一种植物miRNA芯片及其用途的制作方法

专利名称：：一种植物miRNA芯片及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物技术和植物学领域，更具体地，本发明涉及一种植物miRNA芯片及其用途。
背景技术：
：miRNA(microRNA)是一组不编码蛋白质的短序列单链RNA，长约22nt。miRNA基因主要单个或成簇地位于基因组的非编码区内。目前人们己发现的miRNA约为数千个，大部分功能未知。据目前的研究显示，miRNA执行一种转录后调节机制，在蛋白表达过程中扮演重要角色。raiRNA通过不完全碱基互补的方式与mRNA相应的区域结合，从而抑制蛋白质的翻译；在某些植物中，其还可以降解mRNA。通常一个基因可以被多个miRNA所调节，同时一个miRNA也可以调节多个mRNA。miRNA表达具有高度的保守性、时序性和组织特异性。研究表明miRNA参与了几乎所有的生命活动，并起着重要作用，在动物中，包括细胞发育、造血、脂肪代谢、器官生成、凋亡、细胞增殖与分化及肿瘤的发生。此外，在某些病毒中也发现有miRNA表达。在植物细胞中，转录形成的rai脂A前体首先折叠成茎环结构，然后在DCLl的作用下剪切形成成熟的miRNA。在不同的植物组织、器官和不同的发育时期，miRNA的表达谱是不同的，对miRNA表达谱的研究将对raiRNA生物功能的研究起到巨大的推动作用。尽管目前已经在生物体中发现了一些miRNA,然而这些miRNA仅占生物体中存在的miRNA中相当少的一部分，并且对于这些raiRNA多为功能未知。并且，现有对miRNA表达谱的研究多采用Northern杂交或miRNA克隆的方法，需要大量的总RNA样品，而且费时费力，研究进展缓慢。因此，本领域迫切需要进一步地分离miRNA，且更为重要的是开发合适的途径，以研究miRNA的表达谱以及它们对于生物体的调节作用。
发明内容本发明的目的在于提供一种miRNA芯片，该芯片可用于检测miRNA的表达谱或miRNA对于植物生长发育的调节方式。在本发明的第一方面，提供一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQIDNO:1-SEQIDNO:137所示的部分或全部序列。在本发明的另一优选例中，所述的寡核苷酸探针含有-互补结合区；和/或与固相载体相连的连接区。在本发明的另一优选例中，所述的连接区是可任选的，也即所述的互补结合区可与固相载体直接相连。在本发明的另一优选例中，所述的"特异性地对应于"指在严紧杂交条件下，所述的探针能够与SEQIDNO:1-SEQIDNO:137的核酸序列的杂交；更佳地，所述的探针的互补结合区的序列与SEQIDNO:1-SEQIDNO:137的核酸序列完全互补。在本发明的另一优选例中，所述的寡核苷酸探针的互补结合区是与选自SEQIDNO:1-SEQIDNO:137所示的序列互补(更优选的，为完全互补)的在本发明的另一优选例中，所述寡核苷酸探针由20-80个碱基组成。在本发明的另一优选例中，用于检测miRNA的表达谱；或用于检测miRNA对于植物生长或发育的调节方式。在本发明的第二方面，提供一种检测植物中miRNA表达谱的方法，包括步骤:(1)提供分离自植物的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；(2)将(l)的RNA与所述的芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成"寡核苷酸探针-RNA"二元复合物；和(3)检测(2)形成的二元复合物的标记物，从而确定植物中相应的miRNA的表达谱。在本发明的另一优选例中，在步骤(1)中，在设置标记物前还包括步骤-从RNA样品中富集小片段RNA。在本发明的另一优选例中，所述的小片段RNA的长度为10-100bp(更优选的为15-60bp)。在本发明的另一优选例中，所述的标记物选自荧光素或其衍生物(如FITC、Cy3、Cy5等)，地高辛(DIG)，生物素(Bio)，碱性磷酸酶(AP)，辣根过氧化物酶(HRP)。在本发明的另一优选例中，所述的标记物与所述的RNA的3'端相连接。在发明的第三方面，提供一种试剂盒，所述的试剂盒中含有所述的miRNA芯片。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1显示了水稻中花11品种的种子、叶、根、胚乳、胚中miRNA基因的表达模式；图中，比色板指示着miRNA的表达强度，所示的-2.0(蓝色)一0(黑色)一2.0(黄色)表示miRNA表达的由弱到强的变化，越靠近2.0表示表达越强。越靠近-2.0表示表达越弱。图2显示了本发明的芯片的一种杂交效果图。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次从水稻的不同发育阶段的种子中分离获得一类新的miRNA，针对这些mi脂A开发了一种miRNA芯片，该miRNA芯片可用于研究miRNA的表达谱以及miRNA对于植物生长发育中各种事件的调节作用，并且消耗样品少、操作方便高效。