用于检测液态介质中纤溶酶原的方法、相关组合物及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于检测试样中纤溶酶原的方法，所述方法具体包括将链激酶（R1）和链激酶激活剂与校核液或稀释血浆试样进行反应，其中所述链激酶激活剂选自纤维蛋白DD片段和/或至少一种DD片段衍生物组成的组。本发明还涉及液态组合物、用于实现该方法的纤溶酶原检测试剂盒以及选自纤维蛋白DD片段和/或至少一种DD片段衍生物组成的组的链激酶激活剂的用途。
【专利说明】用于检测液态介质中纤溶酶原的方法、相关组合物及试剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于检测试样中纤溶酶原的方法，具体的涉及通过液体试剂来检测试样中纤溶酶原的方法，更具体的涉及通过可以长期保存的即用型试剂来检测试样中纤溶酶原的方法。
[0002]此类检测要求激活试样中的纤溶酶原，这一般是利用链激酶来实现的。
[0003]关于此点，溶液由链激酶和链激酶激活剂(纤维蛋白原)组成。但是，纤维蛋白原难以以液体形态保存，导致检测结果会随着纤维蛋白原的保存时间做函数变化。
【背景技术】
[0004]因此，为了克服以上缺陷，第5879823号美国专利公开了一种利用氨基酸确定的寡肽来进行稳定的纤溶酶溶液。该溶液并不完全令人满意，因为它仅局限于所述纤溶酶溶液的稳定，而不适用于纤溶酶原激活剂溶液(如纤维蛋白原)的稳定。另外，该溶液也无法满足利用在病 人抽血很久之前制备的即用型液体制剂对患者血液中存在的纤溶酶原进行检测的需要。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服现有技术的缺陷并具体的提供用于检测试样中纤溶酶原的方法，所述方法包括以下步骤:
a将反应物i，即链激酶和链激酶激活剂，与反应物ii，即校核液或稀释血浆试样，进行反应；
b利用反应追踪物(SPm)来追踪所述反应；
c确定所述校核液或稀释血浆试样中纤溶酶原的量，将其作为所述反应追踪结果的函数。
[0006]在优选【具体实施方式】中，所述方法由以上步骤组成。
[0007]根据本发明的方法中所使用的链激酶激活剂为一种或多种化合物，所述化合物选自纤维蛋白DD片段和/或DD片段衍生物组成的组。所述的DD (或D-二聚体)片段，是指含有两个来自不同纤维蛋白原(fibrogen)分子的交叉连接D区域的纤维蛋白的次级片段，其可通过例如纤维蛋白酶解法来获得。
[0008]因此，本发明所使用的DD片段可以来自纤维蛋白或裂解的血凝块。也可以使用重组DD片段。还可以使用不纯DD片段，例如纤维蛋白降解碎片。所述DD片段衍生物是指包括至少某些上述DD片段的分子，特别是链激酶激活过程中所涉及的DD片段的氨基酸。在优选具体实施里中，所述衍生物与所述DD片段具有至少70%的序列一致性，更优选的具有至少80%的序列一致性，最优选的具有至少90%或95%以上的序列一致性。
[0009]在一个优选实施方式中，所述DD片段衍生物可以包括例如比DD片段更多的氨基酸并且包括例如D- 二聚体/片段E复合物。[0010]所述反应追踪物或化合物(SPm)可以为例如接枝在基材、链激酶和链激酶激活剂形成的酶产物或所述酶上的分子。所述接枝可以通过例如化学合成来进行。所述反应追踪物或化合物(SPm)也可以为能够与基材、所述酶的产物或所述酶相连的分子。
[0011]被选定的所述追踪物或化合物能够通过例如生成颜色或荧光或导致颜色或荧光消失或是通过改变所述反应介质的吸光度来追踪所述酶的反应。
[0012]在优选【具体实施方式】中，反应追踪化合物为专门用于纤溶酶和纤溶酶-链激酶复合物的显色基材。此类化合物在本领域内已知的例子包括但不限于由Chromogenix出售的S-2403? 和 S-2251? 以及 Hyphen Biomed 公司出售的 SPm41。
