一种腺病毒芯片及其用途的制作方法

专利名称：一种腺病毒芯片及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，涉及一种腺病毒芯片及其用途，具体涉及一种人类全基因组腺病毒芯片及其用途。
背景技术：
在人类基因组全部测序完毕之后，下一步最重要的就是如何研究发现每一个基因的功能。只有知道了每个基因的功能，才能有效地治疗人类的各种疾病。人类的每个基因都在身体内行使一定的功能，疾病的广生尤其是癌症都是与基因有关系的。为了研究每个基因的功能，首先得有一个具体的cDNA基因克隆。基因克隆就像“钞票”一样在生物技术及生物制药行业流通。因为很多疾病的产生和发展都是很多基因共同作用的结果，将来的功能基因组学，蛋白质组学，新药物的研发，都会依赖在高通量筛选中同时利用很多种基因克隆，尤其是以高密度芯片的方式。

反相转染芯片技术利用人类的全长基因是Ziauddin和Sabatini在2001年发明的。它在从基因组学到蛋白质组学的研究中起到了重要的桥梁作用。从一个基因芯片到一个以细胞为基础的芯片技术上主要包括三个步骤:1)芯片的制造:芯片上的每一个样点代表不同的表达人类基因的质粒克隆；2)然后加入转染试剂到基因芯片上；3)加入附着性动物细胞到芯片上培养:当细胞加入到基因芯片上之后，在转染试剂的帮助下，附着的细胞吸取每个样点上的质粒克隆并得到转染，同时每个样点上的蛋白得到表达。这种技术可以同时用来研究成千上万种基因的表达。他在基因功能研究和药物发现中有很重要的应用。用人类全长基因制成的生物芯片虽已存在，但这些芯片都是利用质粒载体制成的。当质粒载体点到芯片上之后，它的转染效率非常低。实际上，覆盖人类整个基因组的全长基因芯片也不存在。用质粒做成的芯片的致命弱点是它不能用来转染不分裂的细胞，像与疾病有关的原发细胞和干细胞。基因功能组学的目的是用以细胞为基础的试验分析方式，在基因组的范围内研究发现每一个基因的功能，尤其是利用原发细胞或者是干细胞，然而大部分原发细胞或干细胞不能用传统的质粒载体转化。以病毒为基础的载体，像腺病毒载体，对分裂或不分裂的细胞都有很高的转染率。腺病毒载体是转染人类细胞最有效的，多样化的系统，它被广泛的应用在生物医学研究和基因疗法领域。腺病毒载体能够有效的转染分裂或不分裂的细胞，其转染效率可达到百分之百。腺病毒载体进入细胞后不整合到人类基因组，所以它相对比较安全。腺病毒的生产比较容易达到很高的滴度，并且能够容纳多达30kb以上的外源基因。腺病毒重组蛋白的表达可以达到20-30%的细胞重量。与其他病毒载体(像慢病毒)相比，腺病毒更稳定。病毒载体不仅转染效率高，并且转染过程中不影响细胞的生存，相反很多质粒转染的转染试剂都有很高的毒性。因为腺病毒比较稳定，容易保存和运输，它是一个很好的材料去制作人类全长基因的“腺病毒芯片”。最常见的生物芯片是用寡聚核苷酸制成的。这些芯片的主要作用是用来测定基因表达和基因突变分析。这种芯片与人类全长基因芯片有很多不同，因为全长基因芯片可以用来研究细胞的功能，形态变化，也就是说可以用来测定基因产物，蛋白质水平的变化。质粒基因克隆可以放到96孔板或384孔板中，然后加入动物细胞做细胞水平的分析，但是这种方式既繁琐又昂贵。目前现有芯片存在以下问题:
1.现有芯片细胞转染效率低。现有的基因芯片是用来研究基因表达和基因突变的，因为用全长基因质粒载体制成的芯片细胞转染效率非常低。一般质粒载体的转染效率只有20%。当质粒载体被点到芯片上之后，其转染效率会更低。低的转染效率最终影响蛋白的表达和细胞功能的研究。2.现有芯片技术不能用来研究不分裂的细胞。在生理上和功能上与人类细胞或疾病细胞最相近的是很多原发细胞或干细胞，但是现有的全长基因芯片不能够转染这些细胞。慢病毒虽然能够转染不分裂的细胞，但要得到高的滴度非常困难，所以也不能用来制造全长基因芯片。3.当质粒基因芯片上样点的密度增大时，相互污染会增加。在用芯片点样机打印到显微玻片之前，质粒DNA要跟0.2%的凝胶混合。一般样点的大小在100微米，间距在300-400微米。这样最终影响一个芯片上基因克隆的数量。4.现有全长基因高通量分析效率低，试剂消耗大。现有的利用全长基因的基因组范围的高通量分析是在96孔或384孔板中进行的。这种分析效率低，并且需要大量的实验试剂和动物细胞。原发细胞和干细胞有时候很难得到大量的细胞，所以传统的方式很难用到这些细胞的高通量分析。5.现有技术产品的价格高。如果进行全基因组范围的高通量分析，需要购买15，000-18,000个全长基因质粒克隆。这些克隆的价格至少在几百万美元。

发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供一种腺病毒芯片。更进一步本发明提供一种人类全基因组腺病毒芯片及其用途。本发明是将覆盖人类基因组的腺病毒克隆制成一个高密度芯片，这样可以并列同时分析整个基因组范围的人源基因。制造腺病毒芯片的关键如提是生广基因组范围的腺病毒人源全长基因克隆。我们已经发明了高通量腺病毒克隆生产技术，利用该生产技术所提供的方案，现有的人源全长基因克隆可以在短时间内克隆到腺病毒载体并包装成腺病毒粒子。本发明所述的腺病毒芯片是把含有人类的全长基因的腺病毒粒子点到显微玻璃芯片上制成的。当高浓度的含有人类的全长基因的腺病毒用芯片点样仪打印到芯片上之后，用一种合成的封闭剂把有腺病毒的区域覆盖，这样有腺病毒的样点就像一个一个分离的“岛屿” 一样。然后在培养皿中，加入培养的细胞(如，细胞HEK293)到芯片上，之后细胞会附着到有腺病毒的点上并得到腺病毒的转染。最后在一层没有转染的细胞之间产生很多活体的转染的细胞。点到芯片上的腺病毒一般不扩散，会聚集在一个小区域形成一个个的样点。细胞形态的变化或荧光反应可以用高通量的图像扫描技术获得。本发明所述腺病毒芯片的制备方案如下:
O生产高浓度腺病毒粒子:腺病毒克隆在线性化之后，转染到6孔板中进行腺病毒的包装，腺病毒形成以后，扩增1-2次，直至滴度达到IO9-1Oki粒子/毫升；
2)腺病毒芯片的生产:用芯片点样仪将高浓度的腺病毒打印到硝化纤维玻璃片上或其他的基质上。每个样点的大小在100-150微米，一个18X54毫米的玻璃片可以容纳至少10，000-15，000个样品，整个人类基因组可以打印到2个显微玻璃片上。腺病毒芯片如附图1所示。本发明所述腺病毒芯片可以转化成蛋白芯片:将细胞加入到腺病毒芯片上培养，当细胞在过表达之后，每个基因所表达的蛋白可以得到固定，这样腺病毒芯片就转化成蛋白芯片。腺病毒芯片转化的蛋白芯片可以容纳人类基因组所有的基因，可以用来研究基因组中所有蛋白的功能。本发明腺病毒芯片的检测可采用多种方式进行，很多可以用于普通基因芯片的自动监测系统，仪器设备，都可以用在腺病毒芯片的检测上。例如采用荧光标记的方法进行检测，腺病毒克隆带有绿色或红色荧光蛋白标签，芯片可以用荧光显微镜来检测。检测结果如附图2所示。本发明所述腺病毒芯片可以应用到很多不同的生物医学研究:活体细胞分析(包括细胞的生长和分化，细胞凋亡，组织特异性基因表达，细胞对小分子的毒性和敏感性分析等)；腺病毒芯片还可以用来做免疫分析、酶活性分析、启动子/报告基因分析、抗体特异性分析、自身免疫疾病检测、生物标记物的发现等。