基于此完成了本发明。如本文所用，所述的"植物(或作物)"包括但不限于禾本科植物(如水稻)、豆科植物等。此外，所述的植物还可包括林业作物、乔木、花丼植物等。优选的，所述的植物是指任何携带本发明所提供的miRNA(其序列如SEQIDNO:l-SEQIDNO:137所示)或携带与所述的miRNA具有较高同源性(如具有80%同源性或更高)的miRNA，或其mRNA的表达可被本发明所提供的miRNA所影响的植物的总称。如本文所用，所述的"miRNA"是指一种RNA分子，被从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(一般约22个核苷酸)，然而也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。植物来源的miRNA是在植物细胞中由前体miRNA加工获得的miRNA。如本文所用，"植物miRNA表达谱"是指显示植物组织或细胞中raiRNA的表达情况的展示图谱。如本文所用，植物小RNA(smallRNA)是指植物细胞内的长度在18-26之间的非编码RNA，它们以RNA的形式发挥作用；miRNA是小RNA的一种，可从所述的小脂A中鉴定出一部分miRNA，miRNA的特征是产生于一个转录本，这个转录本折叠形成茎环结构，miRNA来自茎结构中的某一侧。如本文所用，"小片段RNA"是指从植物总脂A中分离到的长度在10—100bp的RNA分子的混合物。miRNA本发明提供了一类从植物中发现的miRNA，植物miRNA可从前体miRNA加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在60-330bp之间。通常，前体miRNA可在植物细胞内被剪切成成熟的miRNA分子。本发明人采用大规模平行信号测序系统，从水稻不同发育阶段的种子中分离、鉴定出大量新的raiRNA。具体而言，本发明人从野生型水稻中花11的种子中提取总RNA分离出18-26nt的小RNA(smallRNA),将小RNA克隆入载体后，用MPSS技术分析得到Signature序列，屏蔽掉可能为接头来源的序列，并将可信性较低的序列去除。接着，本发明人用BLAST程序(NCBI)比较所有的Signature序列和水稻基因组序列(TIGR)，把Signature序列定位到水稻染色体上，剔除在基因组上没有匹配的序列。以Rfam数据库(Sanger)为参考，去除rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等。为了鉴别剩下的序列中的miRNA，以400bp的window(窗口)在基因组上选取包含这些序列的前体序列，用RNAfold软件预测其二级结构。同时满足以下几个标准的为raiRNA:①miRNA定位在前体结构的某一臂上(5'或3，)，并且前体结构自由能最低；②以miRNA为中心的25nt中，错配数不得大于7;③前体结构的茎上中没有大的环状结构。这些被鉴定出来的miRNA的序列如SEQIDNO:1-SEQIDNO:137所示；所述的miRNA对应的前体miRNA的序列如SEQIDNO:138-SEQIDNO:274所示。miRNA芯片由于检测单一的miRNA在植物中的表达情况效率很低，因此，本发明人根据所述的miRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成"寡核苷酸阵列"。所述的"寡核苷酸阵列"是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。本发明所述的miRNA芯片，包括固相载体和有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于SEQIDNO:1-SEQIDNO:137所示的序列。作为本发明的优选方式，所述的探针包含互补结合区，所述的互补结合区的序列与SEQIDNO:1-SEQIDNO:137的核酸序列互补(更优选的，为完全互补)。作为本发明的优选方式，所述的探针上还含有连接区，所述的连接区用于使探针稳定地固定在固相载体上，所述的连接区可以位于互补结合区的两端，或者也可仅位于互补决定区的一端。当然，在允许的情况下，也可选择将互补决定区直接与固相载体相连接的方式。作为本发明的更优选方式，所述的连接区还具有调节GC比例的功能，用于调节探针的GC含量，从而使得探针的GC比例为20-80%，更优选的GC比例为40-60%。因此，本发明的探针由20-80个(更特别的为25-60个)连续碱基组成。为了增强检测信号的强度，提高检测结果的准确率，探针上所述的互补结合区最好位于所在探针的中部。所述探针还可以在其5'端包含糖基修饰。所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基、异硫晴酸基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。