的溶剂。作为该溶剂，可列举出例如:水、PBS(磷酸缓冲生理盐水、pH7.4)等磷酸缓冲液、Tris缓冲液等。
[0158]在扫描分子计数法中，测定溶液中包含以具有自身荧光的物质为代表的各种各样的物质的情况下，成为非特异信号的产生或透过的光路的阻碍等障碍的原因。因此，本实施方式中，相比于简单地去除溶剂而浓缩，更优选从被检试样中只将目标粒子、或者将目标粒子和与目标粒子物理或化学性质近似的物质一起进行分离/精制而浓缩。
[0159]目标粒子为核酸分子的情况下，从被检试样中仅选择地回收核酸分子、并将回收的核酸分子溶解于适当的溶剂中，由此能够调制被浓缩的被检试样。对于从被检试样中选择地回收核酸分子的方法，没有特别的限定，可以从已知的核酸精制方法中适宜选择并使用。例如，可以通过乙醇沉淀法选择地使核酸分子沉淀，使得到的沉淀物溶解于水等适当的溶剂中。另外，也可以通过使被检试样与无机支撑体接触，使被检试样中的核酸分子吸附于无机支撑体之后，使吸附的核酸分子由无机支撑体脱附。
[0160]上述的无机支撑体可以使用能够吸附核酸分子的已知的无机支撑体。另外，对于无机支撑体的形状也没有特别的限定，既可以为粒子状，也可以为膜状。作为无机支撑体，可列举出例如:硅胶、二氧化硅质氧化物、玻璃、硅藻土等含二氧化硅颗粒(珠)；尼龙、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、硝基纤维素等多孔膜等。进一步，使用在铁氧体等金属粒子表面上涂布有聚苯乙烯等聚合物的磁性粒子的情况下，也能够实施磁性粒子表面的化学修饰，而吸附核酸分子。作为使吸附的核酸分子从无机支撑体脱附的溶剂，可以适宜使用为了将核酸分子从这些公知的无机支撑体脱附而通常使用的溶剂。作为该用于脱附的溶剂，特别优选纯化水。需要说明的是，优选将吸附了核酸分子的无机支撑体使用适当的洗涤缓冲液进行洗涤之后，使核酸分子从无机支撑体脱附。
[0161]也可以从被检试样中将蛋白质等除了核酸分子以外的分子去除而调制核酸分子被浓缩的被检试样。例如，向被检试样中添加一种或两种以上离液盐、有机溶剂、表面活性剂等通常作为蛋白质的变性剂而使用的化合物而使被检试样中的蛋白质变性，之后通过离心分离处理使变性蛋白质沉淀而只回收上清，由此能够从被检试样中去除蛋白质。使用前述无机支撑体，从得到的上清中回收核酸，由此能够调制被浓缩的被检试样。回收的上清的体积少于添加蛋白质的变性剂之前的被检试样的体积情况下，也可以将该上清直接作为被浓缩的被检试样使用。
[0162]作为蛋白质的变性剂而使用的离液盐，可列举出例如:盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠、高氯酸钠以及三氯乙酸钠等。作为蛋白质的变性剂而使用的表面活性剂，可以为非离子性表面活性剂，可以为阴离子性表面活性剂，也可以为阳离子性表面活性剂。作为非离子性表面活性剂，可列举出例如:1'?的1180、0^?5(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐)、TritonX-100、Tween20等。作为阴离子性表面活性剂，可列举出例如:SDS所代表的烷基硫酸钠、胆酸钠、N-十二烷基肌氨酸等。作为阳离子性表面活性剂，可列举出例如:CDAB所代表的烷基季铵等。作为蛋白质的变性剂而使用的有机溶剂，优选苯酚。苯酚既可以为中性也可以为酸性。使用酸性的苯酚的情况下，相比于DNA，能够选择性地将RNA提取至水层。
[0163]其他的，对于被检试样使用蛋白质去除剂而使蛋白质聚集，之后通过固液分离处理回收液体成分，由此能够调制核酸分子被浓缩的被检试样。具体而言，对被检试样添加蛋白质去除剂之后搅拌或静置使蛋白质聚集之后，进行离心分离处理而回收上清。
[0164]作为蛋白质去除剂，例如可以使用尚子交换树脂等对于蛋白质未和性闻的物质。