(1)应用腺病毒芯片进行活体细胞分析:腺病毒芯片可以用来做以细胞为基础的活体细胞分析。当哺乳细胞加到芯片上和经过培养之后，细胞的形态变化可以直接用显微镜观察。应用腺病毒芯片进行细胞凋亡分析。如果另外一个基因和芯片上的一个基因共同作用导致细胞凋亡，这个基因克隆可以加到细胞中一起加到芯片上，细胞凋亡也可以用显微镜观察到。应用腺病毒芯片进行小分子毒性和敏感性分析。如果一个小分子对细胞有毒性，但是一个特殊蛋白的表达有抗毒性，腺病毒芯片可以用来区别基因组内哪一个基因有抗毒性，或用来测定对小分子的敏感性。(2)应用腺病毒芯片进行免疫分析。哺乳动物细胞可以先跟腺病毒芯片一块培养，这样每个样点上的基因得到过表达，然后细胞被固定之后，可以作免疫方面的分析。固定后的芯片可以跟需要测定的抗体反应，过表达的蛋白可以被检测到。(3)应用腺病毒芯片进行酶活性分析。酶底物可以加到细胞培养液中一块用来与腺病毒芯片培养，通过一定的显示方式(像颜色变化)来监视基因组内一种或几种蛋白与酶底物的反应。有时候一个酶底物会跟细胞内很多酶起反应，这样通过全基因组芯片的方式可以发现所有相关的基因。(4)应用腺病毒芯片进行启动子/报告基因分析。为了发现一个转录因子跟一个特殊的启动子反应并导致转录的开始，启动子可以先跟一个报告基因(像绿色荧光蛋白)制成一个质粒载体或腺病毒，然后与哺乳细胞一起转染腺病毒芯片。如果基因组内一个转录因子激活带启动子的报告基因，报告基因的产物像绿色荧光可以从显微镜下观察到。全基因组范围的腺病毒芯片可以用来发现所有与某一个启动子相关的转录因子或其他相关的基因或蛋白。(5)应用腺病毒芯片进行抗体特异性分析。所有疾病治疗和疾病检测的单克隆抗体都需要很高的特异性，也就是说单克隆抗体应该只对相对的抗原有反应。腺病毒转化的全基因组蛋白芯片可以用来检测抗体的特异性。不同的单克隆抗体可以用来与蛋白芯片杂交。通过与所有蛋白的反应，可以判定一个抗体是不是具有很高的特异性。(6)应用腺病毒芯片进行自身免疫疾病检测。许多疾病是自身免疫造成的。这些病人的体液包括血液会含有自身免疫的抗体。通过与腺病毒转化的全基因组蛋白芯片的反应，可以检测身体有哪一种自身免疫疾病。不同的自身免疫疾病有不同的生物标记物，或不同的自身免疫抗体。(7)应用腺病毒芯片进行生物标记物的发现。全基因组的蛋白芯片可以用于生物标记物的发现，比如卵巢癌生物标记物的发现。用很多卵巢癌病人的血液与蛋白芯片杂交，可以发现基因组范围内自身免疫抗体的种类。如果一个生物标记物发生在所有活很多病人的血液中，该生物标记物可能作为卵巢癌的生物标记物。本发明与现有技术相比具有如下突出的优点:
1、腺病毒粒子有很高的转染效率。腺病毒比较容易得到很高的滴度(可达到IO12-1O13粒子/毫升)，所以转染效率可以达到100%。相比质粒载体的转染效率只有20-30%。蛋白质利用腺病毒的表达可以达到10-30%的细胞干重，而质粒载体蛋白的表达在0.1%以下。高的转染效率和蛋白表达是制作全基因组范围芯片的重要基础。2、腺病毒载体可以用来转染分裂或不分裂的细胞，包括原发细胞和干细胞。质粒载体不能用来转染很多重要的与疾病有关的不分裂细胞，所以质粒载体制成的芯片也不能用来做这方面的研究。对不同的细胞株，质粒载体都有不同的转染效率，所以针对不同的细胞株制作芯片上也应作出调整，这样在研发和测试上需要大量时间。腺病毒载体对各类不同的细胞株都有很高 的转染效率，一个覆盖基因组的产品可以用到各种细胞上。3、腺病毒芯片的密度高，互相污染少。腺病毒每个样点的大小在100微米，间距在100微米。