本发明的miRNA芯片的制备也可采用其它的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploringthemetabolicandgeneticcontrolofgeneexpressiononagenomicscale.Science,1997;278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京化学工业出版社，2000,1-130。作为一个方面，本发明提供了一种通过miRNA芯片检测植物中miRNA表达谱的方法，包括步骤(1)提供分离自植物的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；(2)将(l)的RNA与所述的芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成"寡核苷酸探针-RNA"二元复合物；(3)检测(2)形成的二元复合物的标记物，从而确定植物中相应的miRNA的表达谱。从植物组织中提取RNA的方法是本领域技术人员熟知的方法。比如采用Trizol法。更优选的，在步骤(l)中，在从植物组织中分离出RNA样品后，对RNA样品进行适当处理，以富集具有一定长度的RNA，所述长度一般在10-100之间(小片段RNA)。在经过上述处理后，利用这些小片段RNA进行后续的杂交，这样可提高芯片捕获miRNA的准确性。本领域人员可方便地分离出具有一定片段长度的RNA，比如可采用凝胶电泳法来分离。对RNA进行标记也是本领域技术人员熟知的方法，其可通过在杂交时加入与RNA特异性结合的标记物的方法实现，所述标记物比如是标记基团。所述的标记基团包括但不限于地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC等)、其它荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术，也可以参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔主编，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年；马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京化学工业出版社，2000,1-130。将上述的RNA与miRNA芯片进行杂交时，可以先将miRNA芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。本发明所述的RNA与miRNA芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。然后根据标记信号在miRNA芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。miRNA芯片的用途本发明的miRNA可以用于检测miRNA的表达谱；或用于检测miRNA对于植物生长或发育的调节方式。通过本发明的miRNA芯片，可分析这些miRNA基因的表达模式，可了解植物中相应的基因对胁迫等(比如干旱，高盐等)的调节情况；可设计相应的策略，调节和修饰靶基因，来提高对胁迫等环境的适应能力，或者形成具有较好农艺性状的基因修饰作物。本发明的miRNA芯片可应用于作物育种的分子筛选。根据miRNA芯片的杂交结果，有针对性地筛选具有某种表达模式的植株，并选育成稳定品系。提高育种的选择效率。检测试剂盒本发明还提供一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的芯片。所述的试剂盒可用于检测miRNA的表达谱；或用于检测miRNA对于植物生长或发育的调节方式。更优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。所述的芯片图像分析软件比如BaiO公司的Bai0ArrayDoctor2.0，MediaCybernetics公司的Arraypro4.0，由哈佛大学生物统计系ChengLi、WingWong等联合开发的dChip(DNA-ChipAnalyzer),由TIGR开发的微阵列分析软件包MultiExperimentViewer(MeVv3.1)。本发明的主要优点在于将从植物中分离获得的一类新miRNA制备成芯片，从而为研究miRNA的表达谱以及miRNA对于植物的调节作用提供了便捷的途径。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1miRNA的获得1.RNA抽提选用粳稻品种中花11号，在人工气候室(光周期为28"C光照12小时与22匸黑暗12小时)中栽培，三个月完成整个生命周期。播种后60天开花，分别在开花后3天、6天、9天、12天采收水稻种子。种子材料液氮中研磨后，用TRIZOL试剂盒，按照TRIZOL试剂盒自带的说明书提取总RNA。