[0165]另外，也可以通过从被检试样中特异地回收目标粒子，进行工序(a)的浓缩。例如，可以通过使用凝胶过滤法、超滤法、HPLC法、电泳法等通常的化学的/分子生物学的手法，从被检试样中特异地回收目标粒子。其他的，通过使被检试样接触负载有与目标粒子特异地结合的物质的载体，使被检试样中的目标粒子与载体结合，之后，从载体放出目标粒子，由此能够特异地回收目标粒子。通过将放出后的目标粒子溶解或分散于体积少于原来的被检试样的体积的适当的溶剂中，能够调制被浓缩的被检试样。作为与目标粒子特异地结合的物质，在目标粒子为核酸分子的情况下可列举出例如与目标粒子杂交的寡核苷酸。另外，在目标粒子为蛋白质分子的情况下，作为与目标粒子特异地结合的物质，可列举出与目标粒子有抗原和抗体、或者配体与受体的关系的分子。
[0166]工序(a)中调制的被浓缩的被检试样中的目标粒子的浓度，高于浓缩前的被检试样中的目标粒子的浓度即可。通过预先将被检试样进行浓缩，在接下来的工序(b)中，能够调制目标粒子的浓度更高的试样溶液。如前述，扫描分子计数法测定所需要的时间依赖于供于测定的试样溶液中的目标粒子的浓度。即，相比于不预先将被检试样浓缩的情况，第一检测方法能够在更短时间内进行测定。
[0167]接着，作为工序(b)，调制包含工序(a)中被浓缩的被检试样和用以与所述目标粒子结合的发光探针的试样溶液，在该试样溶液中，使前述目标粒子与前述发光探针结合。具体而言，首先，在被浓缩的被检试样中添加发光探针，调制试样溶液。此时，也可以根据需要，进一步添加适当的溶剂。该溶剂，只要是不阻碍利用扫描分子计数法检测由与目标粒子结合的发光探针发出的光的溶剂，就没有特别的限定；可以从该【技术领域】中通常使用的缓冲液中适宜选择而使用。
[0168]作为该缓冲液，可列举出例如:PBS(磷酸缓冲生理盐水、pH7.4)等磷酸缓冲液、Tris缓冲液等。
[0169]对于工序(C)中的试样溶液中的目标粒子的浓度或数密度，没有特别的限定。从缩短扫描分子计数法的测定时间的观点出发，优选试样溶液中的目标粒子的浓度高。但是，有浓度过高时反而测定精度降低的可能性。因此，工序(b)中优选将试样溶液调制成:试样溶液中的目标粒子的数密度是相对于前述光检测区域的体积(Vd)为I分子以下。例如，试样溶液中的目标粒子的浓度Xt (M)优选满足Xt.Na.Vd≤I (Na为阿伏加德罗常数)。另外，为了充分地缩短测定时间，试样溶液中的目标粒子的浓度Xt(M)优选满足I X 10_4 ≤Xt.Na.Vd ≤ 10例如，Vd为IfL的情况下，试样溶液中的目标粒子的浓度Xt优选为PM级的浓度。
[0170]只是使目标粒子与发光探针共存于相同的溶液中就能够使两者结合的情况下，调制试样溶液之后，只需根据需要以规定时间孵育试样溶液，就能使目标粒子与发光探针在试样溶液中结合。
[0171]另一方面，目标粒子、发光探针为双链结构的核酸分子或者核酸类似物质的情况下，优选使试样溶液中的核酸等变性之后使目标粒子与发光探针缔合。需要说明的是，“使核酸分子或核酸类似物质变性”是指使碱基对解离。例如，使分子信标探针中彼此互补的碱基序列所形成的碱基对解离，解开分子内结构成为单链结构，或使双链核酸分子成为单链核酸分子。此外，当发光探针是包含PNA等核酸类似物质的寡核苷酸时，即使目标粒子是双链核酸分子，有时不进行特别的变性处理也可以形成包含发光探针和目标粒子的缔合体。
[0172]作为变性处理，可列举出:利用高温处理的变性(热变性)或利用低盐浓度处理的变性等。其中，热变性对于荧光物质等发光物质的影响比较小且操作简便，所以优选进行热变性。具体而言，热变性中，通过对试样溶液实施高温处理而使试样溶液中的核酸分子等变性。通常地，DNA在90°C下、RNA在70°C下保温数秒至2分钟左右，能够使之变性；但根据目标粒子的碱基的长度等进行变性的温度也不同只要能够变性就对其温度没有限定另一方面，通过低盐浓度处理进行变性可以是例如利用纯水等稀释，将该试样溶液的盐浓度调整至足够低，从而进行。
[0173]根据需要进行了变性之后，使前述试样溶液中的目标粒子与发光探针缔合。
[0174]当进行热变性时，在高温处理后，使该试样溶液的温度降至目标粒子能够与发光探针特异地杂交的温度，由此能够使该试样溶液中的目标粒子与发光探针适当缔合。另外，当通过低盐浓度处理进行变性时，通过添加盐溶液等，使该试样溶液的盐浓度升高至目标粒子能够与发光探针特异地杂交的浓度，能够使该试样溶液中的目标粒子与发光探针适当