样点一般保持在固定位置，没有样点之间的互相污染。与质粒基因芯片相比，腺病毒芯片的容量会增加2-3倍。4、腺病毒芯片可以用来做基因组范围的高通量分析。由于腺病毒芯片的密度高，整个基因组可以打印到1-2个显微玻片上。现有全长基因高通量分析是在96孔或384孔板中进行的。如果整个基因组包含在两个玻璃片上，可以放到一个培养皿转染，培养分析。这样减少了孔与孔之间的差异，获得的数据更可靠。因为被点到玻片上的腺病毒极其微量，这样可以同时生产大量的一样的芯片。性能一样的芯片对以后试验重复有利。5、生产全基因组范围腺病毒芯片的关键是把每一个人源基因克隆到腺病毒载体并包装成腺病毒。一旦有了基因组范围的腺病毒，芯片的生产比较容易进行商业化生产。作为一种消耗品，腺病毒芯片的成本会大大降低。利用96孔板或384孔板的方式作高通量分析，会利用大量的质粒载体。因为质粒载体会很容易的进行再复制，一般生厂商也不会以这种方式制造。只有几家大的制药公司或生物技术公司能做这方面的分析。腺病毒芯片作为消耗品，可以大批量的生产。因为一个芯片只能用一次，不同的实验需要再购买新的芯片。其价格会是质粒芯片的百分之一或几十分之一。所以，本发明的实用性很强。6、腺病毒芯片可以转化成蛋白芯片。用腺病毒载体，蛋白的表达可以达到10-30%细胞重量。过表达的腺病毒芯片可以作为蛋白芯片用在各种不同的生物学研究中。蛋白芯片有多种用途:可以定量分析癌细胞，体液和组织中蛋白的表达。可以用来做生物标记物的综合性分析，细胞信号传导分析以及疾病诊断。对不同的疾病阶段，不同的组织和器官，不同的病人的蛋白表达都可以用该蛋白芯片检测。蛋白芯片还可以用来对蛋白动态变化的分析，比如对外界不同的刺激，不同的药量，或者不同的时间点。蛋白芯片还可以用来研究和识别蛋白信号传递途径，评估分子药靶点，和理解药物作用机制。蛋白芯片也是一个好的方法去测定很多疾病包括癌症中自身免疫性抗体的定量和定性分析。7、腺病毒芯片可以用到很多不同的生物医学研究:细胞的生长和分化，细胞凋亡，组织特异性基因表达，细胞对小分子的毒性和敏感性分析。腺病毒芯片还可以用来做免疫分析，酶活性分析，启动子/报告基因分析。


图1.腺病毒芯片。图2.绿色和红色荧光腺病毒在细胞转染后的表达:A是考马斯亮蓝的染色；B是在荧光显微镜下的荧光分析；绿色和红色代表两种腺病毒携带绿色荧光和红色荧光基因，标记的大小是100微米。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明予以进一步说明，应当说明的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求的保护范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，为本领域内的一般技术，通常按照常规条件如:J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，分子克隆实验指南(第三版)或按照制造厂商的操作指南所建议的方法进行。实施例1.腺病毒芯片的制备
(1).载体制备
一般显微玻片可以用来做载体。玻片首先浸入到25微克/毫升的硝化纤维素甲醇溶液中，然后在无菌的情况下让甲醇蒸发，干燥。(2).腺病毒的制备