[0013]在优选【具体实施方式】中，所述反应可以在抗凝剂存在的情况下进行，所述抗凝剂优选的为水蛭素或任何其它凝血酶抑制剂。
[0014]优选的，所述方法包括在反应步骤a之前的将所述链激酶激活剂存放在即用型溶液中的步骤。因此，所述方法并不要求在使用前才制备链激酶激活剂溶液。另外，所述链激酶激活剂在溶液中处于稳定状态并可与例如链激酶共同保存，而不会改变其理化性质和在所述纤溶酶原检测进行中的效能。在优选【具体实施方式】中，所述链激酶和链激酶激活剂可以共同封装。
[0015]在优选【具体实施方式】中，所述链激酶激活剂存放步骤在温度处于-20°C和37°C之间时进行。在优选【具体实施方式】中，所述链激酶激活剂的存放温度为2-10°C，更优选的为4_8°C。在优选【具体实施方式】中，所述链激酶激活剂适于存放在室温下或不要求特定存放条件。
[0016]根据本发明的 一个【具体实施方式】，所述存放步骤可以持续12小时以上，优选的持续24小时至24个月，更优选的持续24小时至18个月。
[0017]作为可选项，所述链激酶激活剂在防腐剂和/或抗生素(如环丙沙星)存在的情况下存放。
[0018]优选的，所述方法还包括在所述反应步骤a之前将所述链激酶(Rl)和链激酶激活剂保持在约37?的预温育(pre-1ncubation)步骤。
[0019]根据本发明的一个【具体实施方式】，所述反应步骤a在约37°C的条件下进行，优选的进行约3至6分钟。
[0020]根据本发明的一个【具体实施方式】，所述反应步骤a通过酸化步骤停止，优选的通过添加柠檬酸来停止。
[0021]本发明的另一个目的涉及用于检测试样中存在的纤溶酶原的组合物，其中所述组合物包括链激酶激活剂，其特征在于所述链激酶激活剂为一种或多种化合物，所述化合物选自纤维蛋白DD片段和/或至少一种DD片段衍生物组成的组。
[0022]在优选【具体实施方式】中，所述组合物还包括抗凝剂，所述抗凝剂优选的为水蛭素。
[0023]在优选【具体实施方式】中，所述组合物为即用型溶液。
[0024]在优选【具体实施方式】中,包括所述链激酶激活剂的所述组合物还包括链激酶。
[0025]在优选【具体实施方式】中，所述组合物适于作为即用型溶液。在优选【具体实施方式】中，所述组合物包括约100μ g/ml或可以简单的稀释至100μ g/ml的浓度(例如100 μ g/ml至lmg/ml的浓度)的链激酶激活剂溶液。在优选【具体实施方式】中，所述组合物在使用前无需进一步处理，也无需进一步稀释。[0026]在优选【具体实施方式】中，所述组合物不包括纤维蛋白原。在更加优选的【具体实施方式】中，所述组合物包括DD片段和/或一种或多种DD片段衍生物，而不包括另一种链激酶激活剂。在更加优选的【具体实施方式】中，所述组合物仅包括一种链激酶激活剂，所述链激酶激活剂优选的为DD片段和/或一种或多种DD片段衍生物。
[0027]本发明还涉及用于检测试样中纤溶酶原的试剂盒，所述试剂盒包括一个或多个上述【具体实施方式】中所述的组合物。
[0028]优选的，所述试剂盒被设置为用于实施上文所述的方法。
[0029]具体而言，本发明涉及用于检测试样中纤溶酶原的试剂盒，所述试剂盒包括链激酶、链激酶激活剂和用于追踪链激酶、链激酶激活剂和稀释血浆试样之间反应的反应追踪物，其中，所述链激酶激活剂为一种或多种化合物，所述化合物选自纤维蛋白DD片段和/或至少一种DD片段衍生物组成的组。更优选的，特定试剂盒设想为供体外使用。这表明所述试剂适于体外使用并可能包括不适于体外使用的试剂，如防腐剂。在优选【具体实施方式】中，所述用于检测试样中纤溶酶原的试剂盒包括链激酶和链激酶激活剂，所述链激酶激活剂选自纤维蛋白DD片段和/或至少一种DD片段衍生物组成的组。在更加优选的【具体实施方式】中，所述试剂盒还包括追踪反应(即链激酶、所述链激酶激活剂和稀释血浆试样之间的反应)的反应追踪(SPm)物。
[0030]在优选【具体实施方式】中，所述链激酶和链激酶激活剂被共同封装在所述试剂盒中。在更加优选的【具体实施方式】中，所述试剂盒中的所述链激酶溶液特别适合以约12500至15000IU/ml的量使用。
