制备柱色谱体系的制作方法
【专利摘要】本发明描述了包含混合回路或混合室、气泡捕捉器、浓度检测器和一个或多个泵的色谱体系，其特征在于气泡捕捉器具有在其最高点的固定开口。此外，描述了色谱体系，其特征在于它包含两个浓度检测器，其中第一个位于混合回路或混合室中，且第二个位于主泵下游。
【专利说明】制备柱色谱体系
[0001]本发明涉及制备柱色谱体系。该体系的一个元素是两个NIR检测器的使用，其中一个在色谱柱上游，且一个在色谱柱下游以设置和监控洗脱梯度以及连续地检查所用HPLC柱的质量。另一元素是具有可变密封气泡捕捉器的新设计混合回路，所述气泡捕捉器与体系的混合回路分离并可分流体积流量。
技术背景
[0002]目前，对于某些尺寸单独地建立常规制备HPLC体系，因为体系中的梯度形成不能确切转换成不同的尺寸。另外，工艺条件转移至分析或半制备体系几乎是不可能的。这同样适用于梯度向具有不同设计的体系的转换。
[0003]色谱法中所用洗脱液的应用相关高氮气和气体含量可产生梯度形成期间溶于洗脱液中的气体的释放，其一方面对色谱柱上游的NIR测量以及相应地对梯度形成和它的再现性具有不利影响。另一方面，HPLC柱以及特别是柱填料也受这影响，因为气体在柱填料内也释放，其可导致柱填料内裂纹或不均匀性的形成。在常规HPLC体系中，安装在体系中的气泡捕捉器不能执行完全除气功能，因为如同整个混合回路，它们在压力下。
[0004]US2011/073548报告了分离体系和方法。使液相色谱法中的洗出液带宽最小化报告于EP0444441中。在US4，116，046中，报告了液相色谱体系。用于降低液体制备中的乙醇含量的装置和方法报告于EP2 113 770中。
[0005]发明概沭
[0006]制备HPLC体系中的梯度通常通过借助泵的规定输送体积控制，但不考虑实际梯度。也不考虑体积收缩影响。
[0007]在这种情况下，本文中描述并要求保护新多级HPLC体系，所述体系具有可任选置于色谱柱下游或者直接置于柱上游(但在任何情况下，在高压泵下游)的另一多功能NIR测量和具有除气功能的改进梯度混合回路。
[0008]在本申请中，一方面描述了包含混合回路或混合室、气泡捕捉器、浓度检测器和一个或多个泵的色谱体系，其特征在于气泡捕捉器具有在最高点的固定开口，其打开程度可调节。
[0009]可将从液体中逸出的气体以及过量液体在任何时间以预定可调节体积流量通过固定开口从气泡捕捉器中除去。此外，固定开口改进液体的除气。
[0010]在一个实施方案中，气泡捕捉器位于混合回路或混合室外部或下游。在一个实施方案中，气泡捕捉器的入流是可调节的。在一个实施方案中，它通过阀调节。
[0011]调节气泡捕捉器的入流的能力能够调节在离开混合回路以后通过色谱柱或者在其最高点通过气泡捕捉器由体系中除去的液体的量。这可以例如改进控制或促进色谱柱上预定梯度的形成。所需流通体积可与在体系的主泵下游的第二浓度检测器一起调节，使得可使通过气泡捕捉器分离的体积量最小化或者甚至避免。这通过对比实际梯度与目标梯度以及调节阀通向气泡捕捉器的开口以及因此在其最高点的阀而实现。
[0012]在一个实施方案中，气泡捕捉器位于混合回路或混合室之内。[0013]在一个实施方案中，体积流速可通过固定开口调节。在一个实施方案中，通过阀调节。
[0014]气泡捕捉器中溢流量的调节一方面使得可调节除气的量。另一方面，它容许调节废液体积的量。
[0015]在一个实施方案中，第一体积流量测量装置位于气泡捕捉器的固定开口下游，且第二体积流量测量装置位于柱的下游。
[0016]在一个实施方案中，色谱体系包含在主泵下游的第二浓度检测器。
[0017]如本文所述另一方面为色谱体系，其特征在于它包含两个浓度检测器，其中第一个位于混合回路或混合室中，且第二个位于主泵下游。
[0018]由于两个浓度检测器的排列，即一个在混合回路或混合室中，第二个在主泵下游，可通过对比第二浓度检测器的值与第一浓度检测器的值而检查色谱体系的效率。在两个信号之间偏离的情况下(在容许通过第一浓度检测器与通过第二浓度检测器之间的时段的时间校准以后)，可推断存在体系效率的损失。