主要包括腺病毒质粒载体的制备和腺病毒的包装生产。1)人类的每个基因克隆首先用ORF引物扩增，利用高通量的方式克隆到穿梭载体里，再用高通量的方式重组到腺病毒骨架载体内。2)腺病毒的包装。携有人类基因的腺病毒在线性化之后，与转染试剂一起，加入到6孔板的孔中，培养13天。之后，刮下细胞，用2000转/分钟低速离心，加入1毫升PBS缓冲液，用液氮冻融4次。把0.5毫升的腺病毒加入到10厘米的培养皿中，培养5-10天。重复10厘米培养2-3次到腺病毒滴度达到IO9-1Ow粒子/晕升。腺病毒可以在-70度作长期保存。(3).芯片打印
用接触式点样，把制成的15 000个腺病毒人源克隆分布到384孔板中，打印针从多孔板取出样品后直接打印在芯片上，打印时针头与芯片接触。如果每个样点的大小是100微米，间距100微米，一个平方厘米的区域可以打印2500个样点。
(4).覆盖细胞间的区域
腺病毒样点周围的区域可以用过滤的封闭剂StabilGuard (SG01, SurModics,EdenPrairie,MN, USA)覆盖45分钟，然后用PBS缓冲液冲洗。制成的芯片可以在_70度冰箱作长期保存。实施例2.将腺病毒芯片转成蛋白芯片
把腺病毒芯片放到培养皿中，加入I X IO6细胞(如，HEK293细胞、CHO细胞)，8_10小时，37度，5% 二氧化碳培养。然后加入新鲜的培养液。根据不同的实验要求，可以对细胞作不同的处理。对细胞所做处理为本领域内的一般技术。实施例3.腺病毒芯片荧光标记的添加和检测
(I)制作穿梭载体和腺病毒克隆的时候，把外源的基因和绿色荧光蛋白(GFP)愈合在一起。当加入细胞到芯片上和细胞得到转染之后，荧光可以在荧光显微镜下直接观察到。或者，GFP也可以在同一个载体中用不同的启动子或利用IRES方式表达。荧光和颜色都可以用高通量显微镜扫描技术获得。(2)使用不同的标签或颜料标记小分子化合物，蛋白或其他物质来检测。例如测定一个细胞表面受体(Receptor)和一个配体(Ligand)的结合,配体可以用不同的突光物质或颜料标记。在加入细胞到腺病毒芯片上的时候，也同时加入标记好的配体。当配体和基因组中一个受体结合时，荧光或颜色就会显示在某一个样点细胞的表面。荧光和颜色都可以用高通量显微镜扫描技术获得。具体操作方法为本领域的一般方法。实施例4.药物发现和 研究
腺病毒芯片可以用来监测一个小分子药物对所有蛋白的结合性能。进而能够检测药物的毒性。例如，检测一个很有效的候选药物，小分子或大分子药物对人体的毒性。腺病毒芯片经过加入细胞培养之后，细胞所表达的蛋白被固定在芯片上，然后加入标记好的候选药物。如果候选药物跟一个蛋白结合得很紧的话，标记就能从哪一个样点上检测到。如果一个候选药物除了跟靶标蛋白结合，还与很多其他蛋白结合的话，这个候选药物可能会有毒性。与此相反，如果一个候选药物只与靶标蛋白结合，说明它的作用很专一，有其他毒性的可能性也小。全基因组的腺病毒芯片将是一个发现新药物的重要工具。具体操作方法为本领域的一般方法。实施例5.用来调查蛋白质-蛋白质之间的相互作用
为了研究一个蛋白的所有相互作用的伙伴，该蛋白可以用荧光或其他颜料标记，然后跟腺病毒芯片转化后的蛋白芯片杂交。通过这种方式，所有与该蛋白相互作用的蛋白都可以从全基因组范围的芯片中区别出来。一旦发现所有与该蛋白有关联的其他蛋白，就会比较容易理解它的功能，尤其是对一个不知道功能的蛋白。具体操作方法为本领域的一般方法。实施例6.细胞表面受体的发现
为了研究一个药物，小分子化合物或大分子药物例如蛋白或抗体的作用机制，需要发现该药物的细胞表面受体。很多时候虽然知道一个药物很有效，但不知道是通过那一个表面受体。候选药物可以用荧光或其他颜料标记，然后与腺病毒芯片一块培养。如果该药物与基因组中一个特殊的蛋白反应的话，那一个样点就会有荧光或其他颜色。荧光或颜色可以通过高通量显微扫描技术获得。腺病毒芯片在这方面有独特的优势，因为细胞所表达的蛋白保持在细胞表面或保持一定的立体结构。标记的药物结合以后，整个芯片可以直接观察或固定后观察。具体操作方法为本领域的一般方法。实施例7.活体细胞分析