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[0175]需要说明的是，可以根据目标粒子与发光探针形成的缔合体的熔解曲线，求出两条单链核酸分子能够特异地杂交的温度。例如可以使仅含有目标粒子和发光探针的溶液的温度从高温向低温变化，测定溶液的吸光度或荧光强度来求出熔解曲线。根据所获得的熔解曲线，从变性的两条单链核酸分子开始形成缔合体的温度，至几乎全部成为缔合体的温度这一范围内的温度,都可以作为两者能够特异地杂交的温度。也可以用使溶液中的盐浓度自低浓度向高浓度变化来代替温度，同样地确定熔解曲线，能够求出两条单链核酸分子能够特异地杂交的浓度。
[0176]通常可以用Tm值(熔解温度)，代替两条单链核酸分子能够特异地杂交的温度。例如，利用普遍使用的引物/探针设计软件等，根据发光探针的碱基序列信息，能够计算与目标粒子杂交的区域的Tm值(双链DNA的50%解离为单链DNA的温度)。
[0177]此外，为了抑制非特异杂交，在形成缔合体时，优选使试样溶液的温度较缓慢地下降。例如，使试样溶液温度为70°C以上而使核酸分子变性后，可以按0.050C /秒以上的降温速度，降低试样溶液的液温。
[0178]此外，为了抑制非特异地杂交，优选预先在试样溶液中添加表面活性剂、甲酰胺、二甲亚砜或尿素等。这些化合物可以只添加一种，也可以组合添加2种以上。通过添加这些化合物，在较低温度环境下也能够防止非特异杂交的发生。
[0179]之后，作为工序(C)，通过扫描分子计数法计数调制的试样溶液中与发光探针结合的目标粒子的个数。具体而言，将目标粒子与发光探针结合后的试样溶液设置于用于前述扫描分子计数法的光分析装置。接着，通过前述的手法，检测并解析由与目标粒子结合的状态的发光探针发出的光，由此计数与发光探针结合的目标粒子的个数。计数的目标粒子数为测定试样中所含的目标粒子的个数。
[0180]另外，本实施方式的目标粒子的检测方法中，即便在调制包含被检试样和发光探针的试样溶液之后对试样溶液进行浓缩处理来提高试样溶液中的目标粒子的浓度，也能够得到与第一检测方法同样的效果。
[0181]具体而言，本发明的第二方式的目标粒子的检测方法(以下，第二检测方法)为检测在试样溶液中分散并随机运动的粒子的方法，具有下述工序(a’)?(C’)。进一步，本发明的第二方式的目标粒子的检测方法中，在工序(a’ )之后或工序(b’ )之后，进行浓缩处理以提高试样溶液中的目标粒子的浓度。
[0182](a’ )调制包含被检试样、和用以与目标粒子结合的发光探针的试样溶液的工序；
[0183](b’)使前述目标粒子与前述发光探针在前述工序(a’)中调制的试样溶液中结合的工序；
[0184](c’ )计数前述工序(b’ )中调制的试样溶液中存在的、与发光探针结合的目标粒子的个数的工序。
[0185]工序(a’ )和(b’ )可以与前述工序(b)同样地进行。另外，工序(c’ )可以与前述工序(C)同样地进行。
[0186]在工序(a’ )之后进行的浓缩处理只要是不阻碍接下来的工序(b’ )中进行的目标粒子与发光探针的结合的处理，就没有特别的限定，可以从将与目标粒子同种的物质进行浓缩、分离或精制时使用的公知的化学/分子生物学的手法等中适宜选择并使用。在工序(b’)后进行的浓缩处理，只要是能够浓缩且不使工序(b’)中形成的目标粒子与发光探针的结合体损失或减少的处理，就没有特别的限制，可以从将与目标粒子同种的物质进行浓缩、分离或精制时使用的公知的化学/分子生物学的手法等中适宜选择并使用。
[0187]具体而言，例如，通过加温/加热或减压等将溶剂蒸发或蒸散的方法、通过超滤去除溶剂的方法等只将被检试样中的溶剂去除而提高目标粒子的浓度即可。另外，从被检试样中将目标粒子和发光探针单独地分离/精制之后，或者和与目标粒子和发光探针物理或化学的性质近似的物质一起分离/精制之后，使之溶解或分散于体积比分离/精制前的试样溶液的体积少的适当的溶剂中，由此能够调制被浓缩的被检试样。
[0188]目标粒子和发光探针均为核酸分子的情况下，在工序(a’)之后或工序(b’ )之后进行的浓缩处理可以与前述工序(a)中目标粒子为核酸分子的情况下所例示的浓缩处理同样地进行。