[0019]在一个实施方案中，色谱柱位于主泵与第二浓度检测器之间。
[0020]另一方面是如本文所述色谱体系检查整个色谱体系的效率的用途。
[0021]一方面还有如本文所述色谱体系检查色谱柱的完整性的用途。
[0022]两个浓度检测器的排列，即一个在混合回路或混合室中，第二个在色谱柱下游，容许通过对比第二浓度检测器的值与第一浓度检测器的值而检查色谱体系的完整性。连同使用该排列检查如本文所述色谱体系的效率，两个检测器信号之间的差可能是由于体系有关或柱有关的问题。在两个信号之间偏离的情况下(在容许通过第一浓度检测器与通过第二浓度检测器之间的时段的时间校准以后)，可推断存在体系完整性的损失。
[0023]如本文所述另一方面是由第一浓度检测器的信号与第二浓度检测器的信号形成的比在控制色谱体系中的用途。
[0024]如果通过两个浓度检测器测定的信号彼此不同，则可调节色谱体系。它可在色谱分离以后或以前以及在正在进行的分离期间，即在线调节。为调节，可使用混合回路或混合室中洗脱液的比、阀通向气泡捕捉器的开口、气泡捕捉器的永久性阀开口、由混合回路的排料速率或色谱柱的体积流量。
[0025]在一个实施方案中，浓度检测器为UV检测器、NIR检测器、pH检测器或导电率检测器，优选为UV检测器或NIR检测器。
[0026]发明详沭
[0027]本文报告了色谱体系，其特征在于在梯度形成期间容许/进行连续除气，由此在混合回路中形成梯度，由此体系包含气泡捕捉器，所述气泡捕捉器的特征在于包含在其最高点的可调节阀，由此连续除气通过气泡捕捉器的可调节阀的开口与主泵的泵送速度的相互作用而实现。气泡捕捉器中阀的存在确保将可进入气泡捕捉器中的洗脱液的量用通过主泵操作，即应用于柱，即从混合回路中除去的洗脱液的量校准。
[0028]另外，可容许从混合回路中取出的剩余洗脱液借助气泡捕捉器的阀离开气泡捕捉器。在该操作模式中，色谱体系的多级应用是可能的，即体系可以以具有不同直径和尺寸的柱，即在色谱体系的计划能力以下操作。这是重要的，因为通常设计和建立制备大规模色谱体系以用单个柱，即具有指定尺寸和直径的单个柱操作。另外，也可以以不同的流速实现相同的梯度，其还容许与相同制备/大规模色谱体系一起使用具有不同尺寸/直径的色谱柱。
[0029]在气泡捕捉器的最高点和在离开气泡捕捉器的管道中的可调节阀容许在气泡捕捉器内实现不同的压力，其完全与混合回路中的压力无关。
[0030]因此，本文所报告的气泡捕捉器限定单独的独立体系，容许如本文所报告灵活地操作所涉及的大规模色谱体系。
[0031]大部分溶解气体存在于HPLC体系的混合回路中的混合洗脱液中。由于必须的加压，在那里仅轻微的气体释放是可能的。
[0032]在已知的HPLC体系中，使用加压气泡捕捉器，其中存在与混合回路中相当的压力。因此，该气泡捕捉器中仅存在非常轻微的气体释放。另外，当操作与低流速有关的小工艺尺寸时，气泡捕捉器中的溶混性是差的，因为缓慢或低流入速率(参见图17和19中的示意图)。
[0033]借助可控关闭装置如阀与混合回路分开的本文所述未加压(可溢流)气泡捕捉器容许溶于洗脱液中的气体更强地释放。此外，可排出过量梯度混合物。由于快速入流，还存在非常好的溶混性(参见图18中的示意图)。
[0034]借助本文所述HPLC体系，可检查混合回路中形成的梯度到柱上的转移性质量。因此，可检测例如由于HPLC体系中的干扰因素或不利条件而发生的程序化梯度变化(参见图15、23、24、25 和 26)。
[0035]借助本文所述HPLC体系，还可测定在工艺步骤以前和期间所用HPLC柱的质量，因为可省去板数目的测定，其后必须使柱经受再生程序，所述再生程序是柱的最大应力，使得它们可受损，并且不再可用于生产(参见图6、7、8、9、10、27、28、29)。
[0036]本文描述了制备HPLC体系，其中体系的梯度形成混合回路用于操作最大尺寸以根据位于混合回路下游的气泡捕捉器中的方法尺寸提供所需量的混合洗脱液。所需体积流量通过主泵应用于柱，且其余通过不再结合到混合回路中的开放气泡捕捉器从体系中排出(参见图20、21和22)。