以研究发现一个候选药物对癌细胞分裂的影响为例。候选药物可以与癌细胞一块加入培养皿与腺病毒芯片培养。药物与某一个蛋白的反应可能会阻止细胞的分裂，或导致细胞形态的变化。与邻近样点比较，细胞形态的变化可以直接从显微镜下观察到。具体操作方法为本领域的一般方法。实施例8.应用腺病毒芯片进行细胞凋亡分析
要研究一个配体是通过哪一个途径引发细胞凋亡，可以把这个受体一块加入细胞和腺病毒芯片培养。因为整个芯片在加入细胞培养后，每个样点的转染的细胞是活的细胞，所以细胞形态的变化很容易在显微镜地下观察到。不同的影响细胞凋亡的药物，其它化合物与基因组范围蛋白的作用以及对细胞凋亡的影响，可以直接从显微镜下观察到。具体操作方法为本领域的一般方法。实施例9.siRNA或shRNA验证
生产一整套基因组范围的带GFP标记物的穿梭载体和腺病毒，然后制成腺病毒芯片。加入细胞培养之后，所有的样点都应该有荧光出现。如果一个siRNA或shRNA抑制(Knockdown) 一个基因，绿色荧光应该消失或减弱。对一个药物siRNA或shRNA，需要用整个基因组范围的芯片去测定它是否有特异性。在细胞与芯片共同培养的时候加入siRNA或shRNA,然后观察每个样点绿色萤光的强度。这样就可以断定一个siRNA或shRNA是否只对应该抑制的靶点起作用。具体操作方法为本领域的一般方法。实施例10.酶活性分析
腺病毒芯片用于发现基因组中对一个特殊的底物起反应的酶。底物可以用荧光或其它颜料标记，然后与细胞和腺病毒芯片一块培养。如果底物与一个特别的蛋白结合的话，那个特别的样点就会有荧光或得到该颜料的标记。有荧光的样点可以用荧光显微镜区分出来。具体操作方法为本领域的一般方法。实施例11.启动子/报告基因分析
将启动子的DNA序列与报告基因序列一起克隆到一个质粒载体中。该启动子/报告基因质粒可以一块与细胞和腺病毒芯片培养。如果人类基因组中的任何一个表达的蛋白调节或激活启动子，那个样点就会发出绿色荧光。荧光可以用显微镜观察到。具体操作方法为本领域的一般方法。实施例12.抗体特异性分析
利用腺病毒芯片来检测Her-2单克隆抗体的特异性。该抗体是一个治疗乳腺癌的抗体。为了检测它的特异性，可以用该抗体与腺病毒芯片转化 的蛋白芯片杂交。该抗体除了与靶标蛋白有反应以外，还与其他一个不相关的一个蛋白有交叉反应。一个单克隆抗体的好坏决定于该抗体是否与其他蛋白有交叉反应，利用腺病毒芯片可以有效对其特异性进行分析。具体操作方法为本领域的一般方法。实施例13.自身免疫疾病检测
将病人的血液与腺病毒转化的蛋白芯片杂交，一种或几种不同的自身免疫抗体就可以被区别出来。根据是哪一种或几种自身免疫抗体，就可以断定该病人是有什么样的疾病，因为很多疾病的标记物已经发现。最终该芯片可以作为一般人的疾病诊断应用，包括健康人的血液样品。在很多疾病还没有症状的时候，生物标记物或自身免疫抗体就产生了。具体操作方法为本领域的一般方法。实施例14.生物标记物的发现
一种疾病的生物标记物是指自身免疫抗体或蛋白只发现在一个或很多个病人的样品中，但不出现在健康人的样品中。通过用健康人的样品和很多病人的样品与芯片杂交，就可以发现哪些蛋白或基因只在病人或大部分在病人的体内表达，而不在或很少在健康人体内表达。这些蛋白可以被认为是该疾病的生物标记物，因为他们是与该疾病有关的。具体操作方法为本领域的一般方法。实施例15.本发明腺病毒芯片与普通质粒芯片比较 采用列表的方法将本发明和普通载体做对比。