[0189]对于工序(c’)中的试样溶液中的目标粒子的浓度或数密度，没有特别的限定。与第一检测方法中的工序(C)同样地，从缩短扫描分子计数法的测定时间的观点出发，优选试样溶液中的目标粒子的浓度高。但是，有浓度过高时反而测定精度降低的可能性。因此，优选将试样溶液浓缩成为:试样溶液中的目标粒子的数密度是相对于前述光检测区域的体积(Vd)为I分子以下。例如，试样溶液中的目标粒子的浓度Xt(M)优选满足XT/NA/Vd< 1(Na为阿伏伽德罗常数)。
[0190]实施例
[0191]接着，以下示出实施例等，进一步详细说明本发明，但本发明的实施方式不限于下列实施例。
[0192][实施例1]
[0193]对于直接通过扫描分子计数法检测被检试样中的目标粒子的情况、和将被检试样中的目标粒子浓缩之后通过扫描分子计数法检测的情况，比较所计数的目标粒子。
[0194]以单链核酸分子作为目标粒子，将具有与单链核酸分子互补的碱基序列并且5’末端结合有ATTO (注册商标)647N(ATT0-TEC公司制)的单链核酸分子作为发光探针，使用目标粒子与发光探针杂交而成的荧光标记双链核酸分子(SOObp)作为与发光探针结合的目标粒子。
[0195]首先，调制荧光标记双链核酸分子的InM溶液作为被检试样。将荧光标记双链核酸分子溶液分注至2根1.5mL离心管中各200 μ L。向各离心管中加入3Μ的醋酸钠溶液20 μ L进行搅拌之后，加入500 μ L的99.5%乙醇搅拌之后，在室温下静置10分钟。之后，将各离心管在20，000 X g下进行10分钟离心分离处理而去除上清。向得到的沉淀中加入70%乙醇500 μ L进行搅拌之后，20，OOOXg下进行10分钟离心分离处理，去除上清。向一离心管中得到的沉淀中加入200 μ L的TE缓冲液，向另一离心管中得到的沉淀中加入20 μ L的TE缓冲液，分别搅拌使沉淀溶解。将由200 μ L的TE缓冲液调制的物质作为通常被检体、将由20 μ L的TE缓冲液调制的物质作为浓缩被检体。
[0196]将各被检体作为试样溶液，通过扫描分子计数法计数荧光标记双链核酸分子的分子数。另外，作为对照，只将TE缓冲液作为试样溶液进行计数。具体而言，在测量中，光分析装置使用具备共聚焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光检测装置MF20 (Olympus Corporation)。接着,对于上述的各试样溶液,取得按照时间顺序的光子计数数据。此时，激发光使用633nm的激光，在旋转速度6，000rpm、300yW下进行照射，检测光波长使用带通滤波器设为660~710nm。从雪崩光电二极管获得的信号的BIN TIME设为10 μ秒，测定时间为2秒或20秒。
[0197]用Savinzky-Golay算法将由测定获得的按照时间顺序的数据进行平滑化以后，通过微分进行峰检测。从被视为峰的区域中，提取可以拟合为高斯函数的区域作为信号。
[0198]将计数结果示于图8Α、图8Β和表1中。图8Α表示光子数的测定结果。图8Β表示峰数的测定结果。图8Α、图SB和表1中，“缓冲液”表示只将作为对照的TE缓冲液作为试样溶液而计数的结果。结果，浓缩被检体的2秒测定的光子数/峰数相当于无浓缩的通常被检体的20秒测定。即可知，即便是相同的被检试样，通过在利用扫描分子计数法测定之前预先浓缩，能够缩短测定时间。
[0199][表 I]
[0200]
【权利要求】