[0037]发现用该配置，梯度总是在相同条件下产生，并以相同质量转移至柱中。通过气泡捕捉器从体系中排出的未用洗脱液的量根据柱的尺寸和洗脱液的体积流速变化。在最小工艺尺寸的情况下，排放量是最大的，在最大尺寸的情况下，排出最小的量。应用于柱的梯度每种情况下是相同的，且不同的柱尺寸可在相同的工艺条件下操作。这产生工艺质量和可靠性的增加(参见图3、11、12、14、20、21和22)。
[0038]还发现使用在色谱柱下游的另外(第二)NIR测量，能够使梯度转移至任何柱尺寸和任何体系设计。柱下游的测量线中检测到的NIR信号代表引导参数，根据所述引导参数，进行体系程序化直至在管下游测量的结果与所需结果(目标值)相同(参见图15)。
[0039]洗脱液的密集除气通过开放气泡捕捉器实现。现在在与混合回路分开的气泡捕捉器中进行的该密集除气通过流入的液体的改进溶混性补充。以这种方式，可将大量溶解气体连续地从混合回路中除去。这降低了 NIR信号的干扰并导致色谱柱上改进以及更可再现的梯度形成。从体系中排出的气体的量不再向下游HPLC柱施加应力，这实质性地提高该工艺步骤的稳固性(参见图2、3、4和14)。
[0040]另一 NIR测量的执行能够连续地或者以所需频率监控应用于柱上的梯度的质量。立即检测体系紊乱并可立即校正。[0041]所用柱的质量可通过在色谱柱下游的NIR测量连续地监控。这可例如通过对比柱上游与下游的梯度而进行。不均匀或受损的柱填料或柱硬件歪曲迁移通过柱的梯度，因为液体总是寻求具有最小阻力的路径，且这例如在柱裂纹内。如果对比两个梯度，则可测定是否存在任何差。在表明受损柱的彼此偏离的梯度的情况下，柱可立即从方法中除去或者经受分开的试验程序或修补措施，即甚至发生产物批次损失以前。在柱试验以后进行的柱再生期间也可使用该程序。因此，柱质量可在分离以前直接评估，选择如果需要的话以即时方式执行合适措施(参见图6、7、8、9、10、27、28、29)。
[0042]在再生以后以及直接在应用产物以前，另一 NIR测量的使用(除连续监控迁移通过柱的梯度)能使少量溶剂(优选缓冲剂B)形式的短脉冲以平衡相应用于柱上，评估在它离开柱以前形成的峰的形状。这可在各产物应用以前进行，且其后不需要柱再生。柱质量的多次连续监控可借助在色谱柱下游的另一 NIR测量与在色谱柱上游的NIR测量组合进行，因此可改进HPLC步的质量和稳固性(参见图9和10)。
[0043]在色谱柱下游的第二 NIR检测器还使得可使用除气和多级功能，因为要求所需体系设计(例如气泡捕捉器的体积和设计)最佳化以及涉及的组件(例如混合回路泵和阀)的最佳调节。在最佳地调节体系以后，它常常执行连续监控功能，且如果需要的话容许立即校正(参见图23、24、25和26)。
[0044]本文描述了 HPLC体系的新设计，其中气泡捕捉器与混合回路分开。气泡捕捉器借助可调节阀和气泡捕捉器的开口构型，即容许除去流入气体和流入洗脱液，即能使气泡捕捉器溢流的能力与混合回路的分开提供在它们达到柱以前将洗脱液除气的改进解决方法(参见图18)。
[0045]使洗脱液不含它们的气体内容物产生两个实质性改进:
[0046]-色谱柱的质量改进，因为柱上的除气降低或者甚至消除；
[0047]-混合回路中形成的梯度的质量改进，因为气泡不能影响NIR信号。
[0048]这些优点可通过在色谱柱下游的第二 NIR参比测量而进一步改进。
[0049]可溢流气泡捕捉器改进梯度形成和除气功能。这可例如如下实现:
[0050]-气泡捕捉器中的可见除气和气泡从体系中的脱除；
[0051]-混合回路中改进的梯度形成(第一NIR测量的信号)。
[0052]连同可溢流气泡捕捉器，在色谱柱以后的第二 NIR测量可或者使得可:
[0053]-检查混合回路中形成的梯度到柱上的转移性；该功能与混合回路的操作模式或体系的设计无关；
[0054]-各尺寸中梯度的最佳调节。
[0055]NIR参比测量的其它功能，即体系和柱质量的检查(彼此独立地)与可溢流气泡捕捉器无关。