[0031]在优选【具体实施方式】中，所述用于检测的试剂盒的特征在于至少一种组合物经过体积和重量校准，从而与校核液或稀释血浆试样反应，以便基于对所述酶与所述基材之间反应的追踪来快速确定所述校核液或所述稀释血浆试样中纤溶酶原的量。
[0032]举例而言，选定所述试剂盒的组合物使得一体积的链激酶/链激酶激活剂组合物与一体积的校核液或稀释血衆试样混合。在优选【具体实施方式】中，选定所述试剂盒的组合物使得所述链激酶溶液的浓度约为12500至15000IU/ml。在优选【具体实施方式】中，所述链激酶激活剂的浓度约为100μ g/ml.本发明的另一个目的是链激酶激活剂在检测试样中的纤溶酶原过程中的用途，所述链激酶激活剂选自纤维蛋白DD片段和/或至少一种DD片段衍生物组成的组。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]通过下文的描述，并结合附图，本发明的其它特征、细节和优点将被进一步阐明。附图如下:
图1是根据本发明的【具体实施方式】的方法的总体图；
图2是纤维蛋白原替换测试中的校准曲线；
图3是具有不同纤维蛋白DD片段浓度的示例性测试中的校准曲线；
图4是示例性【具体实施方式】中用于确定链激酶最佳用量的曲线；
图5展示了经过30°C水浴温育的含有所述DD片段(A)的示例性Rl试剂和作为参照含有纤维蛋白原(B)的示例性Rl试剂的稳定性。
[0034] 为了更加明确，相同或近似要素在所有的图中均以相同的参考标记表示。【具体实施方式】
[0035]参考图1，根据本发明的一个优选方法示例是基于试剂组合物Rl和R2，所述试剂组合物Rl和R2采用例如液体试剂技术(LRT)以即用型液体形态保存。
[0036]所述第一试剂组合物Rl包括所述DD片段。DD通过以下方式获得:通过凝血酶将纤维蛋白原与纤维蛋白凝结以获得凝块；在纤溶酶原存在的条件下通过tPA使所述凝块降解，以生成纤维蛋白降解产物；通过离子交换层析法进一步提纯D-二聚体，如有必要还可以采用补充性质的凝胶过滤层析法。所述第一试剂组合物Rl中DD片段的浓度优选为约0.lmg/ml ;优选的采用包括Tris、Na2EDTA、NaCl和BSA的试剂组合(base matrix),但是也可以采用其它试剂组合。为了进行质量检测，优选的使用‘无Pig’DD片段，即包括微量的纤溶酶原或优选的不含纤溶酶原。
[0037]所述第一试剂组合物Rl还包括至少一种防腐剂(preservative),优选为环丙沙星、0.9g/l的叠氮化钠和0.25ATU/ml的水蛭素。
[0038]最后，所述第一试剂组合物Rl包括链激酶。如上所述，最优选的链激酶激活剂为纤维蛋白D-二聚体。
[0039]所述第二试剂组合物R2包括Hyphen Biomed公司出售的合成基材SPm41、链激酶和纤维蛋白原(或DD片段)，其中所述合成基材SPm41能够在纤溶酶原(pig)存在的条件下释放出对硝基苯胺(paranitroanilin)。R2还可以包括另一个基材,所述另一个基材与所述酶(在此，即所述纤溶酶原-链激酶复合物)的相互反应改变了所述反应介质的吸光度或荧光性。
[0040]优选的，所述第二试剂组合物R2通过酸性pH来缓冲，优选的使用酒石酸。
[0041]在步骤(a1-aii)中，一体积的所述第一试剂组合物Rl与一体积的校核液(cal)或稀释血浆试样(sam)混合，对所得混合物以37°C的温度温育3分钟。
[0042]在步骤(aiii )中，一体积的第二试剂组合物R2被添加至所述混合物并与之混合，然后以37 °C的温度温育3分钟。
[0043]之后，在步骤(b)中，通过改变与所述基材(在此即SPm41)的消耗相关的吸光度或光密度(OD)来观察反应变化。在使用SPm41的情况下，测定405nm处的吸光度。
[0044]吸光度(光密度)的变化使得在步骤(c )中通过例如校准曲线来确定纤溶酶原含量(%plg)成为可能。