1.一种目标粒子的检测方法， 其为检测在试样溶液中分散并随机运动的粒子的方法，具有: (a)将被检试样浓缩以提高所述被检试样中的目标粒子的浓度的工序；(b)调制包含所述工序(a)中被浓缩的被检试样和用以与所述目标粒子结合的发光探针的试样溶液，使所述目标粒子与所述发光探针在所述试样溶液中结合的工序；和 (C)计数所述工序(b)中调制的试样溶液中存在的、与发光探针结合的目标粒子的个数的工序； 在所述发光探针与所述目标粒子结合的状态下、与所述发光探针单独存在的状态下发出的光的发光特性不同， 所述工序(C)中的与发光探针结合的目标粒子的个数的计数通过如下工序进行: 使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，在所述试样溶液内移动所述光学系统的光检测区域的位置的工序； 一边在所述试样溶液内移动所述光学系统的光检测区域的位置，一边检测由所述光检测区域中的与所述目标粒子结合状态的所述发光探针发出的光信号，逐个检测与发光探针结合的目标粒子的工序；和 将所述逐个检测的与发光探针结合的目标粒子的个数进行计数而计数所述光检测区域的位置的移动中检测到的所述目标粒子的个数的工序。
2.根据权利要求1所述的目标粒子的检测方法，其中，所述工序(c)中的试样溶液中的目标粒子的数密度是相对于所述光检测区域的体积Vd为I分子以下。
3.根据权利要求1或2所述的目标粒子的检测方法，其中，所述目标粒子为核酸，所述工序(a)为从所述被检试样中精制核酸、进行浓缩的工序。
4.根据权利要求1或2所述的目标粒子的检测方法，其中，所述工序(a)为从所述被检试样中特异地回收目标粒子、进行浓缩的工序。
5.根据权利要求1~4的任一项所述的目标粒子的检测方法，其中，在所述移动光检测区域的位置的工序中，所述光检测区域的位置以规定的速度移动。
6.根据权利要求1~5的任一项所述的目标粒子的检测方法，其中，在所述移动光检测区域的位置的工序中，以比所述与发光探针结合的目标粒子的扩散移动速度更快的速度移动所述光检测区域的位置。
7.根据权利要求1~6的任一项所述的目标粒子的检测方法，其中，在由所述检测到的光检测来自每个与发光探针结合的目标粒子的光信号而逐个检测所述与发光探针结合的目标粒子的工序中，根据检测到的按照时间顺序的光信号的形状，检测到一个与发光探针结合的目标粒子进入了所述光检测区域。
8.根据权利要求1~7的任一项所述的目标粒子的检测方法，其中， 所述发光探针具有相互接近时产生荧光共振能量转移现象的能量供体部位和能量受体部位，并且，在所述发光探针与所述粒子结合的状态以及所述发光探针不与所述粒子结合的状态之间，所述能量供体部位与所述能量受体部位的距离不同； 在所述发光探针与所述目标粒子结合的状态下、与所述发光探针单独存在的状态下，由所述发光探针发出的光的发光特性不同。
9.根据权利要求1~8的任一项所述的目标粒子的检测方法，其中，所述目标粒子为核酸， 所述发光探针与所述目标粒子特异地杂交，并且所述发光探针为单链核酸，该单链核酸上结合有荧光共振能量转移现象中的成为能量供体的荧光物质以及成为能量受体的物质的至少一者。
10.一种目标粒子的检测方法， 其为检测在试样溶液中分散并随机运动的粒子的方法，具有: (a’ )调制包含被检试样、和用以与目标粒子结合的发光探针的试样溶液的工序； (b’)使所述目标粒子与所述发光探针在所述工序(a’)中调制的试样溶液中结合的工序；和 (c’ )计数所述工序(b’ )中调制的试样溶液中存在的、与发光探针结合的目标粒子的个数的工序； 所述发光探针在与所述目标粒子结合的状态下以及单独存在的状态下发出的光的发光特性不同； 所述工序(C’ )中的与发光探针结合的目标粒子的个数的计数通过如下工序进行:使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，在所述试样溶液内移动所述光学系统的光检测区域的位置的工序； 一边在所述试样溶液内移动所述光学系统的光检测区域的位置，一边检测由所述光检测区域中的与所述目标粒子结合状态的所述发光探针发出的光信号，逐个检测与发光探针结合的目标粒子的工序；和 将所述逐个检测的与发光探针结合的目标粒子的个数进行计数而计数所述光检测区域的位置的移动中检测到的所述目标粒子的个数的工序； 在所述工序(a’ )之后或所述工序(b’ )之后进行浓缩处理以提高所述试样溶液中的目标粒子的浓度。
【文档编号】G01N21/64GK103620388SQ201280029647
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2012年6月27日 优先权日:2011年6月27日
【发明者】西川和孝 申请人:奥林巴斯株式会社