[0056]气泡捕捉器与混合回路的分开能够使比通过主泵进入柱的更多的体积流通并通过气泡捕捉器排出。在这种情况下，气泡捕捉器溢流，不仅排出气体，而且排出一部分混合洗脱液量。该操作模式例如在非常陡或复杂的梯度的情况下是需要的，其需要通过气泡捕捉器的快速流通以尤其有效地排出形成的气体量。这导致梯度的形成，因为它们已程序化和/或梯度的更稳定和定性改进过程。气泡捕捉器的溢流可用于梯度的传递而不具有大的调节(1:1)，在体系的增规模或减规模的情况下，或者通常改进梯度质量。[0057]该技术方面原则上与在色谱柱下游的第二 NIR测量无关。体系调节和体系可靠性可通过第二 NIR参比测量进一步改进。
[0058]IOcm直径色谱柱的色谱图显示于图1中，其中看出有缺点的分离梯度的过程。这产生工艺过程的偏离。该信号使用混合回路中的NIR测量产生。
[0059]在图13中15cm直径HPLC柱的三个梯度时程显示于左边，且IOcm直径HPLC柱的三个梯度时程显示于右边，其在常规体系中得到。不可再现和可变梯度时程和乙腈的打开程度在两个尺寸中是明显的。这些信号以在混合回路中，即在柱上游的NIR测量产生。
[0060]IOcm直径色谱柱的色谱图显示于图2中，其上显示出在气泡捕捉器打开和容许它溢流以后分离梯度的时程。该时程是良好且可再现的。该信号以混合回路中的NIR测量产生。
[0061]图5显示IOcm直径色谱柱的色谱图，其上看出有缺陷再生梯度峰的时程。梯度峰不是尖锐执行的。该信号以混合回路中的NIR测量产生。
[0062]IOcm直径色谱柱的色谱图显示于图4中，其上显示出在气泡捕捉器打开和容许它溢流以后再生梯度的时程。该梯度峰确切且可再现性地执行。该信号仅以混合回路中的NIR测量产生。
[0063]此外，非常有效的除气效果通过由急剧地压降而产生的气泡捕捉器打开而实现。
[0064]提供以下实施例和图以阐述本发明的主题，保护性范围由所附专利申请书限定。显然可不偏离本发明的主题而做出对所公开方法的主题的改进。
[0065]图1显示IOcm HPLC色谱柱的色谱图，其中显示有缺陷分离梯度的时程。这导致工艺过程由于变化而偏离。该信号以混合回路中，即在柱上游的NIR测量产生。
[0066]图2显示IOcm直径HPLC-色谱柱的色谱图，其上显示出在打开气泡捕捉器并容许它溢流以后分离梯度的时程。该时程是可再现的且不含变化。该信号以在混合回路中，即在柱上游的NIR测量产生。
[0067]图3显示在混合回路中的气泡捕捉器打开并使其溢流以后IOcm和15cm直径HPLC-色谱柱的叠加梯度。两个时程是相当的、可再现的且具有少许波动(或者至少部分地不含波动)。该信号以在混合回路中，即在柱上游的NIR测量产生。
[0068]图4显示10直径HPLC-色谱柱的色谱图，其上显示出如本发明所述在打开气泡捕捉器并使它溢流以后再生梯度的时程。梯度峰可再现性地执行。该信号以在混合回路中，即在柱上游的NIR测量产生。
[0069]IOcm直径色谱柱的色谱图显示于图5中，其上显示出有缺陷再生梯度的时程。梯度峰不是良好执行的。该色谱图在非根据本发明操作的HPLC体系上产生。信号以即在柱上游的NIR测量产生。
[0070]完整15cm直径HPLC柱的再生色谱图显示于图6中。所有三个梯度峰不显示出扭曲，且是非常相当的，这表明完整的柱填料。这随后通过常规方法证明。该信号以位于主泵下游且在柱下游的NIR测量产生。
[0071]图7显示有缺陷15cm直径HPLC柱的再生色谱图。清楚地显现出由于柱填料中的裂纹而导致的第一梯度峰的上行侧翼扭曲。在第二梯度峰的NIR信号中也看出扭曲。因此可见的柱缺陷随后通过填充质量的常规测定通过板数目测定和柱基体的检查而证明。该信号以位于主泵下游且在柱下游的NIR测量产生。[0072]图8显示有缺陷30cm直径HPLC柱的再生色谱图。在这种情况下，看出梯度峰的扭曲，这表明柱缺陷。柱缺陷通过常规方法和柱基体的检查而证明。该信号以位于主泵下游且在柱下游的NIR测量产生。