[0045]所述反应优选的在步骤(d)中通过例如添加一体积的20g/l的柠檬酸(Η+)来停
止。
[0046]已经进行了多次对比纤溶酶原检测试验，包括使用了已知的纤维蛋白原的(+fbg)、未使用纤维蛋白原的(_fbg)以及通过纤维蛋白衍生物使用纤维蛋白原取代物的，参见下表1:
表1:采用纤维蛋白原取代物的测试:
【权利要求】
1.用于检测试样中纤溶酶原的方法，所述方法包括以下步骤: a将反应物i，即链激酶和链激酶激活剂，与反应物ii，即校核液或稀释血浆试样，进行反应； b利用反应追踪物(SPm)来追踪所述反应； c确定所述校核液或所述稀释血浆试样中纤溶酶原的量，将其作为所述反应追踪结果的函数， 其特征在于所述链激酶激活剂选自纤维蛋白DD片段和/或至少一种DD片段衍生物组成的组。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应步骤a可以在抗凝剂存在的情况下进行，所述抗凝剂优选为水蛭素。
3.根据权利要求1或2所述的方法，还包括在反应步骤a之前的将所述链激酶激活剂存放在即用型溶液中的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述存放步骤在温度处于-20°C和37°C之间时进行。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述存放步骤持续12小时以上，优选的持续24小时至24个月，更优选的持续24小时至18个月。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于所述方法还包括在所述反应步骤a之前将所述链激酶(Rl)和链激酶激活剂保持在约37°C的预温育步骤。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于所述反应步骤a在约37°C的条件下进行，优选的进行约3至6分钟。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于所述反应步骤a通过酸化步骤停止，优选的通过添加柠檬酸来停止。
9.用于检测试样中纤溶酶原的组合物，所述组合物含有链激酶激活剂，其特征在于所述链激酶激活剂选自纤维蛋白DD片段和/或至少一种DD片段衍生物组成的组。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于所述组合物还包括抗凝剂，所述抗凝剂优选为水蛭素。
11.根据权利要求9或10所述的组合物，其特征在于所述组合物存放在即用型溶液中。
12.用于检测试样中纤溶酶原的试剂盒，所述试剂盒含有第一试剂组合物(R1)，所述第一试剂组合物包括: -链激酶和链激酶激活剂，所述链激酶激活剂选自纤维蛋白DD片段和/或至少一种DD片段衍生物组成的组；和 -用于追踪链激酶、链激酶激活剂和稀释血浆试样之间反应的反应追踪物(SPm)。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述反应追踪物以第二试剂组合物的形式提供，所述第二试剂组合物包括专门用于纤溶酶和纤溶酶-链激酶复合物的显色基材。
14.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其中所述第一试剂组合物还包括抗凝剂。
15.含有链激酶激活剂的试剂在检测试样中纤溶酶原中的用途，其特征在于所述链激酶激活剂选自纤维蛋白DD片段和/或至少一种DD片段衍生物组成的组。
【文档编号】G01N33/86GK103946390SQ201280043372
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2012年9月7日 优先权日:2011年9月7日
【发明者】让·埃米雷尔 申请人:希森美康株式会社