2.smallRNA序列的获得和筛选用20%PAGE胶回收1826nt的smallRNA，采用常规方法把smallRNA克隆入测序载体TagvectorpMBSI(Solexa公司)后，用MPSS技术测序得到Signature序列，屏蔽掉可能为接头来源的序列部分，所用方法是将全长的Signature序列和测序载体序列比较，序列3'端和载体完全匹配的认为是载体序列，并将可信性较低(如测序信号很低等)的序列过滤掉。3.miRNA的鉴定用BLAST程序(NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov)把smallRNASignature序列定位到水稻染色体上(TIGR注释信息，www.tigr.org)，剔除在基因组上没有匹配的序列。以Rfam数据库(TIGR注释信息，www.tigr.org)为参考，去除rRNA、tRNA、snRNA禾口snoRNA等。在剩下的smallRNA序列中，为了鉴别其中的miRNA，本发明人以400bp的窗口(window)在基因组上选取包含所述smallRNA的前体序列，用RNAfold软件(www.tbi.univie.ac.at)预测其二级结构。同时满足以下几个标准的smallRNA被鉴定为miRNA:①miRNA定位在前体结构的某一臂上(5'或3')，并且前体结构自由能最低；②以raiRNA为中心的25nt中，错配数不得大于7;③前体结构的茎上没有大的环状结构。4.结果通过前述筛选，获得137条新的成熟miRNA，如SEQIDNO:1-SEQIDNO:137(表1)所f"这些miRNA的fH本miRNA的序歹ij女口SEQIDNO:138—SEQIDNO:274(表2)所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>AACAAAUCUGUCACAUUCAUGUCAAGGUUGGU國UUCGGGAUGGAGGGAGUA239240GCCCUUAUAAACAACCGCCAGCAAAAAUCAUUUUUUCGCUGGCGGUAGUMAGGAG241242(JL!UGUAGGAAGUUUAAUGG243244245GCUAUUUAAAAUAUG陽AAUCAUUAAACCU246CUCGC247248249CAUG250GAG251UACCAUAAGAUAAUGCCAUGAAUUUGUCAAGCGUUCAAACCCACU252UUCACCCGUGAGA253眼U254UAGUAUAUAUAGUGAACACCGAUAUGCGUCAUCAUCAAGUGAUUUAAU255GUUUGAUGCAGGUGUCAUCUCCCCUGAACAUAGGA256AGUACUAGAAUGUGUCACAUCCAGUACUAGG腦G,UUUAUAGGACGGAGGGA257258CCAAAAGAUAAUGCUGUGAAUUUGCAAAGCGCU259260GCCUUUUGGUGUAUUGUCUCUACAAACUAA261UAAAUUUACGAUUUCGUGUAAC262263264AAAGGAGCCCUU<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表2中各序列的特点是可以形成茎环结构，表1中各成熟的miRNA来自表2中相应的茎环结构的茎的其中一侧。并且，的各miRNA是——对应的，对应关系如下miRNASEQIDNO:1—SEQIDNO:2—SEQIDNO:3—表2中的rai西A的前体与表1中miRNA前体SEQIDNOSEQIDNOSEQIDNO138139140SEQIDNO:136SEQIDNO:137SEQIDNO:273;SEQIDNO:274。实施例2miRNA芯片的制备1.探针的设计与合成将表l提供的miRNA序列(SEQIDNO:1_SEQIDNO:137)转换成反向互补序列，根据产生序列的GC比等特征在序列两端加上10-20nt的连接序列；核心序列不同，连接序列也不同。连接序列可以是随机的，但连接序列和核心序列形成的探针满足以下条件1)探针序列中，同一种核苷酸(A、C、G、T)的数量不超过序列总数的50y。。2)任何连续的A、T或C、G的数量不能超过序列总数的25y。。3)G、(:含量占序列总数的40%-60%。4)探针序列不能自杂交，即探针序列中互补片段的长度不能超过探针长度的30%。为使合成的探针稳定地结合在玻片上，采用常规的方法在合成后探针的5'端进行糖基修饰。2.miRNA芯片的点制先将玻片的表面进行烷基化修饰，以提高结合能力。采用常规的芯片点样方法进行点样，为了检测杂交试验的可重复性，每个探针在玻片上点3-6个杂交点。实施例3miRNA芯片的应用1.miRNA芯片的杂交1)Trizol—步法提取组织的总RNA，通过异丙醇沉淀法浓縮RNA，用分光光度计定量，甲醛变性凝胶电泳质检总RNA的质量。取50-100(ig总RNA，用Ambion，smiRNAIsolationKit(Cat#.1560)分离长度约在10-100bp的小片段RNA。利用常规标记方法(T4RNA连接酶标记法)进行标记，标记底物为cy3，然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于与芯片杂交。2)将RNA溶于16nL杂交液中(15%甲酰胺；0.2%SDS;3xSSC;50XDenhardt's)，于42'C杂交过夜。