[0073]图9显示在注入HPLC柱上以前的溶剂脉冲的NIR信号。该峰的陡且非变形侧翼是明显的。该信号以位于主泵下游且在柱下游的NIR测量产生。
[0074]溶剂峰(参见图9中的理想峰)在它通过受损柱填料以后显示于图10中。清楚地看出由于柱填料中的缺陷而导致的峰的两个侧翼扭曲。有缺陷填充质量通过常规方法证明。该信号以位于主泵下游且在柱下游的NIR测量产生。
[0075]在图11中，IOcm直径HPLC柱的三个梯度时程显示于左边，其在非根据本发明改性的体系中得到。可清楚地看出乙腈阀的打开程度波动，其在一些情况下是相当的，因此还有梯度的那些。右边的两个时程在本发明意义上重配置，即具有分开且溢流气泡捕捉器的体系中得到。清楚地看出非常可再现的梯度时程和乙腈阀的打开程度而不具有明显的波动。这些信号仅以混合回路中的NIR测量产生。
[0076]在图12中，15cm直径HPLC柱的三个梯度时程显示于左边，其以常规体系得到。在这种情况下，看出乙腈阀打开程度的波动，其在一些情况下是相当的，因此还具有梯度，其比IOcm尺寸的那些更小。右边的两个时程在根据本发明重配置，即具有分开和溢流气泡捕捉器的体系中得到。清楚地看出非常可再现的梯度时程和乙腈阀的打开程度而不具有波动。这些信号以在混合回路中，即在柱上游的NIR测量产生。
[0077]在图13中，15cm直径HPLC柱的三个梯度时程显示于左边，IOcm直径HPLC柱的三个梯度时程显示于右边，其在常规体系中得到。以两个尺寸，清楚地看出不可再现且变化的梯度时程和乙腈阀的打开程度。这些信号以在混合回路中，即在柱上游的NIR测量产生。
[0078]在图14中，15cm直径HPLC柱的两个梯度时程显示于左边，IOcm直径HPLC柱的两个梯度时程显示于右边，其在根据本发明，即具有与混合回路分开且溢流的气泡捕捉器的体系中得到。以两个尺寸，看出可再现且几乎相同的梯度时程和乙腈阀的打开程度。这些信号以在混合回路中，即在柱上游的NIR测量产生。
[0079]在图15中看出记录于Akta HPLC体系上的两个不同梯度时程。信号AKTA由用于使体系程序化的梯度泵的性能数据的转移而形成。在设计和尺寸方面相当地不同于Akta-HPLC体系的制备HPLC体系的NIR程序化值用作使不能用NIR值程序化的
iikta-HPLC体系程序化的基础。将又kta-HPLC体系上两个梯度的时程，在一种情
况下梯度泵的性能数据，在一种情况下混合室以后实际测量的NlR值考虑共同起点绘图并显示于图中。看出两个梯度的时程中相当的差，但根据程序化应产生相同的时程。该图显示具有不同设计和尺寸的体系之间梯度的转移不是直接可能的，而不具有偏离，如果技术人员不使用或考录混合回路或混合室下游的另外NIR信号。
[0080]以人kta-HPLC体系产生的叠加色谱图显示于图16中。清楚地看出具有不同的宽度和形状的两个峰。这些峰在考虑在体系的混合室下游的实际NIR测量以前和以后以两个不同程序化的梯度形成。在人kta梯度的校正(适于生产体系)以后实现操作体系和又kta-HPlC体系的分离时程的更好地一致和转移性。[0081]装配有加压气泡捕捉器的常规制备HPLC体系的示意图显示于图17中。在气泡捕捉器与混合回路之间不存在关闭装置(阀)。不能将气泡捕捉器中的料流分流或者将洗脱液除气。也不能同样地执行不同尺寸中运行的梯度。混合回路中的循环速率是恒定的。该体系仅具有位于混合回路中的一个NIR测量。因此，不能在线检查柱和梯度质量。
[0082] 图18显示根据本发明改进的制备HPLC体系的示意图，其装配有与混合回路分开且不在压力下或者可在比混合回路中存在的低得多的压力下操作的气泡捕捉器。可调节关闭装置(例如阀)位于气泡捕捉器与混合回路之间。可调节关闭装置(例如阀)可任选安装在气泡捕捉器的上部出口处。可将料流在气泡捕捉器中分流并在那里进行洗脱液的除气。也可运行在不同柱尺寸中行进的相同梯度。可变化地调节混合回路中的循环速率。体系具有两个NIR测量位置，一个在混合回路中，且一个在主泵下游。在柱旁通模式中可在线检查柱质量以及梯度质量。