权利要求
1.一种腺病毒芯片，其特征在于，是将含有人类全基因组序列腺病毒粒子点到显微玻璃芯片上制成的。
2.如权利要求1所述的腺病毒芯片，其特征在于，腺病毒芯片的制备方法如下: (1)生产高浓度腺病毒粒子:腺病毒克隆在线性化之后，转染到6孔板中进行腺病毒的包装，腺病毒形成以后，扩增1-2次，直至滴度达到IO9-1Oki粒子/毫升； (2)腺病毒芯片的生产:用芯片点样仪将高浓度的腺病毒打印到硝化纤维玻璃片上或其他的基质上。
3.如权利要求1所述的腺病毒芯片，其特征在于，腺病毒芯片的制备方法具体操作如下: (1).载体制备 一般显微玻片可以用来做载体，玻片首先浸入到25微克/毫升的硝化纤维素甲醇溶液中，然后在无菌的情况下让甲醇蒸发，干燥； (2).腺病毒的制备 主要包括腺病毒质粒载体的制备和腺病毒的包装生产: O人类的每个基因克隆首先用ORF引物扩增，利用高通量的方式克隆到穿梭载体里，再用高通量的方式重组到腺病毒骨架载体内； 2)腺病毒的包 装:携有人类基因的腺病毒在线性化之后，与转染试剂一起，加入到6孔板的孔中，培养13天，之后，刮下细胞，用2000转/分钟低速离心，加入I毫升PBS缓冲液，用液氮冻融4次，把0.5毫升的腺病毒加入到10厘米的培养皿中，培养5-10天，重复10厘米培养2-3次到腺病毒滴度达到IO9-1Oki粒子/毫升，腺病毒可以在-70度作长期保存； (3).芯片打印 用接触式点样，把制成的15 000个腺病毒人源克隆分布到384孔板中，打印针从多孔板取出样品后直接打印在芯片上； (4).覆盖细胞间的区域 腺病毒样点周围的区域用过滤的封闭剂覆盖45分钟，然后用PBS缓冲液冲洗；制成的芯片可以在-70度冰箱作长期保存。
4.如权利要求1所述腺病毒芯片，其特征在于，其腺病毒芯片可以转化成蛋白芯片:将细胞加入到腺病毒芯片上培养，当细胞在过表达之后，每个基因所表达的蛋白可以得到固定，这样腺病毒芯片就转化成蛋白芯片。
5.如权利要求4所述腺病毒芯片，其特征在于，腺病毒芯片转化成蛋白芯片的方法为:将细胞加入到腺病毒芯片上培养，当细胞在过表达之后，每个基因所表达的蛋白可以得到固定，这样腺病毒芯片就转化成蛋白芯片。
6.如权利要求4所述腺病毒芯片，其特征在于，所述蛋白芯片可用于抗体特异性分析、自身免疫疾病检测、生物标记物的发现。
7.如权利要求1所述腺病毒芯片，其特征在于，用于活体细胞分析，如细胞的生长和分化，细胞凋亡，组织特异性基因表达，细胞对小分子的毒性和敏感性分析。
8.如权利要求1所述腺病毒芯片，其特征在于，用于免疫化学分析、酶活性分析、启动子/报告基因分析。
全文摘要
本发明属于生物医学领域，涉及一种腺病毒芯片及其用途，具体涉及一种人类全基因组腺病毒芯片及其用途。本发明所述腺病毒芯片是把含有人类全长基因的腺病毒粒子点到显微玻璃芯片上制成的。包括生产高浓度腺病毒粒子和用芯片点样仪将高浓度的腺病毒打印到硝化纤维玻璃片上或其他的基质上。本发明腺病毒芯片还可以转化成蛋白芯片。本发明所述腺病毒芯片可以应用到很多不同的生物医学研究活体细胞分析(细胞的生长和分化，细胞凋亡，组织特异性基因表达，细胞对小分子的毒性和敏感性分析)、腺病毒芯片还可以用来做免疫分析、酶活性分析、启动子/报告基因分析。
文档编号G01N33/68GK103103623SQ20131006635
公开日2013年5月15日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者孙在仁 申请人:山东维真生物科技有限公司