杂交结束后，先在42°(3左右含0.2%SDS，2xSSC的液体中洗4min，而后在0.2xSSC液体中室温洗4min。玻片甩干后即可用于扫描。图2显示了扫描后的杂交结果的局部。2.杂交结果的分析采用常规的芯片信号读取仪器，将扫描的图像信号转换为数字信号，并进行信号校正，去除坏点和弱点的信号值。用相关软件分析，miRNA基因表达的差异情况。所述的芯片分析软件比如由哈佛大学生物统计系ChengLi、WingWong等联合开发的dChip(DNA-ChipAnalyzer),和TIGR推出的微阵列分析软件包MultiExperimentViewer(MeVv3.1)。分析表达差异情况的方法描述如下根据不同组织将芯片数据分组，每组之间的数据用認OVA检验的方法，统计分析不同组间的差异情况。P值设定为小于O.05。实施例4水稻中花ll的多种组织中的miRNA表达谱1.miRNA表达数据的获得准备水稻中花ll的多种组织(包括种子、叶、根、胚乳、胚)，采用常规方法分别分离小片段RNA，采用实施例2制备的芯片，根据实施例3中的方法进行芯片杂交，获得每个组织中的所有miRNA的表达结果。各种组织需要生物重复和技术重复。2.miRNA表达谱的编制用相关软件，将所有数据归一化处理。用整张芯片所有信号中位数相等的方法规一化。计算相同组织所有miRNA信号的平均值。用TIGR的MeVv3.l显示所有miRNA在不同组织中的表达情况，编制成miRNA表达谱。结果如图l所示。由表达图谱结果显示，大部分miRNA的表达具有组织特异性，集中在一到两个组织中表达，提示miRNA在特异的组织行使功能。另外，大部分miRNA在胚乳中表达都很低，和基因mRNA的表达模式相似。因此可以通过影响miRNA的表达模式，来很大程度上改变目标基因的表达模式，而起到改变作物农艺性状等的目的。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1.一种miRNA芯片，其特征在于，所述的miRNA芯片包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQIDNO1-SEQIDNO137所示的部分或全部序列。2.如权利要求1所述的miRNA芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探针含有-互补结合区；和/或与固相载体相连的连接区。3.如权利要求2所述的miRNA芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探针的互补结合区是与选自SEQIDNO:1-SEQIDNO:137所示的序列互补的序列。4.如权利要求1所述的miRNA芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探针由20-80个碱基组成。5.权利要求l所述的raiRNA芯片的用途，其特征在于，用于检测miRNA的表达谱；或检测miRNA对于植物生长或发育的调节方式。6.—种检测植物中miRNA表达谱的方法，其特征在于，包括步骤(1)提供分离自植物的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；(2)将(l)的RNA与权利要求1所述的芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成"寡核苷酸探针-RNA"二元复合物；和(3)检测(2)形成的二元复合物的标记物，从而确定植物中相应的miRNA的表达谱。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，在设置标记物前还包括步骤从RNA样品中富集小片段RNA。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的小片段RNA的长度为10-100bp。9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的标记物选自荧光素或其衍生物，地高辛，生物素，碱性磷酸酶，或辣根过氧化物酶。10.—种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求l所述的miRNA心片。全文摘要本发明公开了一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地针对SEQIDNO1-SEQIDNO137所示的序列。本发明还公开了含有所述芯片的试剂盒。本发明还公开了利用所述的miRNA芯片检测植物中miRNA表达谱的方法。本发明将从植物中分离获得的一类新miRNA制备成芯片，从而为研究miRNA的表达谱以及miRNA对于植物的调节作用提供了便捷的途径。文档编号C12Q1/68GK101225433SQ20071003657公开日2008年7月23日申请日期2007年1月18日优先权日2007年1月18日发明者薛红卫,薛良交申请人:中国科学院上海生命科学研究院