[0083]常规制备HPLC体系的示意图显示于图19中，其具有在压力下且结合到混合回路中的气泡捕捉器。气泡捕捉器与混合回路之间不存在关闭装置。既不能分流气泡捕捉器中的料流，也不能将洗脱液除气，也不能同样地运行在不同尺寸中行进的梯度。混合回路中的循环速率是恒定的。体系仅具有位于混合回路中的一个NIR测量点。不能在线检查柱和梯度质里!。
[0084]在本发明意义上改进的制备HPLC体系的实例显示于图20中，其具有与混合回路分开且可不加压而操作的气泡捕捉器。可调节关闭装置(例如阀)位于气泡捕捉器与混合回路之间。该实施例为设计体系的最大尺寸。因此，仅洗脱液的除气在气泡捕捉器中进行。不需要将料流分流，但它任选是可能的。混合回路中的循环速率可以以灵活的方式调节。体系具有两个NIR测量位置，其中一个位于混合回路中，另一个位于主泵下游。因此，可在线检查柱和梯度质量。
[0085]在本发明意义上改进的制备HPLC体系的实例显示于图21中，其具有与混合回路分开且可不加压而操作的气泡捕捉器。可调节关闭装置(例如阀)位于气泡捕捉器与混合回路之间。在这种情况下，它是中间工艺变化方案，这意指洗脱液的除气以及料流分流在气泡捕捉器中进行。料流分流确保也用于最大尺寸中的梯度(参见图21)以相同的方式进行。通向柱且通过气泡捕捉器离开体系的料流之和与最大尺寸的工艺料流相同。可变化地调节混合回路中的循环速率。体系具有两个NIR测量位置，其中一个位于混合回路中，另一个位于主泵下游。因此，可在线检查柱和梯度质量。
[0086]在本发明意义上改进的制备HPLC体系的实例显示于图22中，其具有与混合回路分开且可不加压而操作的气泡捕捉器。可调节关闭装置(例如阀)位于气泡捕捉器与混合回路之间。在这种情况下，它是最小工艺变化方案，这意指洗脱液的除气以及料流分流在气泡捕捉器中进行。料流分流确保也用于最大和中间尺寸中的梯度可以相同地进行。通向柱且经由气泡捕捉器离开体系的料流之和等于最大尺寸的工艺料流。可变化地调节混合回路中的循环速率。体系具有两个NIR测量位置，其中一个位于混合回路中，另一个位于主泵下游。因此，可在线检查柱和梯度质量。
[0087]图23显示使用在本发明意义上改进的制备HPLC体系设置最佳梯度时程的程序的实例，所述体系具有与混合回路分开并可不在压力下操作的气泡捕捉器。可调节关闭装置(例如阀)位于气泡捕捉器与混合回路之间。可以以灵活的方式调节混合回路中的循环速率。体系具有两个NIR测量位置，其中一个位于混合回路中，另一个位于主泵下游。因此，可在线检查柱和梯度质量。该图阐述设置最佳梯度中的第一步骤是调节校正混合回路和缓冲剂供应区域中所有所需参数。当混合回路中进行的NIR测量反映出该位置上梯度的最佳目标状态时，成功地调节参数。在这种情况下，调节参数尤其是如下:缓冲容器的压力叠加和混合回路中最佳循环速率的调节。
[0088]图24显示使用在本发明意义上改进的制备HPLC体系设置最佳梯度时程的程序的实例，所述体系具有与混合回路分离并可不在压力下操作的气泡捕捉器。可调节关闭装置(例如阀)位于气泡捕捉器与混合回路之间。可以以可变的方式调节混合回路中的循环速率。体系具有两个NIR测量位置，其中一个位于混合回路中，另一个位于主泵下游。因此，可在线检查柱和梯度质量。该图阐述调节最佳梯度中的第二步骤是在将校正料流尺寸从体系的主泵中取出以后用第二下游NIR测量校准。在这种情况下，两个梯度之间相当的差是明显的，其必须通过调节措施消除。
[0089]图25显示使用在本发明意义上改进的制备HPLC体系设置最佳梯度时程的程序的实例，所述体系具有与混合回路分离并可不在压力下操作的气泡捕捉器。可调节关闭装置(例如阀)位于气泡捕捉器与混合回路之间。可以以可变的方式调节混合回路中的循环速率。体系具有两个NIR测量位置，其中一个位于混合回路中，另一个位于主泵下游。因此，可在线检查柱和梯度质量。该图阐述调节最佳梯度中的下一步骤包括以下措施:例如借助位于气泡捕捉器与混合回路之间的可调节阀最佳地调节从混合回路中取出的量，经由在其最高点的气泡捕捉器最佳地调节离开体系的流量，和一般性地检查所有体系组件。
[0090]图26显示使用在本发明意义上改进的制备HPLC体系设置和连续监控最佳梯度时程的程序的实例，所述体系具有与混合回路分离并可不在压力下操作的气泡捕捉器。可调节关闭装置(例如阀)位于气泡捕捉器与混合回路之间。可以以可变的方式调节混合回路中的循环速率。体系具有两个NIR测量位置，其中一个位于混合回路中，另一个位于主泵下游。因此，可在线检查柱和梯度质量。该图阐述在成功地设置所有体系参数以后，在混合回路中和在主泵下游检测到的两个梯度是相同的。当达到该状态时，调节方法完成且测定的值可用于固定地使体系程序化。从此时向前，通过另一 NIR测量以柱旁通模式连续地监控梯度的质量。为此，试验每隔一定时间进行不具有柱或以柱旁通模式进行。这确保体系对所用HPLC柱无不利影响。同样快速检测到偏离并可消除。
[0091]图27显示使用具有在主泵下游的第二 NIR测量的HPLC体系检查所用HPLC柱的质量的程序的实例。该另一 NIR测量可通过在柱上游或柱下游的合适旁路进行。第一 NIR测量在主泵上游进行。因此可在线检查柱和梯度质量。该图阐述检测柱质量中的第一步骤是检测影响柱下游的柱质量的梯度时程。柱的梯度或可控时程的重要性本身可例如表现在柱上梯度期间发生的特压波动中。其它影响因素为由于柱基体中的缓冲剂组合物以及温度变化而可发生的气体排放。另外，发现具有特别陡的斜坡段的梯度最适于评估HPLC柱的填充质量。通常，在产物分离以前的柱再生为该关键步骤。同时存在这一风险:再生期间形成的可能柱缺陷在分离以前保持未检测到，这可对分离过程具有非常负面的结果。
[0092]图28显示使用具有在主泵下游的第二 NIR测量的HPLC体系检查所用HPLC柱的质量的程序的实例。该另一 NIR测量可通过在柱上游或柱下游的合适旁路进行。第一 NIR测量在主泵上游进行。因此可在线检查柱和梯度质量。该图阐述如何在匹配两个梯度(在柱上游和在柱下游)的方法中如何可得到有缺陷柱的指示。两个梯度时程的差得到该指示。推断出该结论的前提条件如下:
[0093].柱上游的梯度时程是不显著的，即梯度体系极好地作用且极好的梯度转移至柱上。用于识别和实现该状态的程序描述于上文中(参见图23-26)。
[0094].在怀疑的情况下，必须首先进行体系检查。
[0095].如果体系影响不造成柱下游的梯度时程的异常，则技术人员必须寻求有缺陷填充的原因。对HPLC柱的多数损害是由于裂缝形成，其是由方法中常见的高压导致的。柱填料上的应变是巨大的，因为将材料连续地压缩和松弛。在柱壁领域中优先发生的裂纹形成以后，发生柱填料的不均匀分布和至柱上的不均匀料流。该行为是由于液体总是选择最小阻力的路径这一事实。在其中形成裂纹的柱中，优选灌注柱填料的受损面积，因为以这种方式，液体可在最短的路线上离开柱并可释放张力。该行为通过柱上游的NIR检测器可见，在缓冲剂组合物快速交换的情况下特别如此。如果在柱上游的缓冲剂组合物变化的情况下，柱下游的信号变化可比柱的所谓死体积导致的延迟更快地检测到，这是有缺陷柱填料的指示。此外，在损害柱以后记录的梯度时程通常是不可再现且不规则的，因为受损HPLC柱填料中的条件是非常不稳定的，且损害快速地扩散。
[0096]图29显示所用HPLC柱的质量的程序的实例。该检查通过进行所谓的板数测定(HETP)而进行。在该试验中，产生和评估一个或多个UV峰。必须确保用于进行试验的UV活性物质在下一产物应用以前完全除去以不削弱产物质量。因此，在该试验以后通常必须进行再生，如关于图27和28已描述的，其代表柱的特定应变。试验方法本身还向柱施加闻应力是常见的。不能进行产物施用和后续分离直至柱再生。
实施例
[0097]实施例1
[0098]具有不同设计和尺寸的HPLC体系中的梯度时程差
[0099]iikta-HPLC:体系的梯度仅通过泵的规定输送体积控制，但不考虑实际梯度时程。也不考虑体积收缩效应。
[0100]较大生产尺寸中的工艺涉及借助NIR检测器调节缓冲剂组合物，因此测量并调节实际缓冲剂组合物(梯度)。
[0101]缓冲剂直接在混合室下游经由导电率测量池传至NIR检测器中，同时绕过常用环形阀。因为大的管道横截面，必须将流速提高至60ml/min以具有相当的流动条件。缓冲剂A和B的组成在两个色谱法中是相同的。
[0102]运行先前所用分离程序的梯度，同时通过NIR检测器记录数据。来自人kta色谱法
的两个梯度值(梯度泵的输送速率)，并将在；ikta体系的混合室下游试剂测量的NIR信号
绘于Excel图(图15)中，同时考虑共同的起点。测定两个梯度之间的差，并通过该量来校正程序(图16)(还参见附图描述)。
[0103]Akta体系上的老梯度在第一步骤中，即在已进行洗脱的一部分中更陡。因此，峰宽度与新梯度相比更小。又kta运程中的收率比制备运程中更高，这表明分离的不同过程以及因此不同的分离结果。
[0104]借助第二下游NIR测量最佳化的梯度现在于生产体系与人kta之间的梯度转移
中产生更好的一致性(也参见附图15和16的描述)。
[0105]实施例2
[0106]通过与混合回路分开的气泡捕捉器排出的洗脱液量
[0107]可溢流气泡捕捉器的使用容许除排出的气体外，将过量洗脱液从体系中除去。由于体系的尺寸根据最大柱尺寸操作，排出的过量取决于所用流速以及因此所用柱直径。
[0108]当使用具有30cm直径的柱时，流速为162升/小时。完全填充可溢流气泡捕捉器。必须将气体以及仅少量过量洗脱液从体系中除去(图20)。
[0109]当使用具有15cm直径的柱时，流速为40.5升/小时。完全填充可溢流气泡捕捉器。必须将气体以及121.5L过量洗脱液从体系中除去(图21)。
[0110]当使用具有IOcm直径的柱时，流速为18升/小时。完全填充可溢流气泡捕捉器。必须将气体以及154L过量洗脱液从体系中除去(图22)。
[0111]在混合回路中的气泡捕捉器打开和溢流以后，IOcm和15cm直径色谱柱的叠加梯度显示于图3中。两个曲线是绝对相当的。
【权利要求】
1.包含混合回路或混合室、气泡捕捉器、浓度检测器和一个或多个泵的色谱体系，其特征在于气泡捕捉器具有在最高点的固定开口。
2.根据权利要求1的色谱体系，其特征在于气泡捕捉器位于混合回路或混合室外部或下游。
3.根据权利要求1或2的色谱体系，其特征在于气泡捕捉器的入流是可调节的。
4.根据权利要求3的色谱体系，其特征在于调节借助阀进行。
5.根据权利要求1的色谱体系，其特征在于气泡捕捉器位于混合回路或混合室之内。
6.根据前述权利要求中任一项的色谱体系，其特征在于可以调节通过固定开口的体积流量。
7.根据权利要求6的色谱体系，其特征在于调节通过阀进行。
8.根据前述权利要求中任一项的色谱体系，其特征在于第一体积流量测量装置位于固定开口下游且第二体积流量测量装置位于柱之后。
9.根据前述权利要求中任一项的色谱体系，其特征在于它包含在主泵下游的第二浓度检测器。
10.色谱体系，其特征在于它包含两个浓度检测器，其中第一个位于混合回路或混合室中，且第二个位于主泵下游。
11.根据权利要求10的色谱体系，其特征在于色谱柱位于主泵与第二浓度检测器之间。
12.根据权利要求10的色谱体系，其特征在于第二浓度检测器位于主泵之后且位于色谱柱之后。
13.根据权利要求10的色谱体系在检查整个色谱体系效率中的用途。
14.根据权利要求11或权利要求12的色谱体系在检查色谱柱完整性中的用途。
15.第一浓度检测器的信号与第二浓度检测器的信号之比在控制色谱体系中的用途。
16.根据权利要求1-10中任一项的色谱体系，其特征在于混合回路中的体积流量可以变化地调节。
【文档编号】G01N30/32GK103946705SQ201280055088
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2012年11月6日 优先权日:2011年11月10日
【发明者】A·布拉什克, D·德韦卡, C·施